温敏聚合物修饰的双价态铂纳米簇及其制备方法和应用与流程
本发明涉及抗肿瘤药物制备领域，更具体地，涉及一种可精准调控光热化疗抗肿瘤效果的温敏聚合物配体表面修饰的双价态铂纳米簇及其制备方法和在抗肿瘤方面的应用。
背景技术：
目前，癌症仍是威胁人类生命健康的主要疾病之一，全世界癌症发病率呈急剧上升态势。癌症的治疗一直以来都是国内外研究的难点，临床治疗癌症的方法包括外科手术、放射治疗、热疗和化学药物治疗。热疗由于具有显著改善药物抗肿瘤效果受到人们广泛关注。通过将肿瘤组织加热到39～42℃，热疗发挥了细胞凋亡、转膜电导改变、na/k-atp酶活化以及谷胱甘肽的代谢等多重药物增敏作用。近二十年来随着纳米材料快速的发展，多种光热转换纳米材料(如荧光染料分子、过渡金属硫化物、贵金属纳米材料等)通过蓄积于肿瘤组织内，可有效地加热那些与关键组织“混居”的恶性肿瘤。并且近红外光热治疗(near-infraredregionphotothermaltherapy,nir-ptt)深部组织穿透能力强，在肿瘤治疗中可以非介入治疗，近年来得到快速的发展。
光热治疗的好坏直接取决于光热转换材料的选择。荧光染料分子如靛青绿(icg)因其低的光热转化能力以及小分子易于分布于全身而缺乏特异性等缺点未能广泛应用；过渡金属硫化物通常在高温油相中合成，产物在使用前需要复杂的表面修饰和功能化；贵金属材料金纳米棒、金纳米笼等由于温度升高会发生融化变形，光稳定性差制约了它们的发展。
铂作为另外一种贵金属元素，除了传统铂类化合物用于肿瘤的化疗之外，研究者最近发现铂纳米材料也具有潜在的光热抗癌活性，并且其熔点比金更高，所以其纳米材料的热稳定性也较金更优。yiyuncheng等利用树状大分子为模板、硼氢化钠为还原剂，采用溶剂热法合成了直径约1.4nm的铂纳米粒。该铂纳米粒具有明显的光热效应，在近红外激光照射下可有效杀死nih3t3肿瘤细胞，抑制小鼠体内肿瘤的生长。而使用光热消融肿瘤达到消融效果，其所需激光功率高，对于人体皮肤及软组织等具有潜在危害。并且单一的热疗并不能起到良好的肿瘤抑制效果，另一方面，化疗因其没有靶向性而引起的副作用限制了它的发展。最近十年内，越来越多的研究结果表明，在肿瘤治疗中，使用热疗和化疗相结合的方法比单一接受化疗或热疗效果更好，无瘤期更长。
以上结果表明铂类材料兼具化疗和热疗的潜力，但是目前还没有一项关于单纯的铂纳米材料精准调控光热/化疗抗肿瘤效果的报道。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供了一种温敏聚合物修饰的双价态铂纳米簇，该双价态铂纳米簇为核-壳结构，内核为表面附着有二价铂的零价铂，壳层为温敏聚合物。
本发明提供的温敏聚合物修饰的双价态铂纳米簇，通过调控二价铂与零价铂的相对含量，精准调控光热效应与化疗效果的相对作用强度，从而优化光热化疗协同抗肿瘤效果。在近红外光照射下，零价铂将光转换成热能，导致温度急剧升高，分子运动加剧，实现零价铂表面的二价铂脉冲式释放，从而达到化疗与热疗的精准协同作用。在小鼠皮下瘤模型上，通过尾静脉注射的给药体系，实现光热治疗与化疗的联合治疗。其中，在近红外光区(波长700～900nm)有广泛吸收，不依赖于表面等离子共振(spr)峰。
在本发明一个优选实施方式中，该双价态铂钠米簇的核心为零价铂纳米簇，即内核为表面附着二价铂的零价铂纳米簇。其中，二价铂优选通过金属键和静电作用吸附在零价铂纳米簇的表面。
其中，为了进一步优化光热化疗协同抗肿瘤效果，更加精准调控光热效应与化疗效果的相对作用强度，二价铂与零价铂摩尔比为0.018:1～2.26:1，优选为0.21:1～1.13:1，进一步优选为1.13:1。
在本发明一个优选实施方式中，温敏聚合物与内核中铂元素的质量比为0.032:1～2.49:1，优选为0.32:1～1.36:1。
在本发明一个优选实施方式中，温敏聚合物为温敏聚合物嵌段和亲水聚合物嵌段构成的嵌段共聚物。其中，温敏聚合物嵌段优选为聚(n-异丙基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸寡聚乙二醇乙醚)、聚乙二醇-聚乳酸/乙交酯中的一种或多种，进一步优选为聚(n-异丙基丙烯酰胺)，亲水聚合物嵌段优选为侧链带酸性基团的聚合物嵌段，进一步优选为聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚氨基酸、聚2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、聚丙烯胺中的一种或多种，更进一步优选为聚丙烯酸。
上述温敏聚合物嵌段与亲水聚合物配体嵌段的摩尔比优选为50:50～800:800。
