结合基质的纳米囊泡及其用途的制作方法
本发明要求2016年3月2日提交的美国临时专利申请62/302,626的权益，其通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及生物骨架领域，尤其涉及源自细胞外基质(ecm)的纳米囊泡及其用途。
发明背景
由细胞外基质(ecm)构成的生物骨架已被开发作为外科用网状材料，并且可被允许用于许多临床应用中，包括腹疝修复(alicuban等，hernia.2014；18(5):705-712)、肌肉骨骼重建(mase等，orthopedics.2010；33(7):511)、食管重建(badylak等，tissueengparta.2011；17(11-12):1643-50)、硬脑膜置换(bejjani等，jneurosurg.2007；106(6):1028-1033)、肌腱修复(longo等，stemcellsint.2012；2012:517165)、乳房再造(salzber,annplastsurg.2006；57(1):1-5)、其他(badylak等,actabiomater.2009；5(1):1-13)。这些材料的使用通常与至少部分恢复功能化的部位适宜的组织(称为“建构性重塑”的过程)有关。这些基于ecm的材料是最常见的异种来源(例如，用于人类宿主的猪)物质，并且可通过对源组织如真皮、膀胱(ubm)和小肠粘膜下层(sis)等去细胞化来制备。这些异源骨架并不会产生不利的先天或适应性免疫应答(badylak等，annbiomedeng.2014；42(7):1517-1527)。
确定在临床应用中的结果的因素有多种，包括手术技术、所选择的生物骨架对临床状况的适宜性、同种异体或异种组织源供体的年龄、患者的共存病症等(badylak等,annbiomedeng.2014；42(7):1517-152)。或许，结果的主要确定因素是加工这些生物骨架的方法，包括去细胞化技术、终端灭菌法和水合的状态(badylak等，annbiomedeng.2014；42(7):1517-152)。已显示出，不足的去细胞化、使用化学交联剂和缺少体内置换后适宜的机械加载有助于产生不良的结果(badylak等，annbiomedeng.2014；42(7):1517-1527；crapo等，biomaterials.2011；32(12):3233-43)。
使用特殊生物骨架的结果取决于移植后响应于最终产物(例如，后加工)的宿主组织。在诱导的与ecm有关的宿主应答的不同组分之中，部位适宜的结构性和功能性的组织重塑为血管生成、神经分布、干细胞召集、抗微生物学活性和先天免疫应答的调制(londonoandbadylak,annbiomedeng.2015；43(3):577-592)。此外，同源与异源应用之间存在明显差异。例如，由肝ecm构成的ecm生物骨架支持肝窦内皮细胞表型，而从异源组织和器官收获的ecm则不支持(sellaro等，tissueeng.2007；13(9):2301-2310)。相似地，肺ecm可促进部位适宜的干细胞分化(coriella等，tissueengparta.2010；16(8):2565-2580)。细胞与ecm之间存在明显的“串扰”，但ecm发信号并指引细胞行为的机制在很大程度上是未知的，反之亦然。仍然需要鉴定这些效应的成分和机制和利用这些效应，以便ecm可被生物操作用于特定的应用。一旦鉴定了这些成分和机制，那么就可操作这些成分和机制用于医疗装置，并且可以这种方式实施这些成分和机制以影响细胞增殖、存活和分化。
技术实现要素：
本文公开了包埋在ecm的原纤维网中的纳米囊泡。这些结合基质的纳米囊泡可使其装载物在ecm骨架的制造过程中免于降解和变性。先前已鉴定出，微米囊泡几乎仅存在于体液和细胞培养上清液中。因此，令人惊讶的是存在结合基质的纳米囊泡。这些纳米囊泡不同于其他微囊泡，因为纳米囊泡对清洁剂和/或酶消化有抗性，这些纳米囊泡包含一簇不同的microrna，并且富含mir-145。所公开的纳米囊泡不含有在其他微囊泡中发现的特征性表面蛋白质。纳米囊泡可提供独一无二的可用于生物骨架和装置中的生物学特性。
本文公开了一种组合物，其包含源自ecm的分离的纳米囊泡和药物学上可接受的载体。在某些实施方案中，纳米囊泡不表达cd63或cd81，或者为cd63locd81lo。
在另外的实施方案中，公开了分离与细胞外基质结合的纳米囊泡的方法。这些方法包括但不限于用酶消化细胞外基质，产生经消化的细胞外基质；离心所述经消化的细胞外基质以去除胶原原纤维残留，从而产生无原纤维上清液；离心所述无原纤维上清液以分离固态物料；以及将固态物料悬浮于载体中；和使用各种盐以从细胞外基质分离纳米囊泡。
在进一步的实施方案中，公开了在感兴趣的细胞外基质上诱导细胞增殖、迁移和/或分化的方法。这些方法利用了所公开的纳米囊泡。所述方法可包括将源自第二细胞外基质的分离的纳米囊泡引入至感兴趣的细胞外基质中。
在其他的实施方案中，公开了生物骨架，其包含源自细胞外基质的分离的纳米囊泡。在进一步的实施方案中，公开了医疗装置，其包含和/或包覆有源生自细胞外基质的分离的纳米囊泡。
通过以下详细描述，本发明的前述和其他目的、特征和优点将变得更加明显，参考附图进行所述详细描述。
附图说明
图1a-1c。比较来自ubm、sis或真皮以及可商购的等效物的核酸浓度。来自(a)ubm、(b)sis和(c)真皮样本的未消化和蛋白酶k或胶原酶消化的样本中每毫克干重ecm骨架的总核酸和双链dna的浓度。通过由260nm处的uv吸光度测定总核酸浓度。由picogreen双链dna定量试剂测定双链dna浓度。由标准偏差描述分离与分离之间的差异。数据以平均数±标准差(s.d)表示，每个样本中，n＝3个分离。
图2a-2d。去细胞化的ecm骨架的酶消化释放小rna分子。(a)rnasea处理的、dnasei处理的或未处理的从未消化的ubm(对照)和蛋白酶k或胶原酶消化物中提取的核酸的琼脂糖凝胶电泳。(b)描述在dnasei处理前(上幅)和后(下幅)从胶原酶消化的ubm中提取的核酸的小rna模式(pattern)的电泳图。(c)描述在dnasei处理后来自胶原酶消化的样本的小rna模式的电泳图。(d)生物骨架中的小rna分子受保护而免受核酸酶降解。
图3a-3f。ecm包埋的纳米囊泡的鉴定。鉴定了圆形结构的锇染色阳性的水合ubm的tem成像(a)。用胃蛋白酶进行的酶消化导致部分消化，因为mbv陷于纤维内。用胶原酶或蛋白酶k进行的完全消化导致mbv与ecm纤维的完全分离，这在tem成像中是明显的(b)。来自三种可商购和实验室生产的产品的蛋白酶-k消化的ecm(100mg)(c)揭示了在所有样本中存在包埋于ecm内的mbv。采用ecm产物的sds凝胶电泳银染色评价mbv蛋白货物标记。每个样本的蛋白标记不同(d)。对两种核外表面标记物cd-63和cd-81进行western印记分析。与人骨髓来源的间质干细胞和人血清对照相比，表达水平不可检测(e)。经nanosight确认mbv尺寸。颗粒尺寸与mbv一致(f)。数据以平均值±标准差(s.d)表示，n＝1。
图4a-4c。小rna测序数据揭示了纳米囊泡内存在mirna以及在商品化的产品与平行的实验室制备的产品之间存在共同的mirna(a)。独创路径分析(ipa)揭示了不同的细胞功能路径(例如，细胞周期、细胞死亡和细胞生长)可包括在所鉴定的mirna中，与(b)相关。
图5a-5f。c2c12中的纳米囊泡摄取(a)。采用n1e-115细胞的神经突(neurite)延伸测定(b)。pvsc(n＝3)在影响其移动性的形态学上具有显著变化，如通过划伤测定看到的(c)。使用血细胞计数器量化观察到的细胞数的增加(d)。分离自ubm生物骨架的纳米囊泡促进结构性的m2巨噬细胞表型。(e)骨髓分离自c57b1/6小鼠并在补充有巨噬细胞集落刺激因子(mcsf)的培养基中培养以获得巨噬细胞。巨噬细胞用20ng/mlifnγ和100ng/mllps(获得m1巨噬细胞)、20ng/mlil-4(获得m2巨噬细胞)和5μg/ml的(蛋白质/体积)来自ubm源的分离的外泌体处理。固定巨噬细胞并对泛巨噬细胞标记物(f4/80)，以及m1(inos)和m2(fizz1)表型的强指示剂进行免疫标记。纳米囊泡处理的巨噬细胞主要为f4/80+fizz1+表明m2“样”表型。(f)通过ubm外泌体转导改变thp-1中的基因表达。a:用ubm分离的外泌体转导thp-1(n＝3)，24小时后通过qpcr评价m1和m2相关标记物(inos、tnfa、stat1、stat2、stat5a、stat5b、irf3、irf4、irf5、il1rn、cd206、tgm2、stat3、stat6、klf4、pparg)的基因表达。所有上述实验中的纳米囊泡暴露剂量为50μg/ml(蛋白质/体积)。
图6。显示在不同来源的深度测序中mir-145p的读取的表格。除了在与细胞外基质(纤维母细胞)有关的那些外泌体中，mir-145p不在来自血浆、尿、细胞培养物或细胞的外泌体中高度表达。其在不同部分的所有组织以及分离自细胞外基质骨架的外泌体中表达。将let-7b-5p的存在作为对照。参考文献为huang等人的bmcgenomics.2013；14:319.doi:10.1186/1471-2164-14-319；ben-dov等人的plosone.2016；11(1):e0147249.doi:10.1371/journal.pone.0147249；ji等人的plosone.2014；9(10):e110314.doi:10.1371/journal.pone.0110314；stevanato等人的plosone.2016；11(1):e0146353.doi:10.1371/journal.pone.0146353；kuchen等人的immunity.2010；32(6):828-839.doi:10.1016/j.immuni.2010.05.009。
图7。在不同组织和细胞系中的mir-145表达谱。mir-145在正常组织中高度表达。其在肿瘤中表达程度较低。其不在t或b细胞肿瘤中表达，也不在特定的细胞系中表达。示出了seqidno:1。
图8a和图8b。示出另外的分离方法的示意图。实施例7中提供了该方法的其他细节。
图9a和9b。a.kcl分离。kcl的添加允许用超速离心法从ecm分离结合基质的纳米囊泡(mbv)，然而，当增加kcl浓度时未见差异或益处(ns＝无显著差异，*＝p<0.05)。b.将0.2mkcl添加至pbs而被分离的mbv的tem。
图10。rna定量。对于由三种不同方法分离的结合基质的纳米囊泡(mbv)，在rnase处理前后对rna用量进行定量。当使用蛋白酶k(基于酶)和kcl(盐分离)时，mbv的量无差异，但当使用胶原酶时则产量更大。
图11a-11b。盐和超滤。a.将用胶原酶0.1超速离心(uc)分离的mbv的数量与用kcl分离的mbv的数量比较，二者都采用uc和超滤(uf)。然后，用0.1mg/ml的胶原酶消化暴露于0.8mkcl后的沉淀的(pelleted)ecm，显示kcl处理后在ecm中仍有mbv。kcl和超滤产生的mbv产量最高，是其他方法的4倍。在括号中的是ecm物料的起始用量。b.经nanosight测量的用0.8mkcl和超滤分离的mbv的颗粒尺寸分布显示颗粒大小为10-300nm。
图12a-12b。kcl的作用。a.通过将ecm再悬浮于水、pbs和具有增加浓度的kcl的pbs中来分离mbv。采用超滤法分离最终的微丸(pellet)。mbv可以用pbs和含有kcl的pbs分离，然而，将ecm再悬浮于水pbs中不会产生任何mbv。b.通过将ecm再悬浮于pbs、kh2po4缓冲液和含有0.4mkcl的kh2po4缓冲液中来分离mbv。将pbs分离的mbv悬浮于pbs和水中，mbv的量相同，表明mbv在水中有活力且不会在水中破裂。用kh2po4缓冲液本身无法分离出mbv，然而，添加了kcl则可产生mbv，表明正是盐的添加形成分离。
图13a-13b。暴露于胶原酶和kcl分离的mbv(每毫升30和60μl)24小时后骨髓源性巨噬细胞的基因表达。胶原酶分离的mbv和kcl分离的mbv示出了相似的基因表达谱a。然而，胶原酶分离的mbv示出了更高的arg和inos表达b。
图14a-14d。源自ecm生物骨架的mbv抑制胶质瘤细胞活力。通过处理24小时后的mtt测定来确定ecm可溶部分或mbv对细胞活力的影响。高级原代人胶质瘤细胞(a)、低级原代人胶质瘤细胞(b)、人小神经胶质细胞(c)和神经祖细胞(d)。
图15。ecm生物骨架的可溶部分和源自ecm生物骨架的mbv抑制食管癌细胞活力。mtt测定评估了癌细胞活力。
