本发明涉及组织器官再生与修复领域，尤其涉及一种肌腱修复材料的制备方法。
背景技术：
肌腱是肌肉的延续，主要功能是将肌肉的收缩力传递到骨从而带动关节活动，因此常会承受高强度的机械负荷，而这样的机械负荷常会导致肌腱损伤，但肌腱自身不具备完全再生能力，损伤的肌腱愈合较慢且容易形成瘢痕组织，进而使得肌腱的组织结构和力学性能变差。若不予以及时修复会导致肌腱病的发生，同时可能伴有血管损伤、骨与关节损伤撕裂等，严重者可能给会留下严重的后遗症，对身体以后的健康造成很大的威胁，因而肌腱损伤成为骨科和运动医学中公认的治疗难题。
目前，针对肌腱损伤的常规手术处理方式为直接缝合、自体肌腱移植和异体肌腱移植，但直接缝合容易导致肌腱和骨之间的纤维软骨层退化，加速了瘢痕组织的增生，而瘢痕组织限制了肌腱在体内的双向滑动；自体肌腱移植存在自体供区来源有限，供区功能和力学稳定性产生损失，同时增加了新的创伤制约，应用受限；异体肌腱取材方便，来源广泛，但存在不同程度的免疫排斥反应，且修复后的组织和功能特性与正常肌腱无法媲美，也伴随有肌腱粘连、易二次损伤等缺陷。所以，寻找肌腱再生修复新手段具有重要的临床意义。
组织工程化肌腱的研究为修复肌腱损伤开辟了一条新途径，但仍面临着两方面挑战，一是如何制备和筛选具有特殊力学强度和性能的修复材料问题，二是种子细胞的来源及如何在体外快速增殖问题。目前，一种新的趋势是采用天然的脱细胞基质材料作为组织修复材料，脱细胞基质具有最接近人体的网架结构、良好的生物相容性及生物力学性能，其表面具备细胞膜受体识别位点，结合特异性的活性因子后能够促进细胞的粘附生长从而发挥生理功能，材料本身所保留的成分具有引导或诱导组织再生的能力，因此是很有实用意义的修复材料，可望在肌腱修复中取得更好的效果，为肌腱损伤的治愈带来了希望，而受体自身的肌腱细胞是肌腱组织的基本功能单位，是体外构建组织工程肌腱的理想种子细胞来源。所以如何获得大规模具有再生活力的自身肌腱细胞并将其装载在理想修复材料上是当前组织工程化肌腱研究面临的最为关键的限制性因素。
技术实现要素：
本发明针对现有的肌腱损伤修复难题提供了一种肌腱修复材料的制备方法，该修复材料取材于跟腱组织，制备工艺条件温和，消除了异种组织的免疫原性的同时保留了跟腱组织原有的空间结构、组织和力学性能，同时植入了受体自身肌腱细胞和外源性细胞因子，三者结合后充分发挥了组织工程化肌腱的再生作用，在保持肌腱形态连续性的同时促进了其功能的恢复，具有良好的生物相容性，临床实用价值较高。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
（1）制备脱细胞跟腱：无菌条件下取新鲜的动物跟腱，用手术剪除去跟腱上的脂肪碎片和其他杂质，用pbs缓冲液漂洗血迹等污垢，再用过氧乙酸溶液进行浸泡消毒处理，将处理后的跟腱组织进行冷冻后，再用匀浆机将其粉粹，依次用含胰蛋白酶、edta、tbp、核酸酶的pbs缓冲溶液对粉碎后的跟腱材料进行萃取，脱除细胞成分，调节ph至人体体液ph值，并采用pbs缓冲液清洗，经上述处理后的跟腱材料置于pbs缓冲液中进行4℃保存。
（2）制备肌腱种子细胞：无菌条件下收集患者自身在清创手术中被清除的残碎肌腱组织，剥离外膜后用hanks液漂洗血迹等污垢，再用过氧乙酸溶液进行浸泡消毒处理，用手术剪将其剪碎成5-6mm3大小的组织块，用胰蛋白酶及胶原酶37℃消化处理，过滤后离心，将组织块均匀悬置于含血小板血浆的dmem/f12培养液中进行低氧培养，定期更换培养液，当融合成单层细胞后进行传代，将原代细胞消化后置换新的培养液，待80%细胞融合后进行细胞计数，以1×106/ml的细胞浓度接种于培养瓶中进行低氧传代培养。