其中，温敏聚合物优选为聚(n-异丙基丙烯酰胺-b-丙烯酸)的嵌段聚合物(pna)。n-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸摩尔比为100:100～300:300，更优选为200:200。
在本发明一个优选实施方式中，本发明采用的温敏型聚合物配体pna是由温敏单体n-异丙基丙烯酰胺(nipam)和亲水单体丙烯酸(aa)通过原子转移自由基反应聚合得到，通过调控温敏单体与亲水单体之间的比例调控温敏型聚合物配体pna的低临界溶解温度(lcst)。选用的温敏型聚合物配体pna低临界溶解温度(lcst)为39℃，在人体温度37℃表现为亲水性，而在39℃以上表现为疏水性，并且体积收缩，在肿瘤治疗中表现出良好的肿瘤热靶向性。
在本发明一个优选实施方式中，为了提高双价态铂钠米簇的稳定性以及光热化疗抗癌效果，壳层通过酸性基团与所述内核配位结合。当温敏聚合物优选为聚(n-异丙基丙烯酰胺-b-丙烯酸)时，壳层通过羧基与内核配位结合。当内核为表面附着二价铂的零价铂纳米簇时，温敏聚合物通过羧基与二价铂配位结合在零价铂纳米簇的表面。
在本发明一个优选实施方式中，内核可以由高价铂配合物经还原剂还原制得。酸性基团与上述高价铂配合物中的铂的摩尔比优选为0.027:1～2.7:1，进一步优选为0.27:1～2.7:1，最优选为1.35:1。其中，高价铂配合物可以为六氯铂酸、六氯铂酸盐(如六氯铂酸钾等)、四氯铂酸或四氯铂酸盐(如四氯铂酸钾等)，优为六氯铂酸，即内核为由六氯铂酸经还原剂还原制得。其中，温敏聚合物与六氯铂酸的摩尔比为0.1:1～2.7:1。
在本发明一个优选实施方式中，该双价态铂纳米簇中内核的平均粒径为1.5nm～6.0nm，进一步优选为2.0nm～5.0nm，该双价态铂纳米簇的平均粒径为6nm～60nm，进一步优选为10nm～50nm。
本发明的另一个目的在于提供上述温敏聚合物修饰的双价态铂纳米簇的制备方法，优选包括如下步骤：
1)将高价铂配合物与温敏聚合物混合，自组装形成核-壳结构的含有羧酸根的四价铂交联纳米凝胶；
2)所述四价铂交联纳米凝胶经还原反应得到所述温敏聚合物修饰的双价态铂纳米簇。
在上述方法中，可以通过控制温敏型聚合物配体与高价铂配合物的比例可以得到不同粒径大小的四价铂交联纳米凝胶，从而在还原过程中得到二价铂与零价铂相对含量不同的双价态铂纳米簇，通过调控二价铂与零价铂的相对含量，精准调控光热效应与化疗效果的相对作用强度，从而优化光热化疗协同抗肿瘤效果。
其中，高价铂配合物可以为六氯铂酸、六氯铂酸盐(如六氯铂酸钾等)、四氯铂酸或四氯铂酸盐(如四氯铂酸钾等)，优选为六氯铂酸。
其中，步骤1)中所述温敏聚合物通过酸性基团与高价铂配合物自组装，所述酸性基团与高价铂配合物中铂的摩尔比为0.027:1～2.7:1，进一步优选为0.27:1～2.7:1，最优选为1.35:1。
其中，步骤1)中四价铂交联纳米凝胶的粒径为50nm～500nm，优选为68.1nm～122nm，进一步优选为75nm～100nm。
其中，步骤1)中四价铂交联纳米凝胶中羧酸根离子与四价铂离子的摩尔比优选为0.27～4.0，进一步优选为0.27～2.7。
在一个优选实施方式中，当步骤1)中温敏聚合物为聚(n-异丙基丙烯酰胺-b-丙烯酸)的嵌段聚合物，其中，n-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸摩尔比为100:100～300:300，更优选为200:200时，步骤1)中温敏型聚合物配体的制备方法包括如下步骤：使用带有二硫键的atrp引发剂，先引发n-异丙基丙烯酰胺的聚合，待n-异丙基丙烯酰胺聚合完全后，再使用丙烯酸叔丁酯引发丙烯酸酯的聚合，然后通过三氟乙酸水解叔丁酯得到n-异丙基丙烯酰胺与丙烯酸的嵌段聚合物，即温敏型聚合物配体。
其中，n-异丙基丙烯酰胺和丙烯酸叔丁酯以及带有二硫键的atrp引发剂的摩尔比优选为100:100:1～300:300:1，进一步优选为200:200:1。
在一个优选实施方式中，温敏型聚合物配体的制备方法包括如下步骤：称取n-异丙基丙烯酰胺置于schlenk反应试管中，然后加入丙酮与超纯水，将其全部溶解后，将整个反应试管置于装有液氮的保温瓶中，经液氮冷冻，除去溶液中的氧气，加入氯化亚铜和含氮配体me6tren，混匀，最后用微量进样针向其中加入带有二硫键的atrp引发剂，置于0℃下反应，反应后得到聚合物a反应体系；取无氧的丙烯酸叔丁酯加入聚合物a反应体系中继续atrp反应，最终制备得到p(nipam-b-tba)嵌段聚合物；纯化、干燥后，使用三氟乙酸水解，得到p(nipam-b-aa)嵌段聚合物，即本发明优选的温敏型聚合物。
