一种人造红细胞马达及其制备方法与流程

本发明涉及医学生物材料技术领域，具体涉及一种人造红细胞马达及其制备方法。

背景技术：

早在1966年好莱坞科幻电影《奇异的旅行》中，人们就设想将宏观物体缩小到微小尺度，并将这些缩小了的物体注入人体体内，执行健康检查、疾病治疗、器官修复等各项复杂任务。半个世纪以来，随着微纳米科学的不断发展，这些设想已经逐渐成为现实。微纳米马达是指能够将化学能、声能、光能等能量转化为机械运动并可完成复杂任务的微纳米系统。近年来，微纳米马达已成为微纳米科学及其相关领域的研究热点。其中，2016年的诺贝尔化学奖更是授予在分子马达研究领域具有突出贡献的三位科学家。现阶段，微纳米马达的驱动方式主要包括气泡驱动、光驱动、磁场驱动以及超声驱动。其中，气泡驱动马达多以过氧化氢为燃料。由于过氧化氢在人体内的含量较低、且对人体具有一定的毒副作用，因此气泡驱动马达的生物实用性较差。另外，目前大多数微纳米马达虽具有一定的运动能力但其靶向识别能力较差，不利于实现特定部位的高效靶向运输。

鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践提出了本发明。

技术实现要素：

为解决上述技术缺陷，本发明采用的技术方案在于，提供一种人造红细胞马达，其包括天然血红蛋白形成的红细胞状骨架、位于所述骨架内部的磁性纳米颗粒和表面修饰的细胞膜。

较佳的，所述磁性微纳米颗粒为四氧化三铁颗粒，且所述磁性微纳米颗粒的粒径为5nm-500nm。

较佳的，所述天然血红蛋白包括猪源血红蛋白、马源血红蛋白或牛源血红蛋白中的一种。

较佳的，所述细胞膜包括红细胞膜、白细胞膜或血小板膜中的一种。

较佳的，制备一种人造红细胞马达的方法，其包括以下步骤：

步骤一、制备所述磁性微纳米颗粒；

步骤二、通过化学共沉淀法，合成内含有步骤一所述的磁性微纳米颗粒和天然血红蛋白的红细胞状内核；

步骤三、以步骤二所述的红细胞状内核为模板，利用细胞膜融合技术将天然细胞膜修饰到所述模板的表面上，获得人造红细胞马达骨架；

步骤四、利用溶剂溶解法去除步骤三得到的所述人造红细胞马达骨架中的内核，最终得到人造红细胞马达。

较佳的，步骤二中所述内核为氢氧化钙颗粒，且所述内核的粒径为2μm-100μm。

较佳的，步骤四中所述溶剂为浓度为0.01-0.1mol/l、ph为5.0-7.0的磷酸盐缓冲液，浓度为0.005-0.05mol/l的稀盐酸溶液或ph值为7.0、浓度为0.1-1mol/l的乙二胺四乙酸二钠盐溶液中的一种。

较佳的，步骤四中所述红细胞马达的直径为2μm-100μm，厚度为500nm-5μm。

较佳的，制备一种人造红细胞马达的方法，其包括以下步骤：

步骤一、制备所述磁性微纳米颗粒：a、将0.002-0.02mol的氯化亚铁和0.004-0.04mol的氯化铁按1:2的重量比例溶解到100-1000ml的去离子水中，氮气保护下加热到70℃，搅拌的同时加入40ml氨水；b、继续反应1小时后停止加热，装有上述反应液体的烧瓶置于磁铁上，静置30min，待形成的四氧化三铁颗粒完全沉积到所述烧瓶的底部后，去除上层液体；c、利用丙酮清洗所述四氧化三铁颗粒3-4次后，向所述烧瓶中加入25ml不含氧气的去离子水，得到四氧化三铁颗粒悬浮液；

步骤二、合成红细胞状氢氧化钙颗粒：a、将100-1000mg的天然血红蛋白、0.5-5g的硫酸葡聚糖分散到100ml浓度为0.05-0.5mol/l的cacl2溶液中,得到混合溶液a；b、向20ml浓度为0.5-5mol/l的氢氧化钠溶液中添加步骤一所述的磁性四氧化三铁颗粒悬浮液,得到混合溶液b；c、将所述混合溶液a肯所述混合溶液b迅速混合后超声10秒钟；d、静置20min后离心收集，即得到含有所述磁性四氧化三铁颗粒和所述天然血红蛋白的红细胞状氢氧化钙颗粒；

