一种ROS敏感的肿瘤靶向基因递释系统及其制备方法与流程

本发明属生物技术领域，具体涉及一种ros敏感的肿瘤靶向基因递释系统。

背景技术：

文献报道，恶性肿瘤目前已成为威胁人类健康的头号敌人，传统的治疗手段包括手术切除，化疗，放疗都存在各自的缺陷：手术难以全部切除，甚至有的肿瘤由于位置特殊无法进行手术切割；化疗往往伴随全身毒副作用和机体耐药；放疗也会造成对正常组织的损伤和带来某些免疫反应。基因治疗通过将外源性基因导入宿主细胞，期望纠正或替换人体自身基因结构或功能上的紊乱，阻止疾病的进一步发生发展，由于特异性高，针对性强，很少伴有毒副反应。研究显示，基因治疗的效果主要取决于递送载体的递送效率，一个理想的载体需要具备以下三点：1)良好的生物相容性；2)基因负载能力强以保证体内运输的稳定性；3)靶向递送到病灶，同时满足以上三点，对于载体设计来说当前仍具有挑战。基因负载能力强，要求载体是荷正电的大分子，而在进入细胞后，载体最好能解离成小分子，一方面既利于基因的分离释放，另一方面又实现了材料的胞内降解，降低细胞毒性。针对以上现状，本发明拟提出的策略是设计一种针对肿瘤微环境响应解离的阳离子聚合物。

据报道，若干疾病包括肿瘤，神经退行性疾病，炎症，心血管疾病等都伴随着氧化应激与抗氧化水平的失调从而导致ros水平的升高，比如，肿瘤细胞内的ros含量(100×10^-6m)就远远高于正常组织(20×10^-9m)，可以用来设计ros响应的智能化载体。研究显示类似苯硼酸酯的结构能被ros特异性切断，因此在本发明中，本申请的发明人拟设计合成一个具有苯硼酸酯结构的小分子linker，利用它对低分子量的聚乙烯亚胺阳离子单体进行交联，形成一种ros敏感的阳离子聚合物，该技术方案将保证载体能将基因压缩成为稳定的纳米粒，且在肿瘤细胞内高水平ros的氛围下降解为小分子，释放基因。

技术实现要素：

本发明的第一目的是针对现有基因递送载体所面临的挑战，提供一种新的高效的基因递送载体，具体涉及一种ros敏感的肿瘤靶向基因递送载体及其制备方法。

本发明提出了一种针对肿瘤微环境响应解离的阳离子聚合物。

更具体的本发明设计合成一个具有苯硼酸酯结构的小分子linker，利用它对低分子量的聚乙烯亚胺阳离子单体进行交联，形成一种ros敏感的阳离子聚合物，该技术方案将保证载体能将基因压缩成为稳定的纳米粒，且在肿瘤细胞内高水平ros的氛围下降解为小分子，释放基因；此外，通过聚乙二醇，在聚合物表面共价连接一个能够靶向乳腺癌表面高表达的nk-1受体的sp肽，提高载体对基因的靶向递送能力，增加基因在肿瘤部位的蓄积。

本发明所述递释系统由ros敏感的阳离子聚合物基因压缩载体和质粒dna或sirna复合制得。

优选地，所述递释系统中，阳离子聚合物基因压缩载体与质粒dna的n/p比例比为10∶1，与sirna的n/p比例为3∶1。

优选地，所述ros敏感的阳离子聚合物基因压缩载体由ros敏感的阳离子聚合物，聚乙二醇，sp肽三者共价连接制得。

优选地，所述ros敏感的阳离子聚合物基因压缩载体中，所述阳离子聚合物所占质量分数为70％。

优选地，所述ros敏感的阳离子聚合物由单体为分子量1200的分枝状乙烯亚胺低聚物，通过小分子交联剂vpbe交联聚合制得。

优选地，所述聚乙二醇为直链聚乙二醇，其封端基团为nhs活性酯和马来酰亚胺，其分子量为3500。

优选地，所述sp肽为靶向功能分子，序列为rpkpqqffglm，并在氨基末端修饰上巯基。

优选地，所述质粒dna为红荧光报告质粒，所述治疗基因sirna特异性作用于polo样激酶1(plk1)。

优选地，所述ros敏感的肿瘤靶向基因递释系统，其特征在于所述的ros敏感的阳离子聚合物基因压缩载体与质粒dna复合形成的纳米复合物粒径为151.83±15.03纳米，与sirna复合形成的纳米复合物粒径为90.3±5.87纳米。