在一个优选实施方式中，当铂高价配合物选用为六氯铂酸时，步骤1)可以具体优选为：取六氯铂酸溶液与温敏嵌段聚合物混合，搅拌孵育后，得到六氯铂酸诱导共组装形成核-壳结构的四价铂交联纳米凝胶，其中核为六氯铂酸与聚合物配体配位交联形成，壳层为温敏聚合物层。
其中，搅拌孵育的条件优选为ph为8-12，优选为8，反应温度为20～50℃，优选为30℃。搅拌速度和时间分别优选600rpm和12h。
在一个优选实施方式中，步骤2)中还原反应具体为：向所述四价铂交联纳米凝胶中以5～50ml/h的速度滴加还原剂硼氢化钠，使其经还原反应得到温敏聚合物修饰的双价态铂纳米簇。
为了使得到的双价态铂纳米簇的粒径更加均匀且更纯，步骤2)中还原剂溶液的滴加速度优选为5～50ml/h恒速滴加，优选20ml/h。其中，还原剂优选为硼氢化钠。在实际操作过程中，优选使用微量注射泵向其中以恒定速率滴加还原剂。
在一个优选实施方式中，步骤2)可以为：取步骤1)得到的四价铂交联纳米凝胶，30℃恒温搅拌，并使用微量注射泵向其中以恒定速率滴加硼氢化钠溶液，注射完毕后继续反应2h-5d，超滤纯化得到温敏聚合物配体表面修饰的双价态铂纳米簇。
其中，硼氢化钠与六氯铂酸之间的摩尔比优选为1:1～20:1，优选为3:1。
在本发明一个优选实施方式中，上述双价态铂纳米簇的制备方法包括如下步骤：
1)取六氯铂酸溶液与温敏嵌段聚合物pna混合，搅拌孵育后，得到六氯铂酸诱导共组装形成核-壳结构的四价铂交联纳米凝胶；其中内核为六氯铂酸与聚合物配体配位交联形成，壳层为温敏聚合物层；其中，pna中羧基与六氯铂酸中铂的摩尔比为0.027:1～2.7:1；所述搅拌孵育的条件优选为：ph为8-12，反应温度为20～50℃；
2)取步骤1)得到的四价铂交联纳米凝胶，恒温搅拌，并使用微量注射泵向其中以恒定速率5～50ml/h滴加硼氢化钠溶液，注射完毕后继续反应2h-5d，超滤纯化得到温敏聚合物配体表面修饰的双价态铂纳米簇；所述硼氢化钠与六氯铂酸之间的摩尔比为1:1～20:1。
本发明的再一个目的在于提供上述温敏聚合物修饰的双价态铂纳米簇或是上述温敏聚合物修饰的双价态铂纳米簇的制备方法在制备光热化疗精准协同抗肿瘤治疗药物中的应用。
本发明的可精准调控光热/化疗抗肿瘤效果的温敏聚合物配体表面修饰双价态铂纳米簇，其包含有零价铂和二价铂，零价铂具有光热转换能力，二价铂具有肿瘤化疗效果，应用于近红外光热治疗，保证二价铂的可调节释放。
在本发明一个优选实施方式中，本发明的可精准调控光热/化疗抗肿瘤效果的温敏聚合物配体表面修饰双价态铂纳米簇，即温敏聚合物修饰的双价态铂纳米簇，可以通过控制温敏型聚合物配体pna与六氯铂酸的摩尔比例从0:018～2.7:1，可以还原得到不同比例的双价态铂纳米簇，其中二价铂与零价铂的摩尔比从0.018:1～2.26:1，通过调控二价铂与零价铂的相对含量，精准调控光热效应与化疗效果的相对作用强度，从而优化光热化疗协同抗肿瘤效果，如图1a和图1b所示。
如图1a所示，使用六氯铂酸与温敏型聚合物配体pna的羧基配位，诱导pna自组装得到核-壳结构的四价铂交联纳米凝胶簇1(pt(iv)@pna)，在还原剂硼酸氢钠的作用下使pt(iv)@pna从纳米凝胶簇2(pt(ii)@pna)变成纳米凝胶簇3(pt(ii)+ptnuclei@pna)，随着还原的进行，纳米凝胶簇3逐渐解体为双价态铂纳米簇4。得到的双价态铂纳米簇在激光的照射下释放二价铂，激光照射产热一方面布朗运动增强，另一方面聚合物层发生亲疏水转变而收缩，促使二价铂暴露，两方面共同促进二价铂的释放。
将上述双价态铂纳米簇运载至小鼠体内，在红外激光照射下，温度升高，聚合物层发生亲疏水反转，粒径变小，能够更容易蓄积在肿瘤部位，并且亲疏水反转促使肿瘤蓄积增加以及细胞摄取增加，同时在红外激光照射下，释放二价铂，从而提高肿瘤化疗效果，如图1b所示。
本发明所提供的可精准调控光热/化疗抗肿瘤效果的温敏聚合物配体表面修饰双价态铂纳米簇，其表面被温敏聚合物配体覆盖，而当在近红外光照射时，零价铂吸收光能转换成热能，温度迅速升高，一方面可以利用热能杀死癌细胞，另一方面，在近红外光照射下，温度升高促进双价态铂纳米簇中二价铂离子的运动，使其脱离零价铂表面而释放出来，实现二价铂药物的脉冲释放，最终达到一个热疗与化疗的精准协同效应。另外温敏型聚合物配体pna在高温下迅速收缩，使得温敏型铂纳米簇体积收缩，粒径减小，更易进入肿瘤部位，所以其具有热靶向肿瘤的能力。
附图说明
图1为本发明中双价态铂纳米簇的合成路线图(a)和双价态铂纳米簇用于荷瘤小鼠模型肿瘤治疗的示意图(b)；