图16a-16c。(a)用0.1mg/ml胶原酶溶液对100mg粉末化的ubm-ecm和sis-ecm进行16小时的消化。然后，对所得到的降解产物进行逐级离心以分离mbv。然后，通过透射电子显微镜，以100,000倍的放大倍数对所得到的纯化的mbv进行成像。(b)采用exo-glow标记分离的mbv的核酸含量。然后，标记的颗粒与骨髓源性巨噬细胞温育4小时并采用荧光显微镜成像。在无细胞存在的情况下使用标记的mbv作为对照建立暴光时间。(c)显示响应于处理的基因表达倍数变化的典型热图。用1ml的培养基以及以下之一处理细胞：(1)促进mifng+lps表型(m1-样)的20ng/mlifnγ和100ng/mllps，(2)促进mil-4表型(m2-样)的20ng/mlil-4，(3)促进mecm表型的250μg/mlubm或sis-ecm，或者(4)促进mmbv表型的25μg/mlubm-mbvs或sis-mbv。将胃蛋白酶(1mg/ml)和胶原酶(0.1mg/ml)分别作为ecm和mbv的基准对照。
图17。从c57bl/6小鼠收获骨髓源性巨噬细胞，并使之成熟为巨噬细胞。然后，用以下条件之一处理细胞：(1)促进mifng+lps表型(m1-样)的20ng/mlifnγ和100ng/mllps，(2)促进mil-4表型(m2-样)的20ng/mlil-4，(3)促进mecm表型的250μg/mlubm或sis-ecm，或者(4)促进mmbv表型的25μg/mlubm-mbvs或sis-mbv。将胃蛋白酶(1mg/ml)和胶原酶(0.1mg/ml)分别作为ecm和mbv的基准对照。然后，将细胞用pbs洗涤并用2％多聚甲醛固定45分钟。采用鼠特异性一抗和荧光团缀合的二抗定量地评价靶蛋白表达。将f4/80作为泛巨噬细胞标记物，将tnfa和inos作为m1-样标记物，以及将精氨酸酶作为m2-样标记物。采用同种型和适宜的细胞因子对照以及维持的恒定通量建立暴光时间。
图18a-18c。mbv处理优于ecm对bmdm功能测定的影响。将巨噬细胞暴露于mcsf对照、250mg/mlecm、25mg/mlmbv或细胞因子对照ifng+lps或il-4中24h。(a)将巨噬细胞与1％磺胺在5％磷酸中混合10分钟，然后加入水中的0.1％n-1-萘基乙二胺(ned)二盐酸化物。在分光光度计中在540nm处读取溶液，并与硝酸钠的标准曲线比较以评估氮氧化物产生水平。(b)经处理的巨噬细胞与vybrantphagocytosiskitfitc标记的e.coli珠温育2小时。固定细胞并用dapi染色。采用荧光显微镜可视化细胞，并采用cellprolifer软件定量细胞的平均荧光强度。(c)用250mg/mlecm、25mg/mlmbv或细胞因子对照ifnγ+lps或il4处理巨噬细胞18小时。所有经处理的细胞用pbs洗涤并用无血清、无抗生素培养基温育5小时。收集含有巨噬细胞的分泌产物的培养基，并以1：10的比例与胰蛋白酶大豆液体培养基和1x104cfu/mls.aureus一起使用。通过测量在570nm处的吸光度来评价细菌生长。(值：平均吸光度±标准偏差，n＝4，*p<0.05)。
图19a-19e。巨噬细胞mirna抑制。(a-c)各采用50nm抑制剂对特定mirna，mirna-145-5p、mirna-145-3p和mir-125-b-5p进行的选择性抑制。通过taqmanmirnaqpcr测定确定进行抑制后的mirna相对丰度的水平。(d)采用qpcr来评价暴露于mbv或用杂乱的(scrambled)对照mirna抑制剂、mmu-mirna-145-5p抑制剂、mmu-mir-143-3p抑制剂、mmu-mir-125-5p抑制剂或者所有这三种抑制剂的组合转染的细胞的基因表达分析。采用tree-view软件以热图的形式呈现结果；所有的倍数变化参考培养基对照。scalebar评分系统说明如下：小于0.1倍变化(-3)，0.1-0.29倍变化(-2)，0.3-0.69(-1)，0.7-1.29(0)，1.3-1.9(+1)，2.0-4.9(+2)，大于5.0(+3)。(e)bmdm暴露于50nm的以下之一4h：杂乱的对照、mmu-mir-125b-5p抑制剂、mmu-mir-143-3p抑制剂、mmu-mir-145-5p，或所有三种的组合(混合)。然后，将处理培养基改为正常的生长培养基又18小时。然后，用4％pfa固定细胞。然后，将细胞与m1-样表型tnfα和inos的标记物，或m2-样表型fizz1和精氨酸酶1的标记物的抗鼠抗体温育。基于阴性同种型对照和细胞因子处理的对照建立暴光时间，并且每个测试的标记物的暴光时间保持恒定。用dapi染色细胞核。图像以200x放大倍数拍摄。结果显示mirna抑制能够影响若干所探测的蛋白质的表达，这暗示了mir-125b-5p、mir-143-3p和mir-145-5p在mmbv表型的形成中起的作用。
发明详述
细胞外囊泡(ev)在1967年由电子显微镜首次鉴定为血小板的产物(wolf,brjhaematol.1967；13:269-288；hargett等人pulmcirc.2013；3(2):329-40)，是细胞内通信的有效载体，这是由于其具有转移rna、蛋白质、酶和脂质，从而影响各种生理和病理过程的能力。ev的产生和释放在原核和真核生物体中都是进化保守的，从而强调了囊泡介导的过程在细胞生理学上重要性(deatherageandcookson，infectimmun.2012jun；80(6):1948–1957)。ev是纳米级的，结合基质的囊泡直径为50-1,000nm，根据其尺寸、起源和释放模式分类为三种主要的组：纳米囊泡、外泌体和凋亡小体(nawaz等人natrevurol.2014；11(12):688-701；vanderpol等人pharmacolrev.2012；64(3):676-705)。
ev在各种生理条件下由各种不同的细胞类型分泌并且已在包括唾液、尿、鼻及支气管灌洗液、羊水、母乳、血浆、血清和精液的生物流体中鉴定了ev(yanez-mo等人jextracellvesicles.2015；4:27066)。尽管已经在体液和细胞培养上清液中鉴定了ev，但通过粘附分子，如icam-1和整合素，如αm整合素与β2整合素的存在，ev能够锚固到ecm成分上(escola等j.biol.chem.1998；27320121–20127；thery等j.cellbiol.1999；147:599–610；thery等j.immunol.2001；166:7309–7318)。
“基质囊泡”还显示为选择性地锚固至骨、软骨和前牙本质的基质上(anderson,jcellbiol.1969；41:59-72；anderson,currrheumatolrep.2003；5:222-226)。更适宜地描述为钙化囊泡，这些膜纳米颗粒为软骨细胞、成骨细胞和成牙质细胞的产物，并且已显示作为在所有骨骼组织中钙化的初始部位(anderson,clinorthoprelatres.1995；(314):266-80)。然而，基质囊泡是否会类似于外泌体和微囊泡参与细胞内信号传导尚不清楚(sharpiro等bone.2015；79:29-36)。本文公开了在软组织的间质基质并且特别是在非细胞生物骨架的基质即细胞外基质(ecm)内紧密结合的纳米囊泡的惊人发现。通过去除来源组织(诸如膀胱、真皮和小肠黏膜下层)的细胞(去细胞化)来制备这些生物骨架，所述去除采用专门设计用于裂解/破裂细胞膜并随后去除细胞碎片的方法。这些纳米囊泡可用于再生医学和组织工程策略中(dejong等frontimmunol.2014；5:608；malda等natrevrheumatol.2016(epubaheadofprint)；lamichhane等tissueengpartbrev.2015；21(1):45-54)。除了它们在组织修复中的潜在治疗用途之外，被调节的释放物的组成、货物和机制为作为检测生理和病理过程的诊断和预后生物标志物以监测生理和病理过程的效用提供了新的提示(implication)。
本文公开了将纳米囊泡，特别是外泌体，包埋在实验室产生的ecm生物骨架和可商购的ecm生物骨架内并且与其结合。确定这些囊泡的内容物，并且记载了，它们差异性地影响具体的靶细胞。所公开的研究记载了，包括这些源自ecm的纳米囊泡的药物组合物还可用于工程化生物骨架和医疗装置。这些药物组合物还可用于靶向特定靶细胞群的生长、迁移和其他生物学特性。
术语
除非另有所指，可根据常规用法使用技术术语。可在以下文献中找到分子生物学中一般术语的定义：oxforduniversitypress出版的benjaminlewin,genesv,1994(isbn0-19-854287-9)；kendrew等(编辑),blackwellscienceltd.出版的theencyclopediaofmolecularbiology,1994(isbn0-632-02182-9)；和vchpublishers,inc.出版，roberta.meyers(编辑),molecularbiologyandbiotechnology:acomprehensivedeskreference，1995(isbn1-56081-569-8)。
为了对本发明各个实施方案进行评述，下面提供了对特定术语的解释。
施用：通过所选择的途径将组合物引入受试者中。所述途径可以是局部的或全身的。例如，如果所选择的途径是静脉注射，那么通过将组合物引入至受试者的静脉中来施用组合物。如果所选择的路线是局部的，那么可通过将组合物引入至组织中来施用组合物。
改变：感兴趣的物质(如细胞、多核苷酸或多肽)的有效量或性质的统计学显著变化。该变化可以是增加或降低。改变可以是体内或体外的改变。在若干实施方案中，改变物质的有效量为使物质的有效量(水平)、细胞的增殖和/或存活或蛋白质如酶的活性增加或降低至少大约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
腺癌：一种恶性肿瘤，其可发生在身体的若干部分。它是上皮组织肿瘤，具有腺起源、腺特征或二者兼有。
细胞凋亡：一种程序化的细胞死亡过程，其发生在多细胞有机体中。细胞凋亡包括特征性细胞变化(形态)和死亡。这些变化包括起泡、细胞萎缩、核碎裂、染色体凝结、染色体dna碎裂和总mrna衰减。
生物相容的：任何材料，当被移植入哺乳动物受试者中时，其不会在受试者中引起不良响应。当被引入至个体中时，生物相容材料能够执行预期的功能，对该个体无毒或无害，也不会引起对受试者中材料的免疫排斥。
生物骨架：一种生物相容的骨架，通常为固体支撑物或凝胶。
癌症：一种已经经历具有分化缺失、生长速率增加、侵入周围组织的特征性间变的并且能够转移的良性或恶性肿瘤。例如，甲状腺癌是一种发生在或发生自甲状腺组织中的肿瘤，而食管癌是一种发生在或发生自食管组织中的肿瘤。残留癌为给予受试者以减少或根除癌症的任何形式的治疗之后仍残留在受试者中的癌症。转移癌为位于体内一个或多个部位而不是位于衍生转移癌的原始(原发)癌的初始部位的肿瘤。癌症包括但不限于实体瘤。
cdna(互补dna)：没有内部的非编码的区段(内含子)和确定转录的调控序列的一段dna。cdna是在实验室中通过逆转录提取自细胞的信使rna合成的。cdna还可包含负责相应rna分子中的翻译控制的非翻译区(utr)。
离心：对混合物施加离心力的过程，从而混合物的更致密的组分相对于混合物中其他较不致密的组分从离心机的轴心迁移。施加至混合物的力是离心转子的速度与旋转半径的函数。在大多数应用中，旋转力会导致沉淀物(微丸)聚集在离心管的底部，其中剩余溶液可恰当地称为“上清液”或“上层清液”。在其他相似的应用中，基于密度的分离或“梯度离心”技术可用于将具体的种(species)与含有比所需组分更致密和较不致密的组分的混合物分离。
在离心转子的圆周运动期间，施加的力是旋转的半径和角速度的乘积，其中，传统上，力表达为相对于“g”(由于地球表面重力引起的标准加速度)的加速度。施加的离心力称为“相对离心力”(rcf)，并且以“g”的倍数表达。
化疗；化疗剂：如本文所使用，在以异常细胞生长为特征的疾病的治疗中有治疗有效性的任意化学试剂。这种疾病包括肿瘤、赘生物和癌症以及以增生性生长为特征的疾病如牛皮癣。在一个实施方案中，化疗剂为在治疗赘生物如实体瘤中使用的试剂。在一个实施方案中，化疗剂为放射性分子。本领域技术人员可容易地鉴定使用的化疗剂(例如，参见slapak和kufe,principlesofcancertherapy,chapter86inharrison'sprinciplesofinternalmedicine,14thedition；perry等chemotherapy,ch.17inabeloff,clinicaloncology2nded.,
接触：以直接物理关联放置。包括以固体和液体形式。
细胞因子：术语“细胞因子”被用作可溶性蛋白质和多肽的多样性组的总称，所述可溶性蛋白质和多肽在纳摩尔或皮摩尔浓度下作为体液调节剂发挥作用，并且可在正常或病理条件下调节各个细胞和组织的功能活性。这些蛋白质还可直接介导细胞之间的相互作用，并且调节在细胞外环境中发生的过程。细胞因子的示例包括但不限于肿瘤坏死因子-α、白介素(il)-6、il-10、il-12、转化生长因子和干扰素-γ。