步骤三、制备人造血红蛋白马达骨架：a、充分利用血液内不同细胞密度不同的特性，使用ficoll密度梯度离心法，以4500rpm/min的速度离心人体血液，分离、收集细胞，利用低渗缓冲液4℃下低渗处理细胞24小时，以充分去除细胞内的内容物；b、使用迷你挤压器，反复挤压细胞穿过孔径为200nm的聚氨酯薄膜21次，制备粒径为200nm的细胞膜纳米囊泡；c、以步骤二中所述含有磁性四氧化三铁颗粒和天然血红蛋白的红细胞状氢氧化钙颗粒为内核，内核与b中所述的细胞膜纳米囊泡充分混合，基于细胞膜融合技术，利用超声仪在59khz频率下超声融合30min，在所述内核表面融合细胞膜，完成所述人造血红蛋白马达骨架的制备。

步骤四、溶解内核：将步骤三所述的人造血红蛋白马达骨架加入到浓度为0.01-0.1mol/l、ph范围为5.0-7.0的磷酸盐缓冲液，浓度为0.005-0.05mol/l的稀盐酸溶液或ph值为7.0、浓度为0.1-1mol/l的乙二胺四乙酸二钠盐溶液中，30min后离心分离，弃去上清液，所得沉淀用ph7.4的磷酸盐缓冲液清洗三次，最终得到所述人造红细胞马达。

与现有技术比较，本发明的有益效果在于：本发明可重复性强，制备过程简单，且利用天然细胞的细胞膜表面修饰人造马达，使人造马达具有类细胞的生物性能，稳定性好，且具有类红细胞的双凹圆盘结构能够在外源超声场驱动下，沿声压梯度快速运动。同时，人造红细胞马达还可以通过表面修饰的天然细胞膜特异性识别癌细胞等细胞，或通过施加外源磁场，实现人造红细胞马达运动方向的靶向运动，在氧气靶向运输、药物特异性携载、毒素清除、肿瘤治疗等生物医学领域具有广泛的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明各实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1是本发明实施例2中人造红细胞马达的制备步骤3和步骤4的示意图；

图2是本发明实施例2中人造红细胞马达游动的原理图；

图3是本发明实施例3制备的人造血红蛋白马达的激光共聚焦显微镜照片；

图4是本发明实施例3制备的人造血红蛋白马达的超声驱动下运动的光学显微镜照片；

图5是本发明实施例3制备的人造血红蛋白马达的超声和磁场共同作用下靶向运动的光学显微镜照片。

具体实施方式

以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。

实施例1

本实施例提供了一种人造红细胞马达，直径为2μm-100μm，厚度为500nm-5μm，其包括天然血红蛋白形成的红细胞状骨架、位于所述骨架内部的磁性纳米颗粒和表面修饰的细胞膜，其中所述磁性微纳米颗粒为粒径为5nm-500nm的四氧化三铁颗粒，所述天然血红蛋白包括猪源血红蛋白、马源血红蛋白或牛源血红蛋白中的一种，所述细胞膜包括红细胞膜、白细胞膜或血小板膜中的一种。

其中血红蛋白具有氧气携载、释放能力，不但是红细胞的主要构成成分，还被广泛应用于人造氧气运输载体中，红细胞具有血液长循环能力，白细胞具有免疫清除能力，血小板具有血栓和出血部位识别能力，而细胞能够通过细胞膜表面的膜蛋白质、多糖等组成成分相互识别，利用天然细胞的细胞膜表面修饰人造马达，使人造马达具有类细胞的生物性能，稳定性好，能够在外源超声场驱动下，沿声压梯度快速运动。同时，人造红细胞马达还可以通过表面修饰的天然细胞膜特异性识别癌细胞等细胞，或通过施加外源磁场，实现人造红细胞马达运动方向的靶向运动，在氧气靶向运输、药物特异性携载、毒素清除、肿瘤治疗等生物医学领域具有广泛的应用前景。

实施例2

请参见图1和图2，

图1为本施例中人造红细胞马达的制备步骤3和步骤4的示意图；

图2是本实施例中人造红细胞马达游动的原理图。

本实施例以血红蛋白、天然细胞膜、磁性微纳米颗粒为材料，利用化学共沉淀法和细胞膜融合技术，将红细胞的主要组成成分血红蛋白、磁性微纳米颗粒以及具有细胞生物性能的细胞膜融为一体，制备出具有红细胞双凹圆盘结构的人造红细胞马达。具体包括以下步骤：