优选地，所述ros敏感的肿瘤靶向基因递释系统，其特征在于所述ros敏感的阳离子聚合物基因压缩载体与质粒dna复合形成的纳米复合物在纯水中电势为18.7±2.0毫伏。

本发明的另一目的在于提供ros敏感的肿瘤靶向基因递释系统的制备方法，其包括：

1)制备ros敏感小分子交联剂vpbe；

2)vpbe与聚乙烯亚胺交联反应得到crosslinkedbpei阳离子聚合物；

3)制备sp-聚乙二醇与crosslinkedbpei共价连接得到靶向压缩材料sp-crosslinkedbpei；

4)靶向压缩材料sp-crosslinkedbpei水溶液慢慢滴加到基因溶液中，移液枪快速吹打后涡旋30秒，室温静置30分钟，得ros敏感的肿瘤靶向基因递释系统。

优选地，所述ros敏感小分子交联剂vpbe的合成方法，其特征为：加入摩尔比为1∶1.5的4-乙烯基苯硼酸，3-烯丙氧基-1，2-丙二醇和1克无水硫酸钠于无水二氯甲烷中，在40度油浴中搅拌至过夜，通过过滤除去无水硫酸钠，最后通过柱层析硅胶柱以石油醚/乙酸乙酯3∶1的比例分离纯化得到最终产物vpbe。

优选地，所述vpbe与聚乙烯亚胺交联反应方法，其特征为：对低分子量的聚乙烯亚胺进行巯基修饰，加入摩尔比为1∶2的聚乙烯亚胺和硫化丙烯于适量甲醇溶液中，氮气保护，在60度条件下反应12小时，旋蒸除掉甲醇，乙醚沉淀三次纯化得到巯基修饰的聚乙烯亚胺。接着按摩尔比1∶5将巯基修饰后的聚乙烯亚胺和vpbe，以及催化量的2，2-二甲氧基-苯基乙酮，置于甲醇中，在365纳米紫外光照射下巯基与双键click反应12小时，乙醚沉淀三次，透析袋(分子量10000)透析纯化得到crosslinkedbpei阳离子聚合物。

优选地，所述sp-聚乙二醇与crosslinkedbpei共价连接方法，其特征为：nhs-peg3.5k-mal与巯基功能化的sp肽按照摩尔比1∶1.5在pbs缓冲液(ph7.0)中室温过夜反应，透析(分子量3000)24小时纯化，冷冻干燥得到sp-peg-nhs。最后交联后的聚乙烯亚胺与sp-peg-nhs按照摩尔比1∶1在pbs缓冲液(ph8.0)室温反应12小时，透析(分子量10000)纯化得到最终的靶向压缩材料sp-crosslinkedbpei。

优选地，所述步骤4)中的基因溶液浓度为200μg/ml。

本发明突出的优点及特征在于，利用肿瘤微环境区别正常组织所呈现出来的高水平ros的病理特征，设计合成了ros敏感的阳离子聚合物基因递送载体，具有以下特点：1)对基因的稳定压缩体内运输；2)在进入肿瘤细胞后，随着聚合物载体在ros的帮助下降解成小分子的单体，成功降低细胞毒性，生物相容性好；3)相比于传统的大分子基因载体，由于阳离子聚合物载体降解为小分子，负载的基因容易更好地离去发挥自身作用；4)靶向功能分子sp肽的修饰，通过与乳腺癌细胞上高表达的nk-1受体的识别配对，介导纳米粒靶向进入到肿瘤部位，增加基因药物在肿瘤细胞的蓄积，实现更好的肿瘤治疗效果。

本发明的一种ros敏感的肿瘤靶向基因递释系统为基因药物的安全高效递送提高了一个新的可实施途径。

附图说明：

图1为sp-crosslinkedbpei在重水中的核磁氢谱图。

图2为各载体与pdna复合形成纳米粒的表征，其中，

a为各载体与pdna以不同n/p比复合形成纳米粒的粒径；b为各载体与pdna以不同n/p比复合形成纳米粒的电位；c，d为sp-crosslinkedbpei与pdna以n/p比10复合形成纳米粒的粒径分布图和透射电镜图。