简并变体：一种编码多肽如pdgf多肽的多核苷酸，该多核苷酸包括由于遗传密码而简并的序列。有20种天然氨基酸，其中大部分由多于一个的密码子指定。因而，只要由核苷酸序列编码的多肽的氨基酸序列未变，就包括所有简并的核苷酸序列。
分化(differentiation)：是指相对未专门化的细胞(例如，胚胎细胞)获得成熟细胞特有的专门化的结构和/或功能特征的过程。相似地，“分化(differentiate)”即是指该过程。通常，在分化期间，细胞结构和功能能力改变，并且出现组织特异性蛋白质和非蛋白质分子。
dna(脱氧核糖核酸)：dna是一种长链聚合物，其包括大多数活的有机体的遗传物质(某些病毒具有包括核糖核酸(rna)的基因)。dna聚合物中的重复单元为4种不同的核苷酸，其中每个核苷酸包括与脱氧核糖结合的四种碱基腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)和胸腺嘧啶(t)之一，所述脱氧核糖附着有磷酸基团。核苷酸的三联体(称为密码子)编码多肽中各个氨基酸或者终止信号。术语密码子也用于dna序列转录成的mrna中的三个核苷酸的对应(和互补)序列。
除非另有所指，dna分子的任何参考旨在包括dna分子的反向互补链。除了本文文本所要求的单链，dna分子尽管只描述单链，但仍包含双链dna分子的两条链。因此，编码特异性蛋白质或其片段的核酸分子的参考包含有义链和其反向互补链。例如，从所公开的核酸分子的反向互补序列产生探针或引物是适宜的。
富集：一种过程，其中与富集前相比，在富集过程之后，混合物中感兴趣的组分如纳米囊泡的量与混合物中其他不期望的组分的量的比值增加。
细胞外基质(ecm)：一种结构和功能生物分子和/或生物大分子的复杂混合物，所述结构和功能生物分子和/或生物大分子包括但不限于围绕并支持组织内的细胞的结构蛋白、特化蛋白、蛋白聚糖、葡糖氨基葡聚糖和生长因子，并且除非另有所指，ecm是无细胞的。ecm制剂可被认为是“去细胞的”或“无细胞的”，意指细胞通过本文描述且本领域公知的过程已经从源组织中去除。“源自ecm的物质”，如“源自ecm的纳米囊泡”，“结合基质的纳米囊泡”或“源自ecm的纳米囊泡”是由天然ecm或由体外来源制备的纳米囊泡，其中ecm由培养的细胞产生并包含一个或多种聚合物组分(成分)。下面对源自ecm的纳米囊泡进行了定义。
表达的：将核酸序列翻译为蛋白质。蛋白质可表达并保留在细胞内，成为细胞表面膜的组分，或分泌至细胞外基质或介质中。
表达控制序列：调节与其可操作连接的异源核酸序列的核酸序列。当表达控制序列控制和调节核酸序列的转录并且，如果适当，控制和调节翻译时，表达控制序列可以可操作地与核酸序列连接。因此，表达控制序列可包括适当的启动子、增强子、转录终止子、蛋白质编码基因前的起始密码子(atg)、内含子的剪接信号(保持该基因的正确阅读框以允许mrna的翻译)以及终止密码子。术语“控制序列”最低限度旨在包括其存在会影响表达的组件，还可包括其存在是有益的另外的组件，例如，前导序列和融合伴侣序列。表达控制序列可包括启动子。
凝胶：一种处于液体与固体之间的物质状态，一般定义为在液体介质中膨胀的交联聚合物网络。通常，凝胶为含有固体和液体两者的两相胶质分散体，其中，固体的量多于称为“溶胶”的两相胶质分散体中的固体的量。如此，“凝胶”具有一些液体的性质(即，形状是能复原且可形变的)和一些固体的性质(例如，形状足够离散以在二维表面保持三维)。“凝胶化时间”，也称为“凝胶时间”，是指组合物在适度的应力下变为不可流动所用的时间。
胶质瘤：一种源于神经胶质细胞的肿瘤。胶质瘤包括室管膜瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、脑干神经胶质瘤、视神经胶质瘤和混合型胶质瘤。胶质瘤可以通过分级表征。世界卫生组织(who)将胶质瘤分类为i-iv等级。低等级胶质瘤(whoii级)分化良好(非退行性发育)，体现出良性趋势并且一般预后较好。然而，其可复发并且等级随时间增加，所以它们可被分类为恶性的。高等级(whoiii-iv等级)的胶质瘤是未分化的或是退行性发育的。高等级胶质瘤是恶性的且预后较差。胶质瘤是幕上的(在小脑幕上方、在大脑内，并且多在成年人中发现)、是幕内的(inratentorial)(在小脑幕下方、在小脑内，并且多在儿童中发现)，或者是脑桥的(位于脑干的脑桥中)。胶质瘤的症状取决于肿瘤是否位于中枢神经系统内。脑胶质瘤的症状是头疼、呕吐、癫痫和脑神经障碍。视神经胶质瘤的症状是视力丧失。脊髓胶质瘤的症状是疼痛、虚弱或四肢麻木。一般地，胶质瘤可经通过脑脊髓液扩散并可引起“掉落转移”至脊髓中。
生长因子：一种促进细胞生长、存活和/或分化的物质。生长因子包括功能为生长刺激物(促细胞分裂剂)的分子、功能为生长抑制剂的分子(例如，负生长因子)、刺激细胞迁移的因子、功能为趋化剂或抑制细胞迁移或肿瘤细胞侵入的因子、调节细胞分化功能的因子、参与细胞凋亡的因子或促进细胞的存活但不影响生长和分化的因子。生长因子的示例为纤维原细胞生长因子(如fgf-2)、表皮生长因子(egf)、睫状神经营养因子(cntf)和神经生长因子(ngf)和肌动蛋白a。
抑制(或治疗)疾病：抑制疾病或病症的完全发展或加速康复。“治疗“是指疾病或病理状况开始发展后改善其标志或症状的治疗性干预。如本文所使用，参照疾病或病理状况，术语“改善”是指任意可观察到的有益治疗效果。有益效果可通过以下得到证实，例如，可通过易感的受试者中疾病的临床症状的延迟发作，减少疾病的某些或全部临床症状(如疼痛)的严重程度，缩短恢复时间或改善受试者的总体健康或幸福感，或者通过本领域公知的特定于具体疾病的其它参数。
分离的：“分离的”生物学组分(如核酸、蛋白质细胞或纳米囊泡)已经基本上与有机体的细胞或ecm(所述组分天然存在于其中)中的其它生物组分分离或纯化。已经“分离的”核酸和蛋白质包括由标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。已经分离的纳米囊泡是从ecm的纤维材料移出的。该术语还涉及(embrace)通过在宿主细胞中进行重组表达制备的核酸和蛋白质以及化学合成的核酸。
标签：一种可检测化合物或组合物，其可直接或间接与另一分子如抗体或蛋白质缀合，或者可包含在纳米囊泡中，或者附着于纳米囊泡，以便于检测。标签的特定的非限制性示例包括荧光标记、酶促连接、放射性同位素。
巨噬细胞：一类可吞噬且降解细胞碎片、外源物质、微生物和癌细胞的白血细胞。除了在吞噬中起的作用之外，这些细胞在发育、组织保持和修复中以及在先天和适应性免疫中起重要作用，即，这些细胞可募集并影响包括免疫细胞如淋巴细胞在内的其他细胞。巨噬细胞可以许多表型中存在，包括称为m1和m2的表型。主要发挥促炎性功能的巨噬细胞称为m1巨噬细胞(cd86+/cd68+)，而减少炎症以及促进和调节组织修复的巨噬细胞称为m2巨噬细胞(cd206+/cd86+)。鉴定各种类型的巨噬细胞的标记物在不同物种间会有不同。应注意的是由范围在m1和m2的极值之间的谱表示巨噬细胞表型。
哺乳动物：该术语包括人和非人哺乳动物。类似地，术语“受试者“包括人和兽医学受试者。
转移：癌症在身体的一个位置扩散到另一个位置。转移可通过一系列复杂的步骤发生，其中癌细胞离开原始肿瘤部位并经血流、淋巴系统、脑脊髓液或者通过延伸进行迁移。
microrna：一种小的非编码rna，其长度为大约17至大约25个核苷酸碱基，其通常地通过抑制目的mrna翻译来对基因表达进行转录后调节。mirna的功能可以是负调控因子，这样更大量的特定mirna会与较低水平的目的基因表达相关。有三种形式的mirna，初级mirna(pri-mirna)、成熟前mirna(pre-mirna)和成熟mirna。初级mirna(pri-mirna)表达为大约几百个碱基至超过1kb的茎-环结构的转录物。pri-mirna转录物通过称为drosha的rnaseii内切酶在细胞核中裂解，该内切酶裂解茎环的基部附近的茎的两条链。drosha采用交错切割裂解rna双链体，留下5’磷酸和在3’端悬垂的2个核苷酸。裂解产物成熟前mirna(pre-mirna)长度为大约60至大约110个核苷酸，具有以向后折叠方式形成的发卡结构。pre-mirna由ran-gtp和exportin-5从细胞核转运至细胞质中。通过另一个称为dicer的rnaseii内切酶在细胞质中进一步加工pre-mirna。dicer识别5’磷酸酯和3’悬垂物，并在茎-环联接处切掉环以形成mirna双链体。mirna双链体与rna诱导的沉默复合体(risc)结合，其中优先降解反义链，同义链成熟mirna指引risc至其靶向位点。成熟mirna是mirna的生物学活性形式，长度为大约17至大约25个核苷酸。
纳米囊泡：一种细胞外囊泡，具有大约10至大约1,000nm直径的纳米颗粒。纳米囊泡是结合脂质膜的颗粒，其在其他分子间运送生物学活性的信号传导分子(例如，microrna、蛋白质)。一般地，纳米囊泡被脂质双分子层限制，生物分子封闭和/或包埋在双分子层中。因此，纳米囊泡包括由质膜包围的内腔。不同类型的囊泡可根据直径、亚细胞起源、密度、形状、沉降率、脂质组成、蛋白质标记物、核酸含量和起源(如来自细胞外基质或分泌的)来区分。纳米囊泡可由其起源如来自ecm(参照上文)的结合基质的纳米囊泡和/或mir含量来鉴定。
“外泌体”是一种膜囊泡，由细胞分泌，直径为10至150nm。一般地，晚期核内体或多囊泡体含有腔内囊泡，这些腔内囊泡是由有限的内体膜囊泡向内萌芽和断裂至这些封闭的纳米囊泡内形成的。然后，在与质膜融合的胞吐期间，这些腔内囊泡从多囊体内腔壁释放至细胞外环境，通常是释放至体液中，如血液、脑脊髓液或唾液。当一段膜内陷并被胞吞时，在细胞内产生外泌体。内化的区段破碎为较小囊泡且最终从细胞排出，其含有蛋白质和rna分子，如mrna和mirna。源自血浆的外泌体大多缺乏核糖体rna。源自细胞外基质的外泌体包括特异性mirna和蛋白质组分，且已被证明存在于几乎每种体液中，如血液、尿、唾液和脑脊髓液。
“来源于ecm的纳米囊泡”、“结合基质的纳米囊泡”或“源自ecm的纳米囊泡”为结合膜的颗粒，大小为10nm至1000nm，存在于细胞外基质中，含有生物学上活性的信号传导分子，如影响细胞行为的蛋白质、脂质、核酸、生长因子和细胞因子。术语是可互换的，是指相同的囊泡。这些纳米囊泡包埋在ecm中且与其结合，并不仅仅是附着于表面。这些纳米囊泡对严苛的分离条件有抗性，如冻融、用蛋白酶(如胃蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、蛋白酶k)和胶原酶消化，和用洗涤剂消化。一般地，这些纳米囊泡富含mir-145，且任选地富含mir-181、mir-143和mir-125。这些纳米囊泡不表达cd63或cd8d1，或者表达几乎不可检测水平的这些标记物(cd63locd81lo)。ecm可以是来自组织的ecm，可以由培养物中的细胞产生，或者可以从商业来源购买。
核酸：一种由经磷酸二酯键连接的核苷酸单元(核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其相关的天然存在的结构变体及合成的非天然存在的类似物)构成的聚合物，其相关的天然存在的结构变体及合成的非天然存在的类似物。因此，该术语包括核苷酸聚合物，其中核苷酸和在核苷酸之间的连接包括非天然存在的合成的类似物，例如但不限于，硫代磷酸酯、磷酰胺、甲基磷酸酯、手性甲基磷酸酯、2-o-甲基核糖核苷酸、肽核酸(pna)等。例如，可以采用自动化dna合成器来合成这种多核苷酸。术语“寡核苷酸”通常是指短的多核苷酸，一般不超过大约50个核苷酸。应理解的是当由dna序列(例如，a、t、g、c)表示核苷酸序列时，还包括rna序列(例如，a、u、g、c)，其中“u”替换“t”。
本文采用常规的记号来描述核苷酸序列：单链核苷酸序列的左手端是5‘端；双链核苷酸序列的左手方向称为5’方向。将核苷酸添加至新生的rna转录物的5’至3’的方向称为转录方向。具有与mrna相同的序列的dna链称为“编码链“。核酸序列上位于5’至目的序列的序列称为”上游“序列；核苷酸序列上位于3’至目的序列的序列称为”下游序列“。
“编码”是指多核苷酸如基因、cdna或mrna中的特定核苷酸序列的固有性质，作为模板用于合成生物过程中的其他聚合物和大分子，所述聚合物和大分子具有确定的核苷酸序列(例如，rrna、trna和mrna)或确定的氨基酸序列和由其产生的生物特性。因此，如果有基因产生的mrna的转录和翻译可在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。其核苷酸序列与mrna序列相同且一般由序列表提供的编码链和作为基因或cdna转录的模板的非编码链可称为编码蛋白质或该基因或cdna的其他产物。除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此是简并版本且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和rna的核苷酸序列可包括内含子。