（3）体外构建组织工程肌腱修复材料：将步骤（1）制备的去细胞异种跟腱材料充分浸入到步骤（2）培养扩增的自体肌腱细胞悬液中，置于37℃培养箱中进行低氧培养、融合，然后在含有外源性生长因子的诱导液中进行诱导培养，定期更换一次复合诱导液，经过数天完成诱导过程，即为可用于移植修复肌腱损伤的肌腱修复材料。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
进一步，步骤（1）所述动物指脊椎动物，鉴于低排斥优选的是哺乳动物，鉴于可用性更优选的是来自哺乳动物的家畜或人，鉴于稳定的可用性，来自猪和人的肌腱组织是优选的。
更进一步，步骤（1）所述的冷冻温度优选为-80℃至-10℃，更优选-60℃至-20℃，最优选-45℃至-30℃，冷冻时间优选为6-10小时。
进一步，步骤（1）所述的胰蛋白酶的浓度为0.1-0.2wt%，萃取时间优选为1-2h。
更进一步，步骤（1）所述的edta的浓度为0.1-0.2wt%，萃取时间优选为1-2h。
更进一步，步骤（1）所述的tbp的浓度为1-2wt%，萃取时间优选为3-4h。
更进一步，步骤（1）所述的核酸酶包括dnasei和rnasei，其浓度均为100-200µg/ml，处理时间为1-2h。
进一步，步骤（2）所述的血小板血浆的浓度为0.5×106-1×106plt/µl。
更近一步，步骤（2）所述的胶原酶的浓度为0.08-0.1%，消化处理的时间为1-1.5h。
更近一步，步骤（2）所述的胰蛋白酶浓度为0.2-0.25%，消化处理的时间为1-1.5h。
更进一步，步骤（1）或步骤（2）所述消毒用过氧乙酸的质量浓度为0.1%-0.6%，浸泡处理的时间为0.5-2h。
进一步，步骤（3）所述的体外构建组织工程肌腱修复材料时所用的自体肌腱细胞的浓度为1×105-2×105/ml。
更进一步，步骤（3）所述的外源性生长因子包括类胰岛素生长因子（igf）、转化生长因子-β（tgf-β）、血小板源性生长因子（pdgf）、表皮生长因子（egf）、碱性成纤维细胞生长因子（bfgf）、血管内皮生长因子（vegf）其中的任意两种或者多种组合，总生长因子浓度为0.02-0.2ug/ml。
更进一步，步骤（2）或步骤（3）所述的低氧指o2浓度为2-10%。
具体实施方式
下面将结合实施例中对本发明的技术方案作出进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1以猪跟腱为材料制备肌腱修复材料
（1）无菌条件下取新鲜宰杀的猪跟腱，用手术剪除去跟腱上的脂肪碎片和其他杂质，用pbs缓冲液漂洗血迹等污垢，再用0.5%过氧乙酸溶液进行浸泡消毒处理1h，将处理后的跟腱组织在-40℃进行冷冻8h后，再用匀浆机将其粉粹，将粉碎后的猪跟腱颗粒在0.15wt%胰蛋白酶的pbs缓冲溶液中萃取1.5h，在0.15%edta的pbs缓冲溶液中萃取1.5h，然后在1.5wt%tbp的pbs缓冲溶液中进行脱细胞处理3.5h，脱除细胞成分，之后用含150μg/ml核糖核酸酶和150μg/ml脱氧核糖核酸酶的pbs缓冲溶液处理1.5h，脱除残留核酸，调节ph至人体体液ph值，并采用pbs缓冲液清洗，经上述处理后的跟腱材料置于pbs缓冲液中进行4℃保存。