步骤一、制备所述磁性微纳米颗粒：

a、将0.002-0.02mol的氯化亚铁和0.004-0.04mol的氯化铁按1:2的重量比例溶解到100-1000ml的去离子水中，氮气保护下加热到70℃，搅拌的同时加入40ml氨水；b、继续反应1小时后停止加热，装有上述反应液体的烧瓶置于磁铁上，静置30min，待形成的四氧化三铁颗粒完全沉积到所述烧瓶的底部后，去除上层液体；c、利用丙酮清洗所述四氧化三铁颗粒3-4次后，向所述烧瓶中加入25ml不含氧气的去离子水，得到粒径为5nm-500nm的四氧化三铁颗粒悬浮液；

步骤二、合成红细胞状氢氧化钙颗粒：

a、将100-1000mg的天然血红蛋白、0.5-5g的硫酸葡聚糖分散到100ml浓度为0.05-0.5mol/l的cacl2溶液中,得到混合溶液a；b、向20ml浓度为0.5-5mol/l的氢氧化钠溶液中添加步骤一所述的磁性四氧化三铁颗粒悬浮液,得到混合溶液b；c、将所述混合溶液a肯所述混合溶液b迅速混合后超声10秒钟；d、静置20min后离心收集，即得到含有所述磁性四氧化三铁颗粒和所述天然血红蛋白的粒径为2μm-100μm红细胞状氢氧化钙颗粒；

步骤三、制备人造血红蛋白马达骨架：

a、充分利用血液内不同细胞密度不同的特性，使用ficoll密度梯度离心法，以4500rpm/min的速度离心人体血液，分离、收集细胞，利用低渗缓冲液4℃下低渗处理细胞24小时，以充分去除细胞内的内容物；b、使用迷你挤压器，反复挤压细胞穿过孔径为200nm的聚氨酯薄膜21次，制备粒径为200nm的细胞膜纳米囊泡；c、以步骤二中所述含有磁性四氧化三铁颗粒和天然血红蛋白的红细胞状氢氧化钙颗粒为内核，内核与b中所述的细胞膜纳米囊泡充分混合，基于细胞膜融合技术，利用超声仪在59khz频率下超声融合30min，在所述内核表面融合细胞膜，完成所述人造血红蛋白马达骨架的制备。

步骤四、溶解内核：将步骤三所述的人造血红蛋白马达骨架加入到浓度为0.01-0.1mol/l、ph范围为5.0-7.0的磷酸盐缓冲液，浓度为0.005-0.051mol/l的稀盐酸溶液或ph值为7.0、浓度为0.1-1mol/l的乙二胺四乙酸二钠盐溶液中，30min后离心分离，弃去上清液，所得沉淀用ph7.4的磷酸盐缓冲液清洗三次，最终得到所述人造红细胞马达。

通过图1可以清晰地看到所述步骤三肯步骤四中人造红细胞马达的形成过程，其中代表含有磁性微纳米颗粒和血红蛋白的氢氧化钙颗粒，代表细胞膜囊泡，代表磁性微纳米颗粒，代表人造红细胞马达；

通过图2可以清晰地看到人造红细胞马达在外源超声场的驱动下游动的原理，其中代表超声场，直线代表其游动方式。

本实施例中所用药品均为市售产品，本实施例步骤二中的天然血红蛋白可由异硫氰酸荧光素(fitc)标记，步骤三中的细胞膜可用细胞膜染料did标记，从而得到带荧光的人造红细胞马达。本实施例制备的人造红细胞马达在外源超声场驱动下，沿声压梯度快速运动，超声条件是：电压为0.5～20v，频率为2khz。同时，人造红细胞马达通过表面修饰的天然细胞膜特异性识别癌细胞等细胞，实现人造红细胞马达运动方向的靶向运动。该方法简单易行、可批量化生产。

实施例3

本实施与实施例2的区别在于，人造红细胞马达的靶向方式为外源磁场引导的特异性靶向。

实施例4

请参见3、图4、图5所示，

图3是本实施例制备的人造血红蛋白马达的激光共聚焦显微镜照片；

图4是本实施例制备的人造血红蛋白马达的超声驱动下运动的光学显微镜照片；

图5是本实施例制备的人造血红蛋白马达的超声和磁场共同作用下靶向运动的光学显微镜照片。

本实施例以血红蛋白、天然细胞膜、磁性微纳米颗粒为材料，利用化学共沉淀法和细胞膜融合技术，将红细胞的主要组成成分血红蛋白、磁性微纳米颗粒以及具有细胞生物性能的细胞膜融为一体，制备人造红细胞马达。具体包括以下步骤：