“重组核酸“是指具有不是天然(如在野生型基因中)连接在一起的核苷酸序列的核酸。其包括核酸载体，所述核酸载体包含可以用于转化适宜宿主细胞的扩增或组装的核酸。在一个示例中，重组核酸为一种核酸，其具有非天然存在的序列或具有通过人工组合两个分离序列区段制成的序列。该人工组合通常由化学合成，或者更通常地通过人工操作分离的核酸区段，如通过基因工程技术来完成。包括重组核酸的宿主细胞称为“重组宿主细胞”。重组核酸也具有非编码功能(如启动子、复制起点、核糖体结合位点等)。
如果其序列为第一序列的多核苷酸与其序列为第二序列的多核苷酸特异性杂交，则第一序列相对于第二序列是“反义的”。因此，这两个序列互补。
可操作连接：当第一核酸序列与第二核酸序列以功能关系放置时，第一核酸序列与第二序列可操作连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作连接。一般地，可操作连接的dna序列是连续的，必要时，在同一阅读框中加入两个蛋白质编码区。
药物学上可接受的载体：所使用的药物学上可接受的载体是常规的。e.w.martin的remington’spharmaceuticalscience,mackpublishingco.,easton,pa,15thedition,1975中描述了适用于本文公开的融合蛋白的药物递送的组合物和配制物。
一般地，载体的性质将取决于所采用的施用的具体模式。例如，胃肠外配制物一般包含作为载剂的可注射流体，所述可注射流体包括药物学上和生理学上可接受的流体，如水、生理盐水、平衡的盐溶液、水性右旋糖、丙三醇等。对于固体组合物(例如，粉末、丸粒、片剂或胶囊形式)，常规的非毒性固体载体可包括，例如，药物学等级的甘露醇、淀粉或硬脂酸锰。除了生物学上中性的载体，待施用的药物组合物可包含少量的非毒性辅助物质，如润湿或乳化剂、防腐剂和ph缓冲剂等，例如，醋酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
聚合物：由重复分子单元组成的分子，包括均聚物、嵌段共聚物、无规共聚物和接枝共聚物(graftcopolymer)。“聚合物”还包括线性聚合物以及支链聚合物，支链聚合物包括高度支链的、树状和星型聚合物。“聚合引发剂”是指可通过自由基生成引发单体或大分子聚合的任意物质或刺激物。示例性聚合引发剂包括电磁放射物、热和化学化合物。
多肽：氨基酸的任意链，无论长度或翻译后修饰(如糖基化或磷酸化)。“残基”是指通过酰胺键或酰胺键模拟物包含在多肽中的氨基酸或氨基酸模拟物，“残基”的位置表明其在氨基酸序列中的位置。多肽具有氨基末端(n末端)和羰基末端。
多肽中的保守性取代是一种修饰，以不会导致多肽的生物或生物化学功能发生变化或损失的具有相似生物化学性质的氨基酸取代一个或多个氨基酸称为“保守性”取代。这些保守性取代很可能对产生的蛋白质的活性有最小的影响。表1中示出了可取代蛋白质中原始氨基酸且被称为保守性取代的氨基酸。
可在多肽中进行一个或多个保守性变化，或至多10个保守性变化(如2个取代氨基酸、3个取代氨基酸、4个取代氨基酸或5个取代氨基酸等)而不改变蛋白质(如生长因子或细胞因子)的生物化学功能。
预防或治疗疾病：“预防”疾病是指，例如，在已知具有疾病如癌症的倾向的人中抑制疾病的部分或完全发展。具有已知倾向的人的示例为家族中有乳腺癌病史的人，或者暴露于使受试者易患某病症如黑色素瘤的因素中的人。“治疗”是指在疾病已经开始发展后改善疾病标志或症状或病理状况的治疗性干预。在若干实施方案中，治疗是指减小肿瘤的大小，减少转移瘤的数量和/或大小，或减少肿瘤的症状。
增殖：细胞分裂，从而其数量增加。细胞分裂的过程称为有丝分裂。
启动子：启动子为核酸控制序列的阵列，该阵列指引核酸的转录。启动子包括转录起始位点附近的必要核酸序列，如tata元件(聚合酶ii型启动子的情况)。任选地，启动子还包括远端增强子或抑制子元件，它们可位于距离转录起始位点多达几千碱基对处。包括组成型和可诱导启动子二者(参见，例如，bitter等的methodsinenzymology153:516-544,1987)。
启动子的特定的且非限制性示例包括源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或者来自哺乳动物病毒的启动子(例如，逆转录病毒病毒长末端重复序列；腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5k启动子)。还可使用由重组dna或合成技术生产的启动子。多核苷酸可插入表达载体中，所述表达载体包含帮助宿主的插入的遗传序列高效转录的启动子序列。表达载体通常包含复制起点、启动子以及允许经转化的细胞表型选择的特异性核酸序列。
骨架：一种结构，一般包含可生物相容的材料，其提供了适于细胞粘附和增殖的表面，还提供稳定性和支撑。骨架可以是特定的形状或形式以便影响或界定由增殖的细胞的种群占据(assumed)的三维形状或形式。该形状或形式包括但不限于薄膜(例如，大幅度大于三维的二维的形式)、带、索、薄片、平圆盘、圆柱、球体和无定型形状。骨架还可作为释放生物学活性分子的诱导性模板，如在降解过程期间释放生物学活性分子的ecm骨架。
干细胞：一种细胞，其自我更新并且能产生完全分化的一种或多于一种给定细胞类型的功能细胞。干细胞在体内的作用是替换在动物的正常生命期间死亡或被破坏的细胞。一般地，干细胞可不受限制地分裂并且是全能性的。分裂后，干细胞仍可为干细胞，变为前体细胞或进行最终分化。
一般地，前体细胞可以分裂并且是多能性的。分裂后，前体细胞仍可作为前体细胞，或可进行最终分化。“体前体细胞”是一种细胞，其能够产生来自动物如人体内的至少一种给定细胞类型的完全分化的功能细胞。神经元前体细胞可产生完全分化的神经元细胞，如但不限于肾上腺素神经元或类胆碱神经元。造血干细胞产生血细胞。
治疗有效量：足以在正在治疗的受试者中实现所期望效果的特定物质如纳米囊泡的数量。当施用于受试者时，一般采用会实现目标组织浓度(例如，骨头中)的剂量，所述目标组织浓度已表明可实现所期望的体外效果。
移植：将可生物相容的基材如纳米囊泡放置于有需要的受试者中。
肿瘤：细胞的异常生长，其可以是良性的或是恶性的。恶性肿瘤一般以异常的或不受控制的细胞生长为特征。通常与恶性疾病有关的其它特征包括转移、干扰相邻细胞的正常功能、释放异常水平的细胞因子或其他分泌产物、抑制或加剧炎症或免疫反应、侵入周围或远处组织或器官，如淋巴节等。“转移性疾病”是指离开原始肿瘤病灶并通过例如血流或淋巴系统迁移至身体其他部位的癌细胞。
个体中肿瘤的量为“肿瘤负担”，其以肿瘤的数目、体积或重量来衡量。侵入周围组织和/或可转移的肿瘤称为“恶性肿瘤”。血液肿瘤的示例包括白血病，包括急性白血病(如11q23-急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病以及髓细胞白血病、早幼粒细胞白血病、髓单核细胞白血病、单核细胞白血病和红白血病)、慢性白血病(如慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍启金病、非霍启金淋巴瘤(无痛且高等级形式)、多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、重链疾病、脊髓发育不良综合征、毛细胞白血病和脊髓发育不良。
实体瘤如肉瘤和癌的示例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、ewing瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌(包括乳腺基底癌、导管癌和小叶性乳腺癌)、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、骨髓癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、wilms瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌和cns肿瘤(如胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤)。在一个非限制性示例中，肿瘤为胶质瘤。
超滤：一类膜过滤，其中力(如压力或浓度梯度)导致通过半渗透膜分离。超滤膜通常以膜的截留分子量(mwco)表征。较高分子量的悬浮固体和溶质保留在保留物中，而水和较低分子量的溶质则在渗透中通过膜。不同类型的模块可用于超滤过程。此类模块的示例为采用塑料或纸质管的内部的聚合物膜铸件的管状元件；含有多个中空纤维的中空纤维设计；螺旋卷绕模块，其中通过卷绕在中央穿孔的管周围并安装入管状钢制压力容器外壳的薄网间隔材料分离平膜片；以及板和框架组装，其采用由网样材料分隔的在平板上放置的膜，过滤物通过所述膜。
载体：一种核酸分子，其可被引入至宿主细胞中，从而产生转化的宿主细胞。载体可包括允许其在宿主细胞内复制的核酸序列，如复制起点。载体还可包含一个或多个可选择的标记基因和其他本领域已知的遗传元件。载体可以是病毒载体，如腺病毒、逆转录病毒或慢病毒载体。载体可以是非病毒载体，如sleepingbeauty质粒或princecharming质粒。
除非另有解释，本文采用的所有技术和科学术语具有与本公开所属的本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非上下文另有明确说明单数术语，“一个(a)”、“一个(an)”和“所述”包括多个参照物。相似地，除非上下文另明确说明，“a或b”意指包括“a”、“b”和“a和b”。除非另有说明，“大约”表明是在5％以内。进一步理解的是，对于核酸或多肽，所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子重量或分子质量值都是近似的，并且被提供用于描述。尽管与类似于或等同于本文描述的方法和材料可用于本发明的实践或测试中，但下文描述了适宜的方法和材料。术语“包含”意指“包括”。所有出版物、专利申请、专利和本文提及的其它参考文献都通过援引整体并入本文。如有冲突，以本说明书为准，包括对术语的解释。此外，所述材料、方法和示例都仅仅是说明性的，并不旨在限制。
源自细胞外基质(ecm)的纳米囊泡
本文公开了，纳米囊泡包埋在细胞外基质中。这些纳米囊泡可以被分离且具有生物学活性。因此，这些纳米囊泡可单独地或与另一ecm一起用于治疗。这些纳米囊泡可单独地或与另一ecm一起用于生物骨架中。这些纳米囊泡也可在体外使用，如用于改变细胞的增殖、分化和/或迁移。
细胞外基质是结构和功能生物分子和/或生物大分子的复合混合物，并且除非另有说明是无细胞的，所述结构和功能生物分子和/或生物大分子包括但不限于包围和支持哺乳动物组织内的细胞的结构蛋白、特化蛋白、蛋白聚糖、葡糖氨基葡聚糖和生长因子。一般地，所公开的结合基质的纳米囊泡包埋在任意类型的细胞外基质(ecm)中，并且可从该位置处分离出来。因此，所公开的结合基质的纳米囊泡不是可分离地存在于ecm的表面上的。
细胞外基质公开于例如但不限于：美国专利4,902,508、4,956,178、5,281,422、5,352,463、5,372,821、5,554,389、5,573,784、5,645,860、5,771,969、5,753,267、5,762,966、5,866,414、6,099,567、6,485,723、6,576,265、6,579,538、6,696,270、6,783,776、6,793,939、6,849,273、6,852,339、6,861,074、6,887,495、6,890,562、6,890,563、6,890,564和6,893,666，每篇专利都通过援引整体并入本文中。然而，ecm可产自任意组织或任意体外来源，其中ecm可由培养的细胞生产，包含天然ecm的一种或多种聚合物组分(成分)。ecm制剂可被认为是“去细胞的”或“无细胞的”，意指细胞已从源组织或培养物中去除。
在一些实施方案中，ecm分离自脊椎动物，例如，分离自哺乳脊椎动物，包括但不限于人、猴子、猪、牛、羊等。ecm可源自任意器官或组织，包括但不限于膀胱、肠、肝、心脏、食管、脾、胃和真皮。在特定的非限制性示例中，细胞外基质分离自食管组织、膀胱、小肠黏膜下层、真皮、脐带、心包膜、心脏组织或骨骼肌。ecm可包含由器官获得的任意部分或组织，例如，包括但不限于黏膜下层、上皮基底膜、固有膜(tunicapropria)等。在一个非限制性实施方案中，ecm分离自膀胱。在某些实施方案中，ecm来自肿瘤组织。
ecm可包括或不包括基底膜。在另一个非限制性实施方案中，ecm包括基底膜的至少一部分。ecm材料可保留或不保留构成初始组织的某些细胞元件如毛细血管内皮细胞或成纤维细胞。在某些实施方案中，ecm既含有基底膜表面又含有非基底膜表面。