（2）无菌条件下收集患者自身在清创手术中被清除的残碎肌腱组织，剥离外膜后用hanks液漂洗血迹等污垢，再用0.5%过氧乙酸溶液进行浸泡消毒处理1h，用手术剪将其剪碎成5-6mm3大小的组织块，用0.2%胰蛋白酶及0.1%胶原酶37℃消化处理1h，过滤后离心，将组织块均匀悬置于含7.5×105plt/µl血小板血浆的dmem/f12培养液中进行低氧（o2浓度为5%）培养，每周更换3次培养液，当融合成单层细胞后进行传代，将原代细胞消化后置换新的培养液，待80%细胞融合后进行细胞计数，以1×106/ml的细胞浓度接种于培养瓶中进行低氧传代培养。
（3）将步骤（1）制备的去细胞异种跟腱材料充分浸入到步骤（2）培养扩增的自体肌腱细胞悬液中，放置于37℃培养箱中进行低氧（o2浓度为5%）培养、融合，然后在含有0.01ug/ml的类胰岛素生长因子（igf）、0.01ug/ml的转化生长因子-β（tgf-β）、0.01ug/ml的血小板源性生长因子（pdgf）、0.01ug/ml的表皮生长因子（egf）、0.01ug/ml的碱性成纤维细胞生长因子（bfgf）、0.01ug/ml的血管内皮生长因子（vegf）的诱导液中进行诱导培养，每48h更换一次复合诱导液，经过数天完成诱导过程，即为可用于移植修复肌腱损伤的肌腱修复材料。
实施例2以人跟腱为材料制备肌腱修复材料
（1）根据相关程序和许可，依法摘取捐献者的跟腱，无菌条件下用手术剪除去跟腱上的脂肪碎片和其他杂质，用pbs缓冲液漂洗血迹等污垢，再用0.1%过氧乙酸溶液进行浸泡消毒处理2h，将处理后的跟腱组织在-45℃进行冷冻6h后，再用匀浆机将其粉粹，将粉碎后的猪跟腱颗粒在0.1wt%胰蛋白酶的pbs缓冲溶液中萃取2h，在0.1%edta的pbs缓冲溶液中萃取2h，然后在1wt%tbp的pbs缓冲溶液中进行脱细胞处理4h，脱除细胞成分，之后用含100μg/ml核糖核酸酶和100μg/ml脱氧核糖核酸酶的pbs缓冲溶液处理2h，脱除残留核酸，调节ph至人体体液ph值，并采用pbs缓冲液清洗，经上述处理后的跟腱材料置于pbs缓冲液中进行4℃保存。
（2）无菌条件下收集患者自身在清创手术中被清除的残碎肌腱组织，剥离外膜后用hanks液漂洗血迹等污垢，再用0.1%过氧乙酸溶液进行浸泡消毒处理1h，用手术剪将其剪碎成5-6mm3大小的组织块，用0.25%胰蛋白酶及0.08%胶原酶37℃消化处理1.5h，过滤后离心，将组织块均匀悬置于含1×106plt/µl血小板血浆的dmem/f12培养液中进行低氧（o2浓度为2%）培养，每周更换3次培养液，当融合成单层细胞后进行传代，将原代细胞消化后置换新的培养液，待80%细胞融合后进行细胞计数，以1×106/ml的细胞浓度接种于培养瓶中进行低氧传代培养。
（3）将步骤（1）制备的去细胞异种跟腱材料充分浸入到步骤（2）培养扩增的自体肌腱细胞悬液中，放置于37℃培养箱中进行低氧（o2浓度为2%）培养、融合，然后在含有0.02ug/ml的血小板源性生长因子（pdgf）、0.02ug/ml的转化生长因子-β（tgf-β）和0.02ug/ml的血管内皮生长因子（vegf）的诱导液中进行诱导培养，每48h更换一次复合诱导液，经过数天完成诱导过程，即为可用于移植修复肌腱损伤的肌腱修复材料。
实施例3以牛跟腱为材料制备肌腱修复材料