图3为crosslinkedbpei材料的ros敏感性考察，其中，

a为crosslinkedbpei材料在经过双氧水过夜处理前后的核磁图；b为凝胶电泳图显示crosslinkedbpei对pdna的包封以及ros响应释放pdna的能力；c为crosslinkedbpei材料与pdna复合后的纳米粒在双氧水(1mm)和pbs溶液中粒径随时间的变化；d为crosslinkedbpei材料与pdna复合后的纳米粒在双氧水和pbs中20h后的粒径分布图。

图4为纳米粒在mda-mb-231的细胞摄取和细胞转染结果，其中，

a为纳米粒的细胞摄取；b为纳米粒的细胞转染定性结果；c为纳米粒在乳腺癌肿瘤部位的转染定性结果；d为纳米粒的细胞转染定量结果。

图5为纳米粒在乳腺癌荷瘤裸鼠的体内分布，其中，

a为尾静脉注射不同纳米粒24h后的活体成像图；b为尾静脉注射不同纳米粒24h后的离体器官成像图。

图6为纳米粒的体外基因沉默效率考察，其中，

a为qpcr测定mda-mb-231细胞中plk1mrna含量；b为westernblot测定mda-mb-231细胞中plk1蛋白的表达。

图7为纳米粒对乳腺癌模型鼠的抗肿瘤治疗效果的考察，其中，

a为给药期间裸鼠的体重变化；b为给药期间裸鼠的瘤体积变化；c为westernblot测定肿瘤组织中plk1蛋白的含量。

具体实施方式

以下通过具体实施方式详细说明本发明的技术方案，应理解以下的具体实施方案仅为示例性，任何改动或变化只要不脱离本发明的技术方案设计，都应在本发明权利的要求保护范围之内。

实施例1

如图1所示合成步骤，首先合成vpbe，加入摩尔比为1∶1.5的4-乙烯基苯硼酸，3-烯丙氧基-1，2-丙二醇和1克无水硫酸钠于无水二氯甲烷中，在40度油浴中搅拌至过夜，通过过滤除去无水硫酸钠，最后通过柱层析硅胶柱以石油醚/乙酸乙酯3∶1的比例分离纯化得到最终产物vpbe。接着对低分子量的聚乙烯亚胺进行巯基修饰，加入摩尔比为1∶2的聚乙烯亚胺和硫化丙烯于适量甲醇溶液中，氮气保护，在60度条件下反应12小时，旋蒸除掉甲醇，乙醚沉淀三次纯化得到巯基修饰的聚乙烯亚胺。接着按摩尔比1∶5将巯基修饰后的聚乙烯亚胺和vpbe，以及催化量的2，2-二甲氧基-苯基乙酮，置于甲醇中，在365纳米紫外光照射下巯基与双键click反应12小时，乙醚沉淀三次，透析袋(分子量10000)透析纯化得到交联聚乙烯亚胺。nhs-peg3.5k-mal与巯基功能化的sp肽按照摩尔比1∶1.5在pbs缓冲液(ph7.0)中室温过夜反应，透析(分子量3000)24小时纯化，冷冻干燥得到sp-peg-nhs。最后交联后的聚乙烯亚胺分别与nhs-peg-meo，sp-peg-nhs按照摩尔比1∶1在pbs缓冲液(ph8.0)室温反应12小时，透析(分子量10000)纯化得到最终的非靶头材料crosslinkedbpei和靶头组材料sp-crosslinkedbpei；其中sp-crosslinkedbpei的核磁氢谱图如图1所示。

实施例2

定量称取单纯未交联bpei1.2k，crosslinkedbpei和sp-crosslinkedbpei，溶于纯水，使之终浓度为1mg/ml。以上三种材料按照对应从5到20的n/p比浓度滴入到200μg/ml的pdna溶液中，移液枪快速吹打混匀后涡旋30秒，室温静置30分钟，制得各纳米粒，采用马尔文粒径测定仪测定纳米粒的dls粒径和zeta电位值，如图2a，b所示。按上述方法新鲜制备纳米粒溶液(n/p＝10)，滴加一滴至碳支持膜铜网上，红外灯下烘干，tem镜下观察纳米粒的形态，如图2d所示。可见在n/p＝10时，即可形成粒径均一稳定的纳米粒。