图2a为p(nipam-b-tba)和p(nipam-b-aa)(pna)的核磁氢图谱；
图2b为p(nipam-b-tba)的gpc图谱；
图3为不同ph值的pna溶液的紫外透光率随温度的变化曲线图；
图4为实施例2中的四价铂交联纳米凝胶的透射电子显微镜图片(a)、实施例3中的四价铂交联纳米凝胶的透射电子显微镜图片(b)、实施例4中的四价铂交联纳米凝胶的透射电子显微镜图片(c)和实施例2、3、4中的四价铂交联纳米凝胶的水合粒径分布图(d)；
图5为对比例1中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇在合成过程中不同时间的紫外吸收光谱图(a)、实施例2中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇在合成过程中不同时间的紫外吸收光谱图(b)、实施例3中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇在合成过程中不同时间的紫外吸收光谱图(c)和实施例4中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇在合成过程中不同时间的紫外吸收光谱图(d)；
图6为对比例1中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇的透射电子显微镜图(a)、实施例2中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇的透射电子显微镜图(b)、实施例3中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇的透射电子显微镜图(c)和实施例4中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇的透射电子显微镜图(d)；
图7为对比例1中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇的晶格条纹图(a)、实施例2中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇的晶格条纹图(b)、实施例3中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇的晶格条纹图(c)和实施例4中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇的晶格条纹图(d)；
图8为对比例1中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇的电子衍射环(a)、实施例2中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇的电子衍射环(b)、实施例3中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇的电子衍射环(c)和实施例4中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇的电子衍射环(d)；
图9为对比例1中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇的高角环形暗场进行扫描-透射电子显微图片(stem)(a)、实施例2中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇的高角环形暗场进行扫描-透射电子显微图片(stem)(b)、实施例3中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇的高角环形暗场进行扫描-透射电子显微图片(stem)(c)和实施例4中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇的高角环形暗场进行扫描-透射电子显微图片(stem)(d)；
图10为对比例1和实施例2-4中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇以及温敏型聚合物配体pna的x-射线衍射谱图；
图11为对比例1和实施例2-4中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇以及温敏型聚合物配体pna的热重变化谱图；