步骤一、制备所述磁性微纳米颗粒：

a、将0.02mol的氯化亚铁和0.04mol的氯化铁溶解到100ml的去离子水中，氮气保护下加热到70℃，搅拌的同时加入40ml氨水；b、继续反应1小时后停止加热，装有上述反应液体的烧瓶置于磁铁上，静置30min，待形成的四氧化三铁颗粒完全沉积到所述烧瓶的底部后，去除上层液体；c、利用丙酮清洗所述四氧化三铁颗粒4次后，向所述烧瓶中加入25ml不含氧气的去离子水，得到粒径为500nm的四氧化三铁颗粒悬浮液；

步骤二、合成红细胞状氢氧化钙颗粒：

a、将100mg的天然血红蛋白、0.5g的硫酸葡聚糖分散到100ml浓度为0.05mol/l的cacl2溶液中,得到混合溶液a；b、向20ml浓度为0.5mol/l的氢氧化钠溶液中添加步骤一所述的磁性四氧化三铁颗粒悬浮液,得到混合溶液b；c、将所述混合溶液a肯所述混合溶液b迅速混合后超声10秒钟；d、静置20min后离心收集，即得到含有所述磁性四氧化三铁颗粒和所述天然血红蛋白的粒径为2μm的红细胞状氢氧化钙颗粒；

步骤三、制备人造血红蛋白马达骨架：

a、充分利用血液内不同细胞密度不同的特性，使用ficoll密度梯度离心法，以4500rpm/min的速度离心人体血液，分离、收集细胞，利用低渗缓冲液4℃下低渗处理细胞24小时，以充分去除细胞内的内容物；b、使用迷你挤压器，反复挤压细胞穿过孔径为200nm的聚氨酯薄膜21次，制备粒径为200nm的细胞膜纳米囊泡；c、以步骤二中所述含有磁性四氧化三铁颗粒和天然血红蛋白的红细胞状氢氧化钙颗粒为内核，内核与b中所述的细胞膜纳米囊泡充分混合，基于细胞膜融合技术，利用超声仪在59khz频率下超声融合30min，在所述内核表面融合细胞膜，完成所述人造血红蛋白马达骨架的制备。

步骤四、溶解内核：将步骤三所述的人造血红蛋白马达骨架加入到浓度为0.01mol/l、ph值为6.0的磷酸盐缓冲液中，30min后离心分离，弃去上清液，所得沉淀用ph7.4的磷酸盐缓冲液清洗三次，最终得到所述人造红细胞马达。

本实施例中所用药品均为市售产品，本实施例步骤二中的天然血红蛋白可由异硫氰酸荧光素(fitc)标记，步骤三中的细胞膜可用细胞膜染料did标记，从而得到带荧光的人造红细胞马达。本实施例制备的人造红细胞马达在外源超声场驱动下，沿声压梯度快速运动，超声条件是：电压为0.5～20v，频率为2khz。同时，人造红细胞马达通过表面修饰的天然细胞膜特异性识别癌细胞等细胞，实现人造红细胞马达运动方向的靶向运动。该方法简单易行、可批量化生产。

从图3可以发现，本实施例得到的人造血红蛋白马达呈类红细胞的双凹圆盘结构，直径为2μm。且fitc标记的血红蛋白和did标记的红细胞膜融合在一起，说明制备得到的人造红细胞马达具有良好的稳定性。

实施例5

本实施例以血红蛋白、天然细胞膜、磁性微纳米颗粒为材料，利用化学共沉淀法和细胞膜融合技术，将红细胞的主要组成成分血红蛋白、磁性微纳米颗粒以及具有细胞生物性能的细胞膜融为一体，制备人造红细胞马达。具体包括以下步骤：

步骤一、制备所述磁性微纳米颗粒：

a、将0.002mol的氯化亚铁和0.004mol的氯化铁溶解到1000ml的去离子水中，氮气保护下加热到70℃，搅拌的同时加入40ml氨水；b、继续反应1小时后停止加热，装有上述反应液体的烧瓶置于磁铁上，静置30min，待形成的四氧化三铁颗粒完全沉积到所述烧瓶的底部后，去除上层液体；c、利用丙酮清洗所述四氧化三铁颗粒4次后，向所述烧瓶中加入25ml不含氧气的去离子水，得到粒径为5nm的四氧化三铁颗粒悬浮液；