在一个非限制性实施方案中，从猪膀胱收获ecm(也称为膀胱基质或ubm)。简而言之，通过从哺乳动物如猪中去除膀胱组织和修剪包括残余脂肪组织内在的外部缔结组织来制备ecm。通过用自来水进行重复清洗来去除所有残余尿。组织可通过以下步骤剥离：先在例如但不限于高渗盐水(例如，1.0n盐水)的去上皮化溶液中将组织浸泡10分钟至4小时。暴露于高渗盐水中使上皮细胞从下面的基底膜去除。任选地，可将钙螯合剂添加至盐水溶液中。在初始剥离过程后的剩余组织包括上皮基底膜和组织层，所述组织层相对于上皮基底膜远离腔(abluminaltotheepithelialbasementmembrane)。相对易碎的上皮基底膜常被损坏并且可通过对腔表面的任意机械磨损去除。接下来，进一步处理该组织以去除大部分的远离腔的(abluminal)组织，但保留上皮基底膜和固有膜。通过机械磨损或通过酶处理(例如，使用胰蛋白酶或胶原酶)，然后水合和磨损的组合从剩余的去上皮化的组织中去除外层浆膜、外膜、肌层黏膜(tunicamuscularismucosa)、黏膜下层和大部分肌层黏膜(muscularismucosa)。通过用例如但不限于adson-brown钳子和metenbaum剪刀去除肠系膜组织和采用以湿润纱布包裹的手术刀手柄或其他刚性物体进行的纵向擦拭运动擦掉肌层和黏膜下层来机械性去除这些组织。还考虑了涉及切割片、激光和其他组织分离方法的机器人自动化程序。在去除这些组织后，得到的ecm主要由上皮基质膜和在下的固有膜组成。
在另一个实施方案中，通过采用以湿润纱布包裹的手术刀手柄或其他刚性物体进行的纵向擦拭运动磨损猪膀胱组织去除包括浆膜和肌层的外层来制备ecm。将组织段外翻，然后采用相同的擦拭运动将黏膜的腔内部分从下面的组织剥离。注意防止黏膜下层穿孔。在去除这些组织后，得到的ecm主要由黏膜下层组成(参见美国专利9,277,999的图2，其通过援引并入本文)。
ecm也可制备成粉末。可根据gilbert等人的biomaterials26(2005)1431-1435中记载的方法制备该粉末，该文献通过援引整体并入本文。例如，先冻干ubm片，再切成小片以浸没在液氮中。然后再将急冻的材料粉碎，使得颗粒足够小以能置于旋转的切碎机中，其中，ecm被粉末化。类似地，通过将nacl沉淀在ecm组织中，材料会破碎为大小均一的颗粒，这些颗粒可被急冻、冻干和粉末化。
在一个非限制性实施方案中，ecm源自小肠黏膜下层或sis。可商购的制剂包括但不限于surgisistm、surgisis-estm、stratasistm和stratasis-estm(cookurologicalinc.；indianapolis,ind.)和graftpatchtm(organogenesisinc.；cantonmass.)。在另一个非限制性实施方案中，ecm源自真皮。可商购的制剂包括但不限于pelvicoltm(在欧洲以permacoltm售卖；bard,covington,ga.)、repliformtm(microvasive；boston,mass.)和allodermtm(lifecell；branchburg,n.j.)。在另一个实施方案中，ecm源自膀胱。可商购的制备物包括但不限于ubm(acellcorporation；jessup,md.)。
采用下文所公开的方法，纳米囊泡可源自(释放自)细胞外基质。在某些实施方案中，用酶如胃蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、透明质酸或蛋白酶k消化ecm，并分离纳米囊泡。在其他的实施方案中，通过用诸如甘氨酸hcl、醋酸、氢氧化铵的溶液改变ph，使用诸如但不限于edta、egta的螯合剂，通过由于使用诸如但不限于氯化钾(kcl)、氯化钠、氯化锰、碘化钠、硫氰酸钠的盐而产生的离子强度和/或离液序列作用，或者通过将ecm暴露于变性条件如胍hcl或尿素中，使纳米囊泡从ecm中释放和分离出来。
在某些实施方案中，纳米囊泡不在其天然环境中，因此具有与天然存在的纳米囊泡不同的性质。在具体的示例中，在用酶如胃蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、蛋白酶k、盐溶液或胶原酶消化ecm后制备纳米囊泡。ecm可被冻融，或者机械降解。
在某些实施方案中，在纳米囊泡中检测不到cd63和/或cd81的表达。因此，纳米囊泡不表达cd63和/或cd81。在具体的示例中，在纳米囊泡中检测不到cd63和/或cd81。在其他实施方案中，纳米囊泡可表达几乎不可检测水平的cd63和cd81，如可通过western印记检测。这些纳米囊泡为cd63locd81lo。本领域技术人员可采用例如特异性结合cd63和cd81的抗体容易地鉴定cd63locd81lo的纳米囊泡。采用诸如荧光活化细胞分选(facs)和荧光标记的抗体的程序建立低水平的这些标记物以确定cd63和cd81的低量和高量的阈值。由于在生物流体中存在纳米囊泡，所公开的纳米囊泡不同于而可瞬时附着于ecm表面的纳米囊泡。在某些实施方案中，纳米囊泡的外表面已被去细胞化，去细胞化可包括使用酶和/或清洗剂。
在某些实施方案中，纳米囊泡包含一或多种mirna。在特定的非限制性示例中，纳米囊泡包含mir-145和mir-181。mir-145和mir-181在本领域公知。以mirbase登录号mi0000461提供mir-145核酸序列，所述登录号通过援引并入文本。mirna-145核酸序列为caccuuguccucacgguccaguuuucccaggaaucccuuagaugcuaagauggggauuccuggaaauacuguucuugaggucaugguu(seqidno:1)。以mirbase登录号mi0000269提供mir-181核酸序列，所述登陆号通过援引并入本文。mir-181核酸序列为agaagggcuaucaggccagccuucagaggacuccaaggaacauucaacgcugucggugaguuugggauuugaaaaaaccacugaccguugacuguaccuugggguccuua(seqidno:2)。
本文包括的纳米囊泡可被制成用于药物递送的组合物，并用在生物骨架和装置中，如下文所述。纳米囊泡可应用在许多种方法中，这些方法也如下文所述。
从ecm中分离纳米囊泡
本文公开了将纳米囊泡从ecm中分离的方法。在某些实施方案中，这些方法包括用酶消化ecm以产生经消化的ecm。在具体的实施方案中，用胃蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶和/或蛋白激酶k消化ecm。在其他实施方案中，用清洗剂处理ecm。在进一步的实施方案中，所述方法不包括使用酶。在特定的非限制性示例中，所述方法利用离液剂或离子强度分离纳米囊泡，如盐，如氯化钾。在另外的实施方案中，可操纵ecm以在分离纳米囊泡之前增加纳米囊泡的含量。
在某些实施方案中，用酶消化ecm。用酶消化ecm大约12小时至大约48小时，如大约12小时至大约36小时。用酶消化ecm大约12小时、大约24小时、大约36小时或大约48小时。在一个特定的非限制性示例中，在室温下用酶消化ecm。然而，可在大约4℃或大约4℃与25℃之间的任意温度下发生消化。一般地，在足以去除胶原纤维的任意温度下用酶消化ecm任意时间长度。根据组织来源改变消化过程。任选地，在用酶进行消化之前或之后，通过冻融处理ecm。用清洗剂，包括离子和/或非离子清洗剂，处理ecm。
然后，通过例如离心来处理经消化的ecm以分离无原纤维上清液。在某些实施方案中，离心经消化的ecm，例如，对于第一步可以大约300至大约1000g离心。然后，在大约400g至大约750g，如大约400，大约450g，大约500g或大约600g下离心经消化的ecm。这种离心可进行大约10至大约15分钟，如大约10至大约12分钟，如大约10、大约11、大约12、大约14、大约14或大约15分钟。收集包含经消化的ecm的上清液。
在某些实施方案中，对于第二步骤，还可以在大约2000g至3000g离心经消化的ecm。因此，在大约2,500g至大约3,000g，如大约2,000g、2,500g、2,750g或3,000g下离心经消化的ecm。这种离心可进行大约20至大约30分钟，如大约20至大约25分钟，如大约20、大约21、大约22、大约23、大约24、大约25、大约26、大约27、大约28、大约29或大约30分钟。收集包含经消化的ecm的上清液。
在另外的实施方案中，对于第三步骤，可以在大约10,000至大约15,000g离心经消化的ecm。因此，在大约10,000g至大约12,500g，如大约10,000g、11,000g或12,000g下离心经消化的ecm。这种离心可进行大约25至大约40分钟，如大约25至大约30分钟，例如大约25、大约26、大约27、大约28、大约29、大约30、大约31、大约32、大约33、大约34、大约35、大约36、大约37、大约38、大约39或大约40分钟。收集包含经消化的ecm的上清液。
可独立地利用这些离心步骤中的一个、二个或所有三个步骤。在某些实施方案中，可利用所有三个离心步骤。离心步骤可重复，如2、3、4或5次。在一个实施方案中，所有三个离心步骤可重复三次。
在某些实施方案中，经消化的ecm在大约500g下离心大约10分钟，在大约2,500g下离心大约20分钟和/或在大约10,000g下离心大约30分钟。这些步骤，如所有三个步骤，可重复2、3、4或5次，如重复三次。因此，在一个非限制性示例中，经消化的ecm以大约500g离心大约10分钟，在大约2,500g下离心大约20分钟，并且在大约10,000g下离心大约30分钟。这三个步骤可重复三次。因此，产生无原纤维上清液。
然后，离心无原纤维上清液以分离纳米囊泡。在某些实施方案中，在大约100,000g至大约150,000g下离心无原纤维上清液。因此，在大约100,000g至大约125,000g下，如在大约100,000g，大约105,000g，大约110,000g，大约115,000或大约120,000g下离心无原纤维上清液。该离心持续大约60至大约90分钟，如大约70至大约80分钟，例如，大约60、大约65、大约70、大约75、大约80、大约85或大约90分钟。在一个非限制性示例中，在大约100,000g下离心无纤维上清液大约70分钟。收集固体材料，该固体材料为纳米囊泡。然后，再将这些纳米囊泡再悬浮于任意感兴趣的载体中，如但不限于缓冲液。
在进一步的实施方案中，ecm不用酶消化。在这些方法中，将ecm悬浮于等渗的盐水溶液中，如磷酸盐缓冲盐水。然后将盐添加至悬浮液中，使得盐的最终浓度大于大约0.1m。所述浓度可以为例如至多大约3m，例如，大约0.1m盐至大约3m，或大约0.1m至大约2m。盐可以为例如大约0.1m、0.15m、0.2m、0.3m、0.4m、0.7m、0.6m、0.7m、0.8m、0.9m、1.0m、1.1m、1.2m、1.3m、1.4m、1.5m、1.6m、1.7m、1.8m、1.9m或2m。在某些非限制性示例中，盐为氯化钾、氯化钠或氯化锰。在其他实施方案中，盐为氯化钠、氯化锰、碘化钠、硫氰酸钠、钠盐、锂盐、铯盐或钙盐。
在某些实施方案中，将ecm悬浮于盐溶液中大约10分钟至大约2小时，如大约15分钟至大约1小时，大约30分钟至大约1小时，或大约45分钟至大约1小时。ecm可悬浮于盐溶液中大约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110或120分钟。ecm可在4℃至大约50℃，如但不限于大约4℃至大约25℃或大约4℃至大约37℃的温度下悬浮于盐溶液中。在特定的非限制性示例中，将ecm在大约4℃下悬浮于盐溶液中。在其它非限制性示例中，将ecm在大约25℃(室温)下悬浮于盐溶液中。在进一步的非限制性示例中，将ecm在大约37℃下悬浮于盐溶液中。
在某些实施方案中，方法包括：在大于大约0.4m的盐浓度下温育细胞外基质；离心经消化的细胞外基质以去除胶原原纤维残余物，并分离上清液；离心上清液以分离固体材料；以及将固体材料悬浮于载体中，从而将纳米囊泡与细胞外基质分离。
在盐溶液中温育后，离心ecm以去除胶原原纤维。在某些实施方案中，还可以在大约2000g至大约5000g下离心经消化的ecm。因此，在大约2,500g至大约4,500g下，如在大约2,500g、大约3,000g、大约3,500，大约4,000g或大约4,500g下离心经消化的ecm。在一个非限制性示例中，在大约3,500g下进行离心。该离心可进行大约20至大约分钟，如大约25至大约35分钟，如大约20、大约21、大约22、大约23、大约24、大约25、大约26、大约27、大约28、大约29、大约30分钟、大约31、大约32、大约33、大约34或大约35分钟。然后收集上清液。
在另外的实施方案中，对于第三步骤，然后，在大约100,000至大约150,000g下离心上清液。因此，在大约100,000g至大约125,000g，大约100,000g、110,000g或120,000g下离心消化的ecm。该离心可进行大约30分钟至大约2.5小时，如大约1小时至大约3小时，例如大约30分钟、大约45分钟、大约60分钟、大约90分钟或大约120分钟(2小时)。收集固体材料并悬浮于溶液中，如缓冲盐水，从而将纳米囊泡分离。