图12为对比例1和实施例2-4中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇的铂4f轨道的x-光电子能谱图以及价态分析图(a)和对比例1和实施例2-4中温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇的铂4f轨道的x-光电子能谱价态比例与投料之间的关系图(b)；
图13为对比例1和实施例2-4中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇以及温敏型聚合物配体pna的傅式转换近红外光谱图；
图14为实施例3的中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇的二价铂释放前后的铂4f轨道的x-光电子能谱图；
图15为对比例1(a)和实施例2-4(b-d)中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇在分散介质为超纯水，pbs以及含10％胎牛血清的rpmi1640培养基中两周时间内粒径随时间变化图；
图16为对比例1和实施例2-4中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇以及温敏型聚合物配体pna的电位图；
图17a为对比例1和实施例2-4中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇在808nm激光照射下的升温曲线图；
图17b为对比例1和实施例2-4中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇在808nm激光照射下的升温降温5个循环曲线图以及光热转换效率；
图17c为实施例3中的温敏型聚合物配体双价态铂纳米簇在808nm激光照射下的升温降温5个循环前后的紫外吸收光谱图变化以及透射电子显微图片的形貌的变化；
图18为实施例3中温敏型聚合物配体修饰的铂纳米簇的二价铂脉冲释放曲线图；
图19为本发明实验例7中温敏型聚合物配体修饰的铂纳米簇的体内光热行为的近红外图像图；
图20为本发明实验例8中h22瘤体积随时间变化曲线(a)、h22瘤照片(b)、bal/c小鼠瘤重图(c)和bal/c小鼠体重图(d)。
具体实施方式
下面结合实施例和附图，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规技术手段。若未特别指明，实施例中所用的试剂为市售。
实施例1温敏型聚合物pna的制备
本实施例采用原子转移自由基聚合法制备温敏型聚合物配体pna：以n-异丙基丙烯酰胺(nipam)为温敏型聚合物的单体，丙烯酸叔丁酯(tba)为聚合物配体的单体前物，双[2-(2′-溴代异丁酰氧基)乙基]二硫化物(biboeds)为引发剂，三(2-二甲氨基乙基)胺(me6tren)为配体，氯化亚铜(cucl)为催化剂，丙酮与水四比一的混合溶液为溶剂进行atrp反应，nipam:tba:biboeds:me6tren:cucl摩尔比＝200:200:1:2:2。
具体步骤如下：
1)将2.26gn-异丙基丙烯酰胺(nipam)置于schlenk反应容器管中，然后加入8ml丙酮和2ml超纯水，1000rpm搅拌3min将nipam完全溶解，然后进行液氮冷冻5min、真空泵抽真空5min、充超纯氩气5min，然后将液氮冷冻物料与100μlme6tren和31μl的双[2-(2′-溴代异丁酰氧基)乙基]二硫化物溶液混合，再次进行液氮冷冻处理5min、真空泵抽真空5min、充超纯氩气5min两个循环，然后加入20mgcucl，第三次进行液氮冷冻处理5min、真空泵抽真空15min、充超纯氩气15min，于0℃下反应24h；然后加入第二个单体5.2mltba，于0℃下继续反应24h，反应完毕后，旋蒸除去溶剂，再与20ml乙醇混合，将所得混合物料置于截留分子量为3500da的透析袋中，依次采用乙醇-水混合溶液(乙醇与水的体积比为1：1)透析2天、超纯水透析3天，于冻干机中-55℃条件下冻干2天，得到聚合反应产物(pntb)。
2)称取2g干燥后的聚合物反应产物(pntb)于250毫升圆底烧瓶，加入40毫升二氯甲烷溶解，于30℃油浴恒温10分钟后，加入4毫升三氟乙酸进行水解，水解反应进行24小时，24小时后旋蒸除去溶剂，然后用ph为10的超纯水100ml溶解聚合物，之后转移至截留分子量为3500da的透析袋中，超纯水透析3天，于冻干机中-55℃条件下冻干2天，得到聚合反应产物温敏型聚合物配体pna。