（1）无菌条件下取新鲜宰杀的牛跟腱，用手术剪除去跟腱上的脂肪碎片和其他杂质，用pbs缓冲液漂洗血迹等污垢，再用0.6%过氧乙酸溶液进行浸泡消毒处理0.5h，将处理后的跟腱组织在-30℃进行冷冻10h后，再用匀浆机将其粉粹，将粉碎后的猪跟腱颗粒在0.2wt%胰蛋白酶的pbs缓冲溶液中萃取1h，在0.2%edta的pbs缓冲溶液中萃取1h，然后在2wt%tbp的pbs缓冲溶液中进行脱细胞处理3h，脱除细胞成分，之后用含200μg/ml核糖核酸酶和200μg/ml脱氧核糖核酸酶的pbs缓冲溶液处理1h，脱除残留核酸，调节ph至人体体液ph值，并采用pbs缓冲液清洗，经上述处理后的跟腱材料置于pbs缓冲液中进行4℃保存。
（2）无菌条件下收集患者自身在清创手术中被清除的残碎肌腱组织，剥离外膜后用hanks液漂洗血迹等污垢，再用0.6%过氧乙酸溶液进行浸泡消毒处理0.5h，用手术剪将其剪碎成5-6mm3大小的组织块，用0.25%胰蛋白酶及0.1%胶原酶37℃消化处理1.5h，过滤后离心，将组织块均匀悬置于含5×105plt/µl血小板血浆的dmem/f12培养液中进行低氧（o2浓度为10%）培养，每周更换3次培养液，当融合成单层细胞后进行传代，将原代细胞消化后置换新的培养液，待80%细胞融合后进行细胞计数，以1×106/ml的细胞浓度接种于培养瓶中进行低氧传代培养。
（3）将步骤（1）制备的去细胞异种跟腱材料充分浸入到步骤（2）培养扩增的自体肌腱细胞悬液中，放置于37℃培养箱中进行低氧（o2浓度为10%）培养、融合，然后在含有0.1ug/ml的类胰岛素生长因子（igf）、0.1ug/ml的碱性成纤维细胞生长因子（bfgf）的诱导液中进行诱导培养，每48h更换一次复合诱导液，经过数天完成诱导过程，即为可用于移植修复肌腱损伤的肌腱修复材料。
实施例4以山羊跟腱为材料制备肌腱修复材料
（1）无菌条件下取新鲜宰杀的山羊跟腱，用手术剪除去跟腱上的脂肪碎片和其他杂质，用pbs缓冲液漂洗血迹等污垢，再用0.3%过氧乙酸溶液进行浸泡消毒处理1.5h，将处理后的跟腱组织在-35℃进行冷冻9h后，再用匀浆机将其粉粹，将粉碎后的猪跟腱颗粒在0.2wt%胰蛋白酶的pbs缓冲溶液中萃取1h，在0.1%edta的pbs缓冲溶液中萃取2h，然后在1.5wt%tbp的pbs缓冲溶液中进行脱细胞处理4h，脱除细胞成分，之后用含150μg/ml核糖核酸酶和150μg/ml脱氧核糖核酸酶的pbs缓冲溶液处理2h，脱除残留核酸，调节ph至人体体液ph值，并采用pbs缓冲液清洗，经上述处理后的跟腱材料置于pbs缓冲液中进行4℃保存。
（2）无菌条件下收集患者自身在清创手术中被清除的残碎肌腱组织，剥离外膜后用hanks液漂洗血迹等污垢，再用0.3%过氧乙酸溶液进行浸泡消毒处理1.5h，用手术剪将其剪碎成5-6mm3大小的组织块，用0.2%胰蛋白酶及0.08%胶原酶37℃消化处理1h，过滤后离心，将组织块均匀悬置于含6×105plt/µll血小板血浆的dmem/f12培养液中进行低氧（o2浓度为8%）培养，每周更换3次培养液，当融合成单层细胞后进行传代，将原代细胞消化后置换新的培养液，待80%细胞融合后进行细胞计数，以1×106/ml的细胞浓度接种于培养瓶中进行低氧传代培养。
（3）将步骤（1）制备的去细胞异种跟腱材料充分浸入到步骤（2）培养扩增的自体肌腱细胞悬液中，放置于37℃培养箱中进行低氧（o2浓度为10%）培养、融合，然后在含有0.03ug/ml的类胰岛素生长因子（igf）、0.03ug/ml的表皮生长因子（egf）、0.03ug/ml的碱性成纤维细胞生长因子（bfgf）、0.03ug/ml的血管内皮生长因子（vegf）的诱导液中进行诱导培养，每48h更换一次复合诱导液，经过数天完成诱导过程，即为可用于移植修复肌腱损伤的肌腱修复材料。