在其他实施方案中，将ecm悬浮于等渗的缓冲盐溶液中，如但不限于磷酸盐缓冲盐水。离心或其他方法可用于去除大颗粒(参见下文)。然后，再利用超滤分离结合基质的纳米囊泡，即大约10nm与大约10,000nm之间，如大约10至大约1,000nm之间、如大约10nm至大约300nm之间的ecm颗粒。
在特定的非限制性示例中，等渗的缓冲盐水溶液具有大约0.164mm的总盐浓度和大约7.2至大约7.4的ph。在某些实施方案中，等渗的缓冲盐水溶液包括0.002m至大约0.164m的kcl，如大约0.0027m的kcl(磷酸盐缓冲盐水中kcl的浓度)。然后，通过超速离心处理该悬浮液。
在等渗的缓冲盐溶液中温育之后，离心ecm以去除胶原原纤维。在某些实施方案中，也可以在大约2000g至5000g下离心经消化的ecm。因此，在大约2,500g至大约4,500g下，如在大约2,500g、大约3,000g、3,500,大约4,000g或大约4,500g下离心经消化的ecm。在一个特定的非限制性示例中，以大约3,500g离心。该离心可进行大约20至大约40分钟，如大约25至大约35分钟，如大约20、大约21、大约22、大约23、大约24、大约25、大约26、大约27、大约28、大约29、大约30分钟、大约31、大约32、大约33、大约34或大约35分钟。
可以使用并组合微滤和离心以从悬浮液中去除较大分子量的材料。在一个实施方案中，采用微滤去除如超过200nm的大尺寸分子材料。在另一实施方案中，采用离心去除大尺寸材料。在第三实施方案中，微滤和超速离心都用于去除大分子量的材料。从悬浮的ecm中去除大分子量的材料，如大于大约10,000nm，大于大约1,000nm，大于大约500nm或大于大约300nm的材料。然后，对微滤的流出液或上清液进行超滤。因此，收集并利用包含小于大约10,000nm、小于大约1,000nm、小于大约500nm或小于大约300nm的颗粒的流出液。然后，用具有3,000至100,000的截留分子量(mwco)的膜对该流出液进行超滤。在示例中采用100,000mwco。
使用方法
纳米囊泡如外泌体定向归巢至特异性靶细胞，这取决于其膜的物理特性。因此，纳米囊泡可用于递送其内容物。此外，结合基质的纳米囊泡可用于诱导细胞增殖、分化和细胞迁移。它们也可用于使细胞保持在未分化的状态。所公开的纳米囊泡的作用可以是局部的、区域性的或全身的。因此，这些纳米囊泡既可在体外使用也可在体内使用。
纳米囊泡，如外泌体(bobrie等2011)富含特异性mrna、mirna和蛋白质中。当囊泡位于胞间隙中，该货物受保护而免于被蛋白酶和rnase降解，一旦被受体细胞吸收，仍保持生物学活性。以这种方式，纳米囊泡便于交互式信号传导和酶活性的转移，否则，交互式信号传导和酶活性将基于基因表达而被限制于单个细胞中(lee等2011)。
源自ecm的纳米囊泡可用于将包括但不限于rna和dna的内容物转移到受体细胞中。这些分子可以是内源性的、或者可以采用分子技术被引入至源自ecm的纳米囊泡中。
在某些实施方案中，源自ecm的纳米囊泡可负载有治疗剂，如核酸分子或蛋白质。这些纳米囊泡可包括内源性核酸，如与编码蛋白质的核酸可操作连接的启动子。表达载体也可以包含在源自ecm的纳米囊泡中。为实现目的核酸分子的并入，使用方法包括但不限于以下(参见美国公开专利申请2015/0216899，其通过援引并入本文)：
(a)电穿孔。通过该方法，用100-200v/cm的电场进行短暂地冲击而在纳米囊泡中制造若干孔。dna/rna通过该电场制造的孔进入。
(b)脂质转染。该方法一般称为转染并可用于经含有所期望的基因构建体的非常小的囊泡以dna/rna转化纳米囊泡。该囊泡与膜融合(类似于液体培养基顶部的两个油斑融合)，囊泡的内容物和细胞结合在一起。市场上有许多种随时可用的转染试剂盒，例如，来自panomics的deliverxtmsirna转染试剂盒(cat号dx0002)，来自roche的
(c)采用热休克的转化。在二价阳离子如ca2+(cacl2)的存在下冷却纳米囊泡使其膜变为对于rna或dna质粒或片段来说是可渗透的。用dna温育纳米囊泡，然后经到短暂的热冲击(42℃，30-120秒)，这使dna进入到纳米囊泡中。该方法对于浓缩的环状质粒dna效果良好，并且对于核外或脂质纳米囊泡组分效果良好。
在某些实施方案中，分离的源自ecm的纳米囊泡(结合基质的纳米囊泡)可负载有外加的治疗剂，如核酸或蛋白质分子。核酸可以是dna或rna，如sirna、mirna或mrna。在某些方面，分离的外泌体可包含mirna。mirna可以为例如额外量的mir-145和/或mir-181。源自ecm的纳米囊泡可负载有蛋白质、生长因子或小分子。
在某些实施方案中，纳米囊泡被工程化为含有rna/dna或者被修饰为含有目的基因，并且可被分离和转移至受体细胞中，进而影响其生物学功能或存活。因此，纳米囊泡可将其内容物递送至靶细胞的细胞质中，这进而导致将mrna翻译为靶细胞内的特异性蛋白质。进一步地，纳米囊泡能够运载和转移小的编码和非编码rna，如可调节特异性基因的翻译的microrna和sirna。
在某些实施方案中，核酸编码多肽。适宜的多肽包括但不限于生长因子、酶、细胞因子或激素。适宜的生长因子包括人生长激素、n-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；耻骨松弛激素；耻骨松弛激素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(fsh)、促甲状腺激素(tsh)和黄体生成素(lh)；肝生长因子；前列腺素、纤维原细胞生长因子(fgf)，如fgf-α和fgf-β；催乳素；胎盘催乳素，肿瘤坏死因子；缪勒(氏)抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整合素；促血小板生成素(tpo)；神经生长因子；血小板生长因子；转化生长因子(tgf)，如fgf-α和fgf-β；胰岛素样生长因子-i和ii；红细胞生成素(epo)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素-α，β和γ；集落刺激因子(csf)，如巨噬细胞-csf(m-csf)、粒细胞-巨噬细胞-csf(gm-csf)、和粒细胞-csf(g-csf)；白介素(il)，如il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17、il-18、lif、g-csf、m-csf、epo、kit配体、flt-3或mda-7。激素的示例包括但不限于生长激素、催乳素、胎盘催乳素、黄体化激素、促卵泡激素、绒毛促性腺激素、促甲状腺激素、瘦素、促肾上腺皮质激素、血管紧张肽i、血管紧张肽ii、β-脑内啡、β-促黑素细胞激素、肠促胰酶肽、内皮素i、甘丙肽、胃抑制肽、胰高血糖素、胰岛素、促脂素、神经垂体素运载蛋白、生长激素抑制素、抑钙素、抑钙素基因相关肽、β-抑钙素基因相关肽、恶性高钙血症因子(hypercalcemiaofmalignancyfactor)、甲状旁腺激素相关蛋白质、甲状旁腺激素相关蛋白质、胰高血糖素样肽、胰抑制素、胰腺肽、肽yy、phm、分泌素、血管活性肠肽、催产素、抗利尿激素、加压催产素、脑啡肽酰胺(enkephalinamide)、metorphinamide、促α黑素细胞激素、心钠素、淀粉不溶素、类淀粉蛋白p组分、促肾上腺素激素释放激素、生长激素释放因子、黄体化激素释放激素、神经肽y、物质k、物质p和甲状腺刺激激素释放激素。适宜的酶包括acp去饱和酶、acp羟化酶、adp葡萄糖焦磷酸化酶、atp酶、醇脱氢酶、淀粉酶、淀粉转葡糖苷酶、过氧化氢酶、纤维素酶、环氧酶、脱羧酶、糊精酶、酯酶、dna聚合酶、rna聚合酶、透明质酸合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、gtp酶、螺旋酶、半纤维素酶、透明质酸酶、整合酶、蔗糖酶、异构酶、激酶、乳糖酶、脂酶、脂肪氧合酶、裂合酶、溶菌酶、果胶脂酶、过氧物酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、肽酶、普鲁兰酶、重组酶、逆转录酶、拓扑异构酶、木聚糖酶或报告基因。
在某些实施方案中，源自ecm的纳米囊泡可包含在药物组合物中，如包括药学上可接受的载体，并且源自ecm的纳米囊泡可通过本领域技术人员公知的任意方法施用于受试者。示例包括静脉内地、鼻腔内地、皮内地、动脉内地、腹腔内地、病灶内地、颅内地、关节内地、前列腺内地、胸腔内地、气管内地、玻璃体内地、阴道内地、直肠内地、外用(topically)、肿瘤内地、肌肉内地、皮下地、结膜下地、囊泡内地、黏膜地、心包内地、脐带内地、眼内地、口腔地、外用、注射、输注、连续输注、直接局部灌注浴靶细胞，经导管、经灌洗直接进入心室、直接注射入器官或器官的一部分或感兴趣的疾病位点，或者通过其他方法或这些方法的任意组合。外用施用特别有利于治疗如皮肤癌以预防化疗诱导的脱发或其他真皮过度增生疾病。可替代地，施用可以采用原位注射、真皮内注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射或静脉注射。
对于体内使用，组合物可作为药物学上可接受的组合物进行施用，所述药物学上可接受的组合物包括药物学上可接受的载体、缓冲液或其他赋形剂。在某些实施方案中，组合物可被制成液体。在其他实施方案中，组合物被制成凝胶或粉末。在其他实施方案中，组合物被制成雾气，如雾化剂。在进一步的实施方案中，组合物可被制成凝胶或定时释放胶囊。对于肺部病症的治疗，可采用气雾剂施用。气雾剂的体积一般在大约0.01ml与大约0.5ml之间。
所公开的方法可包括含有大约、至少大约或至多大约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、410、420、425、430、440、445、450、460、470、475、480、490、500、510、520、525、530、540、550、560、570、575、580、590、600、610、620、625、630、640、650、660、670、675、680、690、700、710、720、725、730、740、750、760、770、775、780、790、800、810、820、825、830、840、850、860、870、875、880、890、900、910、920、925、930、940、950、960、970、975、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000纳克(ng)、微克(mcg)、毫克(mg)的纳米囊泡，或可从其中得出的任意范围。上述数值也可以是根据患者的体重施用于患者的剂量，以ng/kg、μg/kg、mg/kg或g/kg和可从这些数值得出的任意范围表示。
可替换地，组合物可含有0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、410、420、425、430、440、441、450、460、470、475、480、490、500、510、520、525、530、540、550、560、570,575,580,590,600,610,620,625,630,640,650,660,670,675,680、690、700、710、720、725、730、740、750、760、770、775、780、790、800、810、820、825、830、840、850、860、870、875、880、890、900、910、920、925、930、940、950、960、970、975、980、990、1000ng/ml、μg/ml、mg/ml或g/ml或者可从其中得出的任意范围的浓度的纳米囊泡。剂量可以根据待治疗的病症改变。在某些实施方案中，所述病症为疝气、撕裂或损坏的肌肉、肌腱撕裂或损坏，或中风。
组合物可给受试者施用(或由其摄取)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多次，或可从其中得出的任意范围，并且可每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时或1、2、3、4、5、6、7天或1、2、3、4、5周或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月或可从其中得出的任意范围给受试者施用组合物。可每日一次、每日两次、每日三次、每日四次、每日五次或每日六次(或可从其中得出的范围)和/或按需要给受试者施用组合物。可替换地，可每2、4、6、8、12或24小时(或可从其中得出的范围)给受试者施用组合物或由受试者摄取。在某些实施方案中，在经历症状后给受试者施用组合物一段时间或一定的剂数(acertainnumberofdoses)。