将得到的聚合反应产物进行核磁(图2a)和gpc(图2b，图2b中数均分子量为47.6kda，多分散指数为1.07)测定，核磁结果通过以n-异丙基丙烯酰胺(nipam)次甲基氢积分面积设为1，积分n-异丙基丙烯酰胺(nipam)中异丙基上的氢和丙烯酸叔丁酯(tba)中叔丁基上的氢，可以看出n-异丙基丙烯酰胺(nipam)与丙烯酸叔丁酯(tba)的摩尔比为1:1，与理论相符。gpc测得其分子量，所得结果与理论分子量相符，并且pdi小于1.1，粒径分布均一。
将实施例1中所得的温敏型聚合物配体pna称取50mg，然后加入到10ml超纯水中，1000rpm搅拌3小时将其溶解，并用1摩尔每升的氢氧化钠溶液将ph调至5.0，6.5以及7.4，每个ph值溶液取3ml，然后测定不同温度下不同ph值的pna溶液的紫外透光率的变化曲线，如图3所示，可以看出pna的温敏型基本不受ph的影响。因为nipam中含有亲水的酰胺键和疏水的异丙基，在低温时，酰胺键与水分子的氢键作用强于异丙基的疏水作用，宏观上表现为透明溶液，随着温度的升高，酰胺键与水分子的氢键作用被破坏，进而异丙基的疏水作用就占据主导位置，宏观上体现为不透明的浊液，而温敏型聚合物配体pna是以嵌段的形式存在，那么nipam聚合中间就不会参杂亲水单体aa，这样napam的相变温度就不会受到丙烯酸的影响，从而也不会受到ph值改变的影响。
实施例2-5温敏聚合物修饰的双价态铂纳米簇的制备
本实施例提供了一种温敏聚合物修饰的双价态铂纳米簇，该双价态铂纳米簇为核-壳结构，内核为表面附着有二价铂的零价铂，壳层为温敏聚合物pna。
该双价态铂纳米簇的制备方法包括如下步骤：
1)将实施例1中所得的温敏型聚合物配体pna称取0.5g，然后加入到10ml超纯水中，1000rpm搅拌3小时将其溶解，并用1m的氢氧化钠溶液将ph调至8.0，按照下表1的配比，将pna溶液与1ml的100mm的六氯铂酸溶液混合并最终定容至15ml，调节ph至8.0，将上述体系置于30℃油浴锅中以600rpm搅拌12h进行孵育，使其形成纳米凝胶。不同的投料比所形成的纳米凝胶的透射电子显微镜见图4a，4b和4c，不同的投料比所形成的纳米凝胶粒径分布见图4d。
2)配置2.26mg/ml的硼氢化钠溶液5ml，使用微量注射泵以20ml/h的速度向上述纳米凝胶体系中注射，分别在不同时间点取样测定其紫外吸收图谱，以此判定反应平衡时间，分别见图5a，5b，5c以及5d，从图中可以看出随着温敏型聚合物配体pna占比增加，反应达到平衡时间也增加。上述反应5d后使用截留分子量为100kda的超滤离心管8000rpm，10min，重复三次进行纯化，最后定容至5ml。所得产物为不同价态比例的温敏型聚合物配体修饰的双价态铂纳米簇。其中，对比例1和对比例2与实施例2-5相比，其区别在于，pna中羧基与六氯铂酸中铂的摩尔比值不同，具体数据详见表1，其它步骤均一致。
表1为不同温敏型聚合物配体pna中羧基与六氯铂酸投料摩尔比
实验例1
取对比例1和实施例2-4中所得的铂纳米簇各500μl，然后用超纯水稀释到15ml，取5μl滴到碳膜覆盖的铜网上自然干燥。使用场发射透射电子显微镜(ftem，tecnaig2f30)观察各铂纳米簇的形貌、晶格条纹、电子衍射环、高角环形暗场进行扫描-透射电子显微(stem)成像观察铂纳米簇外层温敏型聚合物配体pna以及线扫描进行元素分析。
图6a显示无pna作为模板合成的铂纳米簇(对比例1)呈链珠状团聚，而图6b,6c和6d有pna为模板合成的三种铂纳米簇(实施例2-4)呈球形分散性良好。如图7a,7b,7c和7d显示，四种铂纳米簇的晶格条纹宽度均为
实验例2
取对比例1和实施例2-4中的不同二价铂与零价铂比例的温敏型聚合物配体修饰的双价态铂纳米簇5ml于-55℃环境下真空冻干，然后使用冻干样品进行x-射线衍射(xrd)、热重(tg)、x-光电子能谱(xps)、以及傅氏转换红外线光谱(ftir)分析。图10可以发现，pna只在20度有一个无定型的“馒头峰”，而四种铂纳米簇在40度(对应1,1,1型晶面)，46度(对应2,0,0型晶面)，68度(对应2,2,0型晶面)以及82度(对应3,1,1型晶面)，表明四种铂纳米簇都形成了晶型较好的晶体，并且随着pna量的增加，各个峰强度都有所下降并且半峰宽变宽，表明其中铂纳米簇含量降低并且粒径逐渐减小。图11中通过热重分析可以发现随着pna量的增加，四种铂纳米簇材料从100℃升温到600℃，重量损失百分比增加，损失的成分为pna，各铂纳米簇的重量损失百分比与理论相符。图12a通过xps分析四种铂纳米簇中二价铂与零价铂的比例，分峰计算得出当pna中羧基与六氯铂酸的摩尔比从0:1～2.7:1，所合成的铂纳米簇中二价铂与零价铂的摩尔比从0:1～2.26:1。通过将二价铂与零价铂摩尔比对羧基与六氯铂酸摩尔比作图，如图12b所示，可以发现两者呈线性关系，表明可以通过调控投料比而控制最终产物的二价铂和零价铂的摩尔比。图13通过ftir分析可以看出pna在结合铂纳米簇后，羧基的碳氧双键的伸缩振动峰消失，碳氧单键的伸缩振动减弱，并且图14中铂纳米簇中的二价铂释放前后，铂的4f轨道的电子结合能有位移，共同说明pna是通过羧基与二价铂配位结合而结合在铂纳米簇表面。