步骤二、合成红细胞状氢氧化钙颗粒：

a、将100mg的天然血红蛋白、0.5g的硫酸葡聚糖分散到100ml浓度为0.05mol/l的cacl2溶液中,得到混合溶液a；b、向20ml浓度为0.5mol/l的氢氧化钠溶液中添加步骤一所述的磁性四氧化三铁颗粒悬浮液,得到混合溶液b；c、将所述混合溶液a肯所述混合溶液b迅速混合后超声10秒钟；d、静置20min后离心收集，即得到含有所述磁性四氧化三铁颗粒和所述天然血红蛋白的粒径为2μm的红细胞状氢氧化钙颗粒；

步骤三、制备人造血红蛋白马达骨架：

a、充分利用血液内不同细胞密度不同的特性，使用ficoll密度梯度离心法，以4500rpm/min的速度离心人体血液，分离、收集细胞，利用低渗缓冲液4℃下低渗处理细胞24小时，以充分去除细胞内的内容物；b、使用迷你挤压器，反复挤压细胞穿过孔径为200nm的聚氨酯薄膜21次，制备粒径为200nm的细胞膜纳米囊泡；c、以步骤二中所述含有磁性四氧化三铁颗粒和天然血红蛋白的红细胞状氢氧化钙颗粒为内核，内核与b中所述的细胞膜纳米囊泡充分混合，基于细胞膜融合技术，利用超声仪在59khz频率下超声融合30min，在所述内核表面融合细胞膜，完成所述人造血红蛋白马达骨架的制备。

步骤四、溶解内核：将步骤三所述的人造血红蛋白马达骨架加入到浓度为0.01mol/l、ph值为6.0的磷酸盐缓冲液中，30min后离心分离，弃去上清液，所得沉淀用ph7.4的磷酸盐缓冲液清洗三次，最终得到所述人造红细胞马达。

本实施例中所用药品均为市售产品，本实施例步骤二中的天然血红蛋白可由异硫氰酸荧光素(fitc)标记，步骤三中的细胞膜可用细胞膜染料did标记，从而得到带荧光的人造红细胞马达。本实施例制备的人造红细胞马达在外源超声场驱动下，沿声压梯度快速运动，超声条件是：电压为0.5～20v，频率为2khz。同时，人造红细胞马达通过表面修饰的天然细胞膜特异性识别癌细胞等细胞，实现人造红细胞马达运动方向的靶向运动。该方法简单易行、可批量化生产。

实施例6

本实施例与实施例5的区别之处在于，步骤一中将0.01mol的氯化亚铁和0.02mol的氯化铁溶解到100ml的去离子水中，得到粒径为150nm的四氧化三铁颗粒悬浮液，其他与实施例5相同。

实施例7

本实施例与实施例5的区别之处在于，步骤四中浓度为0.01mol/l、ph值为6.0的磷酸盐缓冲液替换为浓度为0.005mol/l的稀盐酸溶液。

实施例8

本实施例与实施例5的区别之处在于，步骤四中浓度为0.01mol/l、ph值为6.0的磷酸盐缓冲液替换为ph值为7.0、浓度为0.1mol/l的乙二胺四乙酸二钠盐溶液。

实施例9

本实施例与实施例5的区别之处在于，步骤二变为：

合成红细胞状氢氧化钙颗粒：a、将1000mg的天然血红蛋白、5g的硫酸葡聚糖分散到100ml浓度为0.5mol/l的cacl2溶液中,得到混合溶液a；b、向20ml浓度为0.5mol/l的氢氧化钠溶液中添加步骤一所述的磁性四氧化三铁颗粒悬浮液,得到混合溶液b；c、将所述混合溶液a肯所述混合溶液b迅速混合后超声10秒钟；d、静置20min后离心收集，即得到含有所述磁性四氧化三铁颗粒和所述天然血红蛋白的粒径为100μm红细胞状氢氧化钙颗粒，其他与实施例5相同。

实施例10

本实施例与实施例5的区别之处在于，步骤二变为：

合成红细胞状氢氧化钙颗粒：a、将500mg的天然血红蛋白、2.5g的硫酸葡聚糖分散到100ml浓度为0.2mol/l的cacl2溶液中,得到混合溶液a；b、向20ml浓度为2.5mol/l的氢氧化钠溶液中添加步骤一所述的磁性四氧化三铁颗粒悬浮液,得到混合溶液b；c、将所述混合溶液a肯所述混合溶液b迅速混合后超声10秒钟；d、静置20min后离心收集，即得到含有所述磁性四氧化三铁颗粒和所述天然血红蛋白的粒径为30μm红细胞状氢氧化钙颗粒，其他与实施例5相同。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。