施用于受试者的组合物的实际剂量可由物理和生理因素来确定，如体重、病症的严重程度、正在治疗的疾病的类型、先前或当前的治疗干预、患者的特发病和施用途径。在任何情况下，执行医师(practitioner)将确定组合物中活性成分的浓度和对个体受试者而言的适当剂量。在某些实施方案中，病症为疝气、肌肉撕裂或损坏、肌腱撕裂或损坏或中风。
所公开的方法中使用的包含源自ecm的纳米囊泡的组合物可适当地包含在药物学上可接受的载体中。所述载体为无毒的、可生物相容的，且选择对纳米囊泡的生物学活性不会造成有害的影响的载体。源自ecm的纳米囊泡可以固体形式、半固体形式、凝胶形式、液体形式或气体形式制成可局部递送(例如，递送至身体的特定部位，如骨骼肌或其他组织)或全身递送的制剂，如允许口服、肠胃外施用或手术施用的片剂、胶囊、粉末、颗粒、药膏、溶液、储存剂(depository)、吸入剂和注射剂。通过如涂覆医疗装置进行组合物的局部施用是适当的(见下文)。可将另外的活性成分添加至这些组合物中，如但不限于化疗剂(见下文)。源自ecm的纳米囊泡也可附着于表面，如但不限于聚丙烯网或任意可生物相容的材料。
经由可注射、输注或冲洗和外用递送进行肠胃外递送的适宜载体包括蒸馏水、生理磷酸盐缓冲盐水、正常或乳酸化的ringer溶液、葡萄糖溶液、hank溶液或丙二醇。此外，无菌的固定的油可作为溶剂或悬浮介质。基于这种目的，可采用任意的可生物相容的油，包括合成的单甘酯或双甘酯。此外，发现脂肪酸如油酸可用于可注射的制剂中。载体和物质(agent)可复合为液体、悬浮液、可聚合或不可聚合的凝胶、糊剂或软膏。
载体还可包括维持(例如，延伸、延迟或调整)物质的递送或增加治疗剂的递送、摄取、稳定性或药物动力学的递送运载体。在某些实施方案中，所使用的组合物包括但不限于缓冲液、水凝胶、防腐剂和/或稳定剂。这些物质可使组合物中的源自ecm的纳米囊泡有较长的半衰期。组合物还可包括但任意另外的目的治疗剂，如但不限于化学化合物、核酸分子、多肽、生长因子、细胞因子或小分子。在某些实施方案中，治疗剂为microrna或蛋白质。
药物组合物可包括表面活性剂，如羟丙基纤维素。还可在丙三醇、液体聚乙烯醇及其混合物中和在油中进行分散。在存储和使用的一般条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。组合物可以是可注射的组合物，也可以是液体溶液或悬浮液。组合物还可以是适合于液体中的溶液或悬浮液的固体形式。组合物可以是凝胶。这些制剂还可被乳化。
典型的组合物包括药物学上可接受的载体。例如，每毫升磷酸盐缓冲盐水中，组合物可含有小于、等于或大于10mg、25mg、50mg、或至多大约100mg的人血清白蛋白。其他药物学上可接受的载体包括水性溶液、非毒性赋形剂，包括盐、防腐剂、缓冲液等。
非水性溶液的示例为丙烯醇、聚乙烯醇、植物油和可注射的有机酯，如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水性溶液、盐水溶液、肠胃外运载体，如氯化钠、ringer右旋糖等。静脉内运载体包括流体和营养补充物。防腐剂包括抗微生物剂、抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体。根据公知的参数调节ph和药物组合物的各个成分的准确浓度。
配制物，如用于口服施用的配制物，可包含典型的赋形剂，例如，药物等级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。组合物采用溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释配制物或粉末的形式。
在某一实施方案中，组合物可以是自体组合物或从待治疗的同一患者获得。具体地，可收获来自诸如人的受试者的细胞外基质并用于源自ecm的纳米囊泡的分离。然后，可以药物组合物的形式将组合物施用于同一供体(自体)。在另一个实施方案中，组合物可以是同种异体的，这样提供ecm用于分离源自ecm的纳米囊泡的供体有机体和待治疗的受体有机体为同一物种但是不同的个体(同种异体)。在替代的实施方案中，组合物可以是异种的。因此，在施用于受试者之前，纳米囊泡可源自不同物种的ecm。基于该目的，从供体(例如动物，如猪)中取出ecm，纳米囊泡分离自ecm。然后，源自ecm的纳米囊泡以药物组合物形式施用于不同物种的受试者。在一个非限制性示例中，受试者为人。
所公开的组合物还具有体外和离体用途。可以添加源自ecm的纳米囊来改变细胞增殖、迁移和/或分化。在某些实施方案中，诱导细胞增殖、增殖和/或分化。在其他的实施方案中，抑制细胞增殖、增殖和/或分化。纳米囊泡可与或不与细胞外基质一起使用。在某些实施方案中，细胞可以是干细胞，如但不限于血管周干细胞。在其他的实施方案中，细胞可以是巨噬细胞或单核细胞。
在某些实施方案中，提供一种改变感兴趣的细胞外基质上的细胞增殖、迁移和/或分化的方法。在某些实施方案中，方法包括将源自第二细胞外基质的分离的纳米囊泡引入至感兴趣的细胞外基质。源自ecm的纳米囊泡的添加可改变在ecm上生长的细胞的细胞增殖、迁移和/或分化。在某些实施方案中，细胞可以是干细胞，如但不限于血管周干细胞。在其他的实施方案中，细胞可以是巨噬细胞或单核细胞。
感兴趣的细胞外基质和源自ecm的纳米囊泡可以是自体的、同种异体的或异种的。感兴趣的细胞外基质和源自ecm的纳米囊泡可来自相同或不同的组织。感兴趣的细胞外基质和源自ecm的纳米囊泡可来自相同或不同的物种。在特定的非限制性示例中，感兴趣的细胞外基质和/或源自ecm的纳米囊泡是人或猪的。
细胞可以是任意感兴趣的细胞。在某些实施方案中，细胞为干细胞或祖细胞。在其他的实施方案中，细胞为巨噬细胞、成肌细胞、血管周干细胞或成神经细胞瘤细胞。下文公开了所公开的源自ecm的纳米囊泡在骨架和装置上的用途。
治疗肿瘤的方法
本文公开了减少肿瘤细胞在体内或体外增殖的方法。本文还公开了增加肿瘤细胞在体内或体外凋亡的方法。此外，本文公开了减少肿瘤细胞在体内或体外迁移的方法。这些方法包括将肿瘤细胞与本文公开的有效量的源自ecm的纳米囊泡接触。在某些实施方案中，肿瘤细胞为胶质瘤细胞。在其他的实施方案中，源自ecm的纳米囊泡来自膀胱。在进一步的实施方案中，肿瘤细胞为胶质瘤细胞，源自ecm的纳米囊泡分离自膀胱ecm。在进一步的实施方案中，肿瘤细胞为食管腺癌细胞。在其他的实施方案中，源自ecm的纳米囊泡分离自食管癌ecm。在进一步的实施方案中，肿瘤细胞为食管腺癌，源自ecm的纳米囊泡分离自食管癌ecm。源自ecm的纳米囊泡也可由肿瘤组织产生。ecm可以是人的，或者来自兽医学受试者。
本文公开的所有方法可用于任意类型的胶质瘤或胶质瘤细胞。胶质瘤可以是室管膜瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、脑干胶质瘤、视神经胶质瘤或混合胶质瘤。胶质瘤可以是who等级i、ii、iii或iv。胶质瘤可以是低级胶质瘤或高级(who等级iii-iv)胶质瘤。胶质瘤可以是幕上、幕下或脑桥的。
还提供了治疗受试者中肿瘤的方法。在某些实施方案中，方法包括治疗受试者中存在的肿瘤的方法。在另外的实施方案中，本文公开了防止从良性病变转化为恶性病变，或者防止在受试者中转移的方法。在某些非限制性示例中，方法减少了受试者中肿瘤的症状。在另外的非限制性示例中，肿瘤为实体瘤。在某些实施方案中，肿瘤细胞为胶质瘤细胞。在其他的实施方案中，源自ecm的纳米囊泡分离自膀胱ecm。在进一步的实施方案中，肿瘤细胞为胶质瘤细胞，源自ecm的纳米囊泡分离自膀胱ecm。在进一步的实施方案中，肿瘤细胞为食管腺癌细胞。在其他的实施方案中，源自ecm的纳米囊泡分离自食管癌ecm。在进一步的实施方案中，肿瘤细胞为食管腺癌，源自ecm的纳米囊泡分离自食管癌ecm。
一般地，如本文所公开，方法包括选择患有肿瘤如良性或恶性肿瘤的受试者和将治疗有效量的源自ecm的纳米囊泡施用于该受试者。在某些实施方案中，本文公开的方法包括选择需要治疗的受试者，如患有胶质瘤的受试者，并且将治疗有效量的源自ecm的纳米囊泡施用于该受试者。还可将另外的物质，如但不限于，化疗剂，施用于感兴趣的受试者。还可将另外的治疗，如但不限于手术切除肿瘤，施用于受试者。
肿瘤可以是良性的，也可以是恶性的。肿瘤可以是实体瘤或淋巴组织增生性肿瘤。肿瘤可以是任意目的肿瘤，包括但不限于胶质瘤。在其他的实施方案中，肿瘤为淋巴瘤、乳腺癌、肺癌或结肠癌。另外的示例为皮肤肿瘤、乳腺肿瘤、脑瘤、子宫颈癌、睾丸癌、头颈肿瘤、胃肠道肿瘤、泌尿生殖系统肿瘤、妇科系统肿瘤、乳腺、内分泌系统肿瘤、皮肤肿瘤、软组织肉瘤和骨肉瘤、间皮瘤、黑素瘤、中枢神经系统的赘生物或白血病。在某些实施方案中，肿瘤为头颈肿瘤，如鼻腔、鼻旁窦、鼻咽、口腔、口咽、喉、下咽、唾液腺的肿瘤以及副神经节瘤。在其他的实施方案中，肿瘤为肺肿瘤，如非小细胞肺癌或小细胞肺癌。在进一步的实施方案中，肿瘤可以是胃肠道的肿瘤，如食管癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、胆系(biliarytree)癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌和肛区癌。在其他的实施方案中，肿瘤可以是泌尿生殖系统的肿瘤，如肾癌、尿道癌、膀胱癌、前列腺癌、尿道癌、阴茎癌和睾丸癌。在某些实施方案中，肿瘤为妇科肿瘤，如子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、子宫体癌、妊娠滋养层疾病、卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌或乳腺癌。在其他的实施方案中，肿瘤为内分泌系统肿瘤，如甲状腺肿瘤、甲状旁腺肿瘤、肾上腺皮质肿瘤、胰腺内分泌肿瘤、良性肿瘤和良性肿瘤综合征。肿瘤可以是软组织肉瘤和骨肉瘤、间皮瘤、皮肤癌、黑素瘤(包括皮肤黑素瘤和眼内黑素瘤)、中枢神经系统的赘生物、儿童的癌症，包括成视网膜细胞瘤、wilm’s肿瘤、神经纤维瘤(neurofibromatose)、成神经细胞瘤、ewing肉瘤家族肿瘤、横纹肌肉瘤。肿瘤可以是淋巴瘤，包括非hodgkin淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤和hodgkin病。肿瘤可以是白血病，如急性白血病、慢性骨髓性白血病和淋巴细胞白血病。肿瘤可以是浆细胞赘生物、原发灶不明的癌、腹膜癌变(carcinomastosis)、kaposi肉瘤、aids相关的淋巴癌、aids相关的原发性中枢神经系统淋巴癌、aids相关的hodgkin病和aids相关的肛门与生殖器癌、转移至肝的癌症、转移至骨的癌症、恶性胸膜心包积液和恶性腹水。在特定的非限制性示例中，肿瘤为黑色素瘤或结肠癌。
一般在诊断出肿瘤后或在引发前兆病症(如发育异常或良性肿瘤发展)后开始治疗肿瘤。可以在癌症早期开始治疗，例如，可以在受试者表现出病症的症状之前开始治疗，如在i阶段的诊断期间或在诊断发育异常时开始治疗。然而，可以在疾病的任意阶段开始治疗，如但不限于i阶段、ii阶段、iii阶段和iv阶段癌症。在某些示例中，给这些有可转化为恶性甚或是转移性肿瘤的良性肿瘤的受试者施用治疗。
可通过本领域已知的方法确定肿瘤的存在，通常包括细胞学和形态学评估。肿瘤为已建立的肿瘤。
病症如恶性癌症发展后开始的治疗可减少其中一种病症的症状的严重性，或完全去除症状，或减少转移、肿瘤体积或肿瘤的数目。在某些示例中，肿瘤在治疗后不可检测。在本公开的一个方面，延迟、防止或减少肿瘤的形成，如转移。在另一方面，减少原发性肿瘤的大小。在进一步的方面，减少肿瘤的征兆。在另一方面，减小肿瘤体积。
在某些示例中，方法用于治疗患有肿瘤的受试者。将本文公开的治疗有效量的源自ecm的纳米囊泡施用于受试者。在特定的非限制性示例中，源自ecm的纳米囊泡分离自膀胱。在其他的非限制性示例中，源自ecm的纳米囊泡分离自食管。在某些实施方案中，施用减少了肿瘤细胞增殖，增加肿瘤细胞凋亡和/或减少肿瘤细胞迁移。施用可直接用于肿瘤。在特定的非限制性示例中，肿瘤为胶质瘤。
病症发展之前的治疗，如关于检测发育异常或早期(良性)前兆病症的治疗，在本文称为对处于发展病症的“风险”中的受试者的治疗。在某些实施方案中，可在本文描述的病症发生期间或之后施用组合物，如源自ecm的纳米囊泡或包含源自ecm的纳米囊泡的药物组合物。在某些实施方案中，受试者没有barrett食管。在其他的实施方案中，受试者有barrett食管。
药物组合物可包括源自ecm的纳米囊泡和任选存在的一个或多个另外的化疗剂。这些组合物用于治疗肿瘤。可以各种方式制备这些组合物以施用于受试者，从而影响肿瘤中细胞的增殖，或者对任意感兴趣的肿瘤进行延迟、防止、减少发展风险，或治疗或降低转移的发生率。还可配制本文描述的组合物以应用，从而使得其防止初始病变的转移。在某些实施方案中，配制用于局部施用的组合物，如瘤内施用。因此，提供用于局部使用和全身使用的药物组合物，配制用于人医学或兽医学药物组合物。在某些实施方案中，可通过注射或导管施用组合物。