实验例3
取对比例1和实施例2-4中的四种温敏型聚合物配体修饰的双价态铂纳米簇分别分散于超纯水，pbs以及含10％胎牛血清的rpmi1640培养基中培养。在第0天，第7天以及第14天使用激光粒度仪测量其粒径的变化，并拍摄数码照片，如图15所示，无pna包裹的铂纳米簇其胶体(a)稳定性很差，并且容易聚沉，粒径变大，而有pna包裹的铂纳米簇胶体(b、c和d)稳定性良好，并且粒径在14天内变化不大，说明其稳定性良好。
实验例4
取对比例1和实施例2-4中的四种温敏型聚合物配体修饰的双价态铂纳米簇溶液30mg/ml的pna溶液各100μl，然后用超纯水稀释到1ml，以及然后使用激光粒度仪测量它们各自的zeta电位。结果如图16所示，可以看出pna溶液为-27mv左右，这是由于其含有大量电离的羧基，所以呈现较强的负电性，随着pna量的增加，铂纳米簇zeta电位绝对值逐渐降低，这是由于随着pna量的增加，所合成的铂纳米簇中二价铂的比例逐渐增加，并且pna通过羧基与铂纳米簇结合使得羧基处于内层，外层基本为nipam层，将羧基和带负电的零价铂包裹起来，所以其zeta电位逐渐减小。
实验例5
取对比例1和实施例2-4中的温敏型聚合物配体修饰的双价态铂纳米簇50μl，然后用高氯酸:硝酸＝0.5:2的混合液2.5ml在320℃的恒温加热板上消化，去除pna，待消化液变成清亮透明时，大约用时30min，即消化完毕，用超纯水定容至10ml，然后用电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-oes)测定各铂纳米簇中铂浓度。取对比例1和实施例2-4中的温敏型聚合物配体修饰的双价态铂纳米簇0.5ml，然后用超纯水分别稀释到0.5mm，分别取0.5ml置于2ml离心管中，用1w/cm2的808nm波长的激光照射，每隔30s用近红外热成像仪测量温度一次。
升温曲线(图17a)结果显示随着照射时间的延长，铂纳米簇溶液温度越来越高，并且随着零价铂比例的升高，升温幅度越来越高，并且最后达到的温度也越来越高，最终升高温度分别为23℃，34.4℃，43.9℃以及47.4℃，铂纳米簇优异的光热转换能力为后续的细胞实验以及动物实验打下了坚实的基础。图17b为升温降温曲线，用激光照射0.5毫升铂纳米簇溶液体系，在照射的同时，用近红外热成像仪实时测量铂纳米簇溶液温度的变化值，一直照射10分钟，十分钟后撤去激光，看溶液在后10分钟的降温情况，一共做5个循环，结果显示5个循环后，四种铂纳米簇各自最后能够达到的温度都比较相近，表明四种铂纳米簇都具有良好的光热稳定性，并且通过计算光热转换效率，四种铂纳米簇的光热转换效率均为42％左右，证明其具有优异的光热转换能力。图17c为1.35:1铂纳米簇在光照5个循环以后的紫外光谱变化，以及其形态的变化，从图中可以发现不论是铂纳米簇的紫外吸收光谱还是形貌都没有发生明显的变化，进一步证明了温敏型聚合物配体修饰的双价态铂纳米簇优异的光热稳定性。
实验例6
取实施例3得到的温敏型聚合物配体修饰的双价态铂纳米簇0.5ml，置于截留分子量为3500da的透析袋中，然后放置于含有40mlph为7.4的pbs溶液的100ml的蓝口瓶中，将蓝口瓶置于37℃摇床中120rpm孵育，每隔1h，用1w/cm2的808nm激光照射5分钟，然后在摇床孵育5分钟后，吸取透析液1ml，用icp-oes测定其中铂的含量，按以上步骤一共重复照射8次，计算铂的累积释放量。对照组：取实施例3得到的温敏型聚合物配体修饰的双价态铂纳米簇0.5ml，置于1.5ml离心管中，然后置于37℃摇床中120rpm孵育，每隔1h，将铂纳米簇溶液转移至15ml超滤管中(截留分子量为10万da)，用icp-oes测定其中铂的含量，按以上步骤一共重复照射6次，计算铂的累积释放量。
其中，图18中阶梯型的曲线为实验组，较平的曲线为对照组，从图中可以看出，在生理温度下，随着时间的延长，实施例5的双价态铂纳米簇的二价铂药物释放很缓慢，因二价铂与零价铂直接通过金属键和静电吸附结合在一起，不容易释放出来，而在激光照射下，铂纳米簇吸收光能转换成热能，温度迅速升高，一方面可以利用热能杀死癌细胞，另一方面，由于二价铂的分子运动加剧，布朗运动增强，使得其产生一个脉冲式的释放，撤去激光后药物几乎不释放，再次采用激光照射，二价铂又会出现脉冲释放行为，这表明我们可以通过控制激光照射来灵活调控药物的释放。