实施例3

将crosslinkedbpei置于1mmh2o2水溶液中处理12小时，冻干，冷冻干燥后重水复溶，核磁比较h2o2处理前后的氢谱变化，如图3a所示，可以看到交联剂分子中苯环上的氢位移发生了变化，证明苯硼酸酯键在h2o2存在下断开，显示材料的ros敏感性；按实施例2的所述方法制备crosslinkedbpei/pdna纳米粒(n/p＝10)，分别经过不同的处理，包括h2o2和肝素，凝胶电泳结果显示材料能对pdna完全包封，且具有ros响应释放特点(如图3b所示)；h2o2处理后的纳米粒，其粒径逐渐变大，最后20小时可见其粒径超过1微米，而pbs组粒径不变，同样证明其ros敏感行为(如图3c所示)。

实施例4

采用红色染料bodipy标记bpei，然后将其与pdna按照n/p＝10的比例复合得到各组纳米粒；以5微克pdna/孔的剂量加入到mda-mb-231细胞的培养液中，37度孵育30分钟，另一组预先在培养液中加入sp肽预处理15分钟后再加入sp-crosslinkedbpei/pdna纳米粒孵育30分钟，最后采用倒置荧光显微镜拍摄细胞摄取，可见sp肽修饰组纳米粒摄取较未修饰组显著增加，且sp肽预饱和处理后能减少靶头组的摄取(如图4a所示)。

实施例5

按上述方法制备好各组纳米粒(n/p＝10)，以5微克pdna/孔的剂量加入到mda-mb-231细胞的培养液中，37度孵育4小时，hanks洗掉，继续培养44小时，荧光显微镜下拍摄红荧光蛋白的表达，图4b显示sp肽修饰的交联bpei组较未交联组和非靶头组红荧光蛋白表达增加，显示出良好的基因转染效果。利用pgl3荧光素酶报告基因对基因转染效果进行定量考察，如图4d所示，其结果与定性荧光照片一致。最后同样上述纳米粒以50微克pdna/鼠的剂量尾静脉注射到乳腺癌荷瘤裸鼠体内，2天后取出肿瘤，冰冻切片后荧光显微镜下拍摄红荧光蛋白的表达，其结果与细胞水平结果一致(图4c所示)。

实施例6

sirna同样按照上述方法，制备不同n/p比例复合形成的纳米粒，马尔文粒度仪测定其平均粒径，如表1所示，在n/p＝3时，能够形成均一的粒径(90.3±5.87nm)。

表1为各载体与sirna复合形成纳米粒的表征。

表1

实施例7

选择作用于plk1的sirna，对基因沉默效果进行考察，将制备好的纳米粒按照5微克sirna/孔的剂量给予到mda-mb-231细胞中，37度孵育4小时后分别继续培养24小时(用于qrt-pcr检测mrna表达)和48小时(用于westernblot检测plk1蛋白表达)，如图5所示，可以看到sp-crosslinkedbpei/sirna组抑制plk1mrna和蛋白的表达最明显。

实施例8

利用cy5标记的sirna示踪纳米粒的体内分布情况，按照20微克cy5-sirna/鼠的剂量尾静脉注射到乳腺癌荷瘤裸鼠体内，24小时后用小动物活体成像系统观察纳米粒的体内分布，并取出各脏器观察纳米粒的分布，结果显示sp肽修饰组在肿瘤部位的蓄积高于未修饰组(如图6所示)。

实施例9

将荷脑胶质瘤小鼠随机分为四组，每组8只，各组纳米粒按照20微克siplk1/鼠的剂量，每隔一天尾静脉注射到乳腺癌荷瘤裸鼠体内，每隔一天测量小鼠的体重和瘤体积。图7可以看出相比于游离siplk1组，交联bpei复合形成的纳米粒能明显抑制肿瘤的生长，且sp肽修饰组效果最明显，小鼠体重无明显变化。在最后一次给药后24小时，取出肿瘤，westernblot测定plk1蛋白的表达情况，如图7c所示，sp-crosslinkedbpei/siplk1组最显著的降低plk1蛋白的表达。