虽然所公开的方法和组合物通常用于治疗人受试者，但是它们也可用于治疗其他脊椎动物(如其它灵长类动物、狗、猫、马和牛)中的类似或相同的疾病。适宜的施用形式可最好由每个受试者的执行医师确定。在标准配制物论文例如e.w.martin的remington’spharmaceuticalscience中描述了各种药学上可接受的载体及其配制物。还可参见wang,y.j.和hanson,m.a.的journalofparenteralscienceandtechnology,technicalreportno.10,supp.42:2s,1988。通过所选定的施用模式确定药物组合物的剂型。在某些实施方案中，受试者为人，源自ecm的纳米囊泡来自人组织。
在某些实施方案中，当所公开的组合物局部施用于受影响区域内或目的组织中的细胞时，其可减少肿瘤细胞增殖、增加肿瘤细胞凋亡和/或减少肿瘤细胞迁移。源自ecm的纳米囊泡可通过任意途径施用，包括肠胃外施用例如静脉内、腹腔内、肌肉内、腹膜内、胸骨内或关节内注射或输注，或者舌下、口腔、外用、鼻内或透粘液质(transmucosal)施用，或者肺部吸入。可基于肿瘤的表现由医师选择适宜的施用途径。
当提供源自ecm的纳米囊泡作为用于肠胃外组合物(例如注射或输注)时，一般可将该纳米囊泡悬浮于水性载体中，例如，悬浮于等渗缓冲液中，ph为大约3.0至大约8.0，优选地ph为大约3.5至大约7.4，如大约7.2至大约7.4。可用的缓冲液包括柠檬酸钠-柠檬酸和磷酸钠-磷酸，和醋酸钠-醋酸缓冲液。
可采用贮藏库或“储库”缓释制剂形式，从而使得治疗有效量的制剂在注射或递送后的几小时或几天内被递送至血流中。
适宜的缓释组合物示例包括适宜的聚合物材料(如，成型制品形式的半渗透聚合物基质，例如，薄膜，或微胶囊)、适宜的疏水性材料(如，可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂以及微溶的衍生物(如，微溶的盐)。缓释配制物可口服施用、直肠施用、肠胃外施用、椎管内施用、阴道内施用、腹腔内施用、外用施用(作为粉末、药膏、凝胶、滴剂或透皮贴剂)、颊部施用，或者口腔或鼻腔喷雾剂施用，这取决于肿瘤的位置。药物组合物可以是包含可生物降解的聚合物和/或多糖果冻(jellifying)和/或生物黏附性聚合物、两亲性聚合物、改变颗粒界面性质的物质和具有药物学上活性的物质的颗粒形式。这些组合物具有一定的生物相容性特征，该特征允许受控释放活性物质。参见美国专利5,700,486。
所公开的方法中使用的药物学上可接受的载体和赋形剂是常规的。例如，肠胃外配制物一般包含可注射流体，所述可注射流体为药物学上和生理学上可接受的流体运载体，如水、生理盐水、其他平衡盐溶液、水性葡萄糖、丙三醇等。可包括的赋形剂为，例如，蛋白质，如人血清白蛋白或血浆制剂。如果需要，待施用的药物组合物还可包含微量的非毒性辅助物质，如润湿或乳化剂、防腐剂和ph缓冲剂等，例如醋酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。制备该剂型的实际方法对于本领域的技术人员来说是公知的，或是明显的。
所施用的活性化合物的用量取决于正在治疗的受试者、病痛的严重程度和施用方式，最好留给处方的临床医生判断。基于这些约束，待施用的制剂包含有效量的活性成分以在正在治疗的受试者中实现所期望的效果。可以构想多次治疗，如限定的时间间隔，如每日、双周、每周、双月或每月，从而实现了长期施用。无论什么时间需要抑制或预防疾病时都可开始进行施用，例如，在受试者的一定年龄，或在暴露于环境之前。
根据受试者的特定部分、年龄、体重、性别和生理条件的效力，由本领域技术人员确定准确的剂量。适宜的浓度包括但不限于大约1ng/ml-100gr/ml。
可施用另外的药剂，如细胞因子、趋化因子或化疗剂。这些都可包括在公开的药物组合物中。可施用细胞因子，如白细胞介素(il)或干扰素，如干扰素(ifn)α、β或γ，il-1、il-6和il-10。在一个示例中，可将手术治疗施用于受试者以用于肿瘤的预防和治疗。在一个示例中，这种施用为相继施用。在其他示例中，这种施用为同时施用。
化疗剂的示例为烷基化剂、抗代谢物、天然产物或激素及其拮抗剂。烷基化剂的示例包括氮芥(如二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、美法仑、尿嘧啶芥或苯丁酸氮芥)、烷基磺酸盐(如二甲磺酸丁酯)、亚硝基脲(如卡莫司汀、罗氮芥、甲基环己亚硝脲、链脲菌素或氮烯唑胺)。抗代谢物的示例包括叶酸类似物(如甲氨蝶呤)、嘧啶类似物(如5-fu或阿糖胞苷)和嘌呤类似物，如巯嘌呤或硫鸟嘌呤。天然产物的示例包括长春花生物碱(如硫酸长春碱、长春新碱或长春地辛)、表鬼臼毒素(如依托泊苷或替尼泊苷)、抗生素(如更生毒素、红比霉素、阿霉素、争光毒素、普卡霉素或丝裂霉素c)和酶(如l-天冬酰胺酶)。混合剂(miscellaneousagent)的示例包括铂配位复合物(如顺-二胺二氯铂ii，也称为顺铂)、取代的尿素(如羟基脲)、甲基肼衍生物(如甲基苄肼)和肾上腺皮质(adrenocrotical)抑制剂(如米托坦和氨鲁米特)。激素和拮抗剂的示例包括肾上腺皮质甾类(如强的松)、孕酮(如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮)、雌激素(如己烯雌酚和乙炔雌二醇)、抗雌激素(如他莫昔分)和雄激素(如丙酸睾酮和氟甲睾酮)。最常用的化疗药物的示例包括阿霉素、艾克兰、ara-c、bicnu、白消安、ccnu、卡铂、顺铂、环磷酰胺、道诺霉素、dtic、5-fu、氟达拉滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、甲氨蝶呤、光神霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、氮芥、紫杉醇(或其他紫衫烷类，如多西他赛)、长春碱、长春新碱、vp-16，同时某些较新的药物包括吉西他滨(健择)、赫赛汀、伊立替康(依立替康，cpt-11)、克拉屈滨注射液、诺维本、美罗华sti-571、泰素帝、拓扑替康(美新)、希罗达(卡培他滨)、zevelin和骨化三醇。可使用的免疫调制剂的非限制性示例包括as-101(wyeth-ayerst实验室)、溴匹立明(upjohn)、λ干扰素(genentech)、gm-csf(粒细胞-巨噬细胞菌落刺激因子；geneticsinstitut)、il-2(cetusorhoffman-laroche)、人免疫球蛋白(cutterbiological)、imreg(来自imregofneworleans,la.)、sk&f106528和tnf(肿瘤坏死因子；genentech)。
增加m2巨噬细胞的方法
巨噬细胞已被证明是损伤后正常愈合和正常组织发育的关键调节剂。所公开纳米囊泡可概括了整个ecm对巨噬细胞表型的影响，从而导致了m2样、调节性或前重构巨噬细胞的增加。因此，本文公开的任意组合物可用于修饰巨噬细胞表型，如用于诱导调节性m2巨噬细胞。
在某些实施方案中，公开了通过施用治疗有效量的包含本文所述的源自ecm的纳米囊泡的组合物来诱导受试者中的m2巨噬细胞的方法，从而诱导了受试者中的m2巨噬细胞。在进一步的实施方案中，公开了减少受试者中m1(促炎性)巨噬细胞的方法。所述方法包括施用治疗有效量的包含本文所述的源自ecm的纳米囊泡的组合物，从而抑制受试者中的m1巨噬细胞。受试者可以是任意感兴趣的受试者，如有炎症或伤口的受试者。在某些非限制性示例中，受试者患有炎性病症，如但不限于溃疡性结肠炎或类风湿关节炎。在其他非限制性示例中，受试者为器官移植受体、患有移植物宿主病的受试者、患有心肌梗死的受试者或有伤口的受试者，如但不限于有手术伤口或非手术创伤伤口。因此，公开了一种加速有需要的个体中伤口愈合的方法，包括施用治疗有效量的含有本文所述的源自ecm的纳米囊泡的组合物。施用可以是局部施用，如施用于伤口或移植物的部位。
提供了促进个体中吻合和由手术导致的其他伤口的愈合的方法。这些方法包括在吻合或其他手术之前、之后和/或期间将治疗有效量的含有本文所述的源自ecm的纳米囊泡的组合物施用于个体。吻合术是将两个管状结构物连接在一起，例如，去除肠的中段，将剩余部分连接在一起以重组肠道。与皮肤愈合不同，吻合的伤口的愈合过程看起来一般是模糊的。进一步地，在无并发症的情况下，至少在胃肠道内伤口会很快愈合；然而，并发症常常需要另外的手术进行修正。thornton,f.和barbul,a.,surg.clin.northam.77:549573(1997)。
还提供了刺激上课愈合的方法，伤口包括手术伤口、切除伤口、涉及真皮和表皮损伤的深度伤口、眼组织伤口、牙组织伤口、口腔伤口、糖尿病溃疡、真皮溃疡、前臂溃疡、动脉溃疡、静脉瘀滞性溃疡和热暴露或化学制品产生的烧伤。还提供了用于由局部缺血和局部缺血损伤如静脉循环系统返回损伤和/或功能不全引起的慢性下肢静脉溃疡导致的伤口的方法。治疗有效量的含有本文所述的源自ecm的纳米囊泡的组合物可用于真皮缺损后的真皮重建。此外，治疗有效量的含有本文所述的源自ecm的纳米囊泡的组合物可用于增加表皮的拉伸强度和表皮厚度。因此，所公开的方法可用于刺激正常受试者和伤口愈合不良的受试者中不同类型伤口的愈合。
本文还公开了增加皮肤移植物对创面的粘附性和从创面刺激再上皮化的方法。移植物的类型包括但不限于自体皮肤移植物、人造皮肤、同种异体移植物、自皮移植物、自体表皮移植物、无血管(avacular)移植物、blair-brown移植物、骨移植物、胚胎移植物(brephoplasticgraft)、皮肤移植物、延迟移植物、真皮移植物、表皮移植物、筋膜移植物、全层皮移植物(fullthicknessgraft)、异源移植物、异种移植物、同源移植物、增生性移植物、薄片状移植物、网状移植物、粘膜移植物、ollier-thiersch移植物、omenpal移植物、修补移植物、蒂状移植物、全层角膜移植物(penetratinggraft)、分层皮移植物、厚分层移植物。方法包括将治疗有效量的含有本文所述的源自ecm的纳米囊泡的组合物与移植物一起施用于受试者，从而增加移植物的粘附性和接受性。
还公开了治疗由于磨损或化学损伤导致的水泡和烧伤的方法。这些方法包括治疗皮肤或内部器官。这些方法包括治疗由例如用化学疗法进行治疗或用环磷酰胺进行治疗导致的口腔损伤、放射或化疗诱导的膀胱炎或高剂量化疗诱导的肠损伤。方法包括将治疗有效量的含有本文所述的源自ecm的纳米囊泡的组合物施用于受试者以促进水泡或烧伤的愈合。
对于皮肤的治疗，可将治疗有效量的含有本文所述的源自ecm的纳米囊泡的组合物局部可施用于皮肤的受影响区域，如以药膏的形式施用。在一个实施方案中，药膏是完全均质的半固体外用剂，硬度易于涂覆在皮肤上。此类药膏可包括脂肪、脂肪油、羊毛脂、凡士林、石蜡、蜡、硬药膏、树脂、塑料、乙二醇、高级醇、丙三醇、水或乳化剂和悬浮剂。以这些成分为基底，将诱饵化合物均匀地混合。根据该基底，混合物可以是油膏、乳化膏或水溶性膏的形式，油膏使用诸如植物和动物油和脂肪、蜡、
药物学上可接受的载体包括凡士林，如
骨架和装置
还公开了包含纳米囊泡的装置，所述纳米囊泡源自细胞外基质，如哺乳动物细胞外基质，例如人或猪细胞外基质。如本文公开的任意源自ecm的纳米囊泡可包覆在装置的部件上或嵌入装置的部件中。装置可以是但不限于手术用网、支架、起搏器、导管、心脏瓣膜、生物传感器、药物递送装置或整形外科移植物。装置可用于修复损坏的或撕裂的肌腱或肌肉。骨架或装置可用于颞下颌关节紊乱病的治疗，例如，参见美国专利9,277,999，其通过援引并入本文。
本文公开了包含纳米囊泡的生物骨架，所述纳米囊泡源自细胞外基质，如哺乳动物细胞外基质，例如人或猪细胞外基质。如本文公开的任意源自ecm的纳米囊泡可包含在生物骨架中，所述生物骨架为生物学上可相容的骨架。这些生物骨架可包含在装置中。
优选地，用于制造本文公开的装置的聚合物部件是可生物相容的。“可生物相容的”意指聚合物组分及其正常的体内降解产物是细胞相容性的且基本上在有用的、实用的和/或可接受的耐受性内在患者中是无毒且不致癌的。“细胞相容性的”意指聚合物能维持细胞群和/或聚合物组合物、装置及其降解产物，在有用的、实用的和/或可接受的耐受性内，对野生型(正常的，非癌的)细胞没有细胞毒性和/或致癌性。例如，当聚合物置于人上皮细胞培养物时不会对细胞的活力、生长、粘附和数目产生负面影响。在一个非限制性实施方案中，组合物和/或装置在一定程度上是“可生物相容的”，根据规定的管辖范围内的适宜的监管标准，将它们用于人类患者是可接受的。在另一示例中，当可生物相容的聚合物植入患者中时不会引起实质的不良反应或对身体内的细胞和组织引起实质的损害，例如，聚合物组合物或装置不会引起导致坏死或感染，所述坏死或感染导致来自植入骨架的对组织的损伤。
骨架和装置可用于许多医疗应用，包括但不限于伤口愈合、组织重塑和组织再生。例如但不限于，骨架可用于伤口愈