实验例7
取雄性balb/c雄性小鼠18±2g30只，于小鼠右后腿皮下注射100ulh22肿瘤细胞(肿瘤细胞密度为2000万细胞/ml)，大约一周后待肿瘤长至150～200mm3后，随机分成10组，每组3只。采用尾静脉注射的方式分布给肿瘤注射100ul生理盐水(图19中的生理盐水，注射后立即不光照和光照)，100ul30mg/ml的pna溶液(图19中的pna，注射后立即不光照和光照)，100ul5.4:11.5mm(图19中的5.4:1，注射后立即不光照和光照(单纯二价铂，对比例2铂纳米簇))，100ul0.027:11.3mm(图19中的0.027:1，注射后立即不光照和光照(实施例5铂纳米簇)，100ul1.35:11.5mm(图19中的1.35:1，注射后立即不光照和光照(实施例3铂纳米簇)，注射24h后，用1w/cm2808nm激光照射肿瘤，实时用近红外热成像仪监控肿瘤温度。
图19为本发明的可精准调控光热/化疗抗肿瘤效果的温敏聚合物配体表面修饰双价态铂纳米簇的体内光热行为的近红外图像。热靶向是由于温度升高，纳米材料的粒径在温度高于其低临界溶解温度(lcst)时减小，此时纳米材料会选择性在温度高于其lcst处蓄积。在注射生理盐水、pna溶液、单纯二价铂后，注射后立即激光照射与否实现有无热靶向效果，24h后用激光照射，肿瘤的升温并无差异，而0.027:1材料组和1.35:1材料组，注射后立即激光照射与否实现有无热靶向效果，24h后用激光照射，肿瘤的升温存在显著性差异，这是由于铂纳米簇表面的温敏型聚合物配体pna，当温度达到其lcst时，其由亲水变为疏水，并且收缩粒径减小，由于前三组材料并不具有光热转换能力，所以在注射材料后立马高功率激光照射肿瘤部位并不会使肿瘤部位达到pna的lcst，所以此时的材料不会出现热靶向的现象，而0.027:1材料组和1.35:1材料组都具有光热转换能力，当注射材料后，立马使用高功率激光照射肿瘤部位，纳米材料流经肿瘤时温度升高至lcst以上，此时纳米材料热靶向到肿瘤部位，选择性地蓄积在肿瘤内，而在注射纳米材料后不加高功率激光照射肿瘤部位，那么纳米材料不会升温，故而不能产生热靶向的现象，此结果充分证明铂纳米簇具有良好的热靶向肿瘤的能力。本发明的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏型聚合物配体修饰的双价态铂纳米簇，采用1w/cm2激光照射时，随着照射时间的延长，0.027:1材料组和1.35:1两组的瘤内的温度会有显著的上升，最高温可达47℃，恰恰满足动物实验热增敏的要求。
实验例8
于小鼠右后腿皮下注射100ulh22肿瘤细胞(肿瘤细胞密度为2000万细胞/ml)，大约一周后待肿瘤长至150～200mm3后，随机分成8组，每组5只。其中，1)生理盐水组；2)pna组；3)0.027:1不加光照组(实施例5铂纳米簇)；4)0.027:1加光照组(实施例5铂纳米簇)；5)5.4:1不加光照组(单纯二价铂，对比例2铂纳米簇)；6)5.4:1加光照组(单纯二价铂，对比例2铂纳米簇)；7)1.35:1不加光照组(实施例3铂纳米簇)；8)1.35:1加光照组(实施例3铂纳米簇)；并根据分组进行对4)、6)、8)组采用功率为1w/cm2的激光进行照射，每只老鼠照射5分钟，并且每天对小鼠进行体重、瘤长与瘤宽数据记录，并根据公式：瘤体积＝瘤长×瘤宽×瘤宽/2，计算肿瘤体积，实验进行14天后，处死老鼠，取老鼠肿瘤称重。
图20为本发明的光热化疗精准协同抗肿瘤的温敏型聚合物配体修饰的双价态铂纳米簇的药效研究数据。从图20a可以看出，除第8)组外，其余6组的肿瘤体积都具有增大趋势，相较于单一化疗组第7)组和单一热疗组第4)组，第8组都具有极显著性差异，体现出协同治疗效果。并且第7)组与第5)6)组相比，第14天时其瘤体积相对较大，这是由于不加光照二价铂不释放以及材料本身无毒的原因。图20b的肿瘤照片与图20a的结果相符合，第8组相较于其他7组具有最小的肿瘤，图20c的瘤重图与图20a，图20b两图数据相符合，显示出铂纳米簇具有最轻的肿瘤。图20d为试验老鼠的体重数据，8组实验老鼠体重无明显改变，证明材料具有良好的生物安全性。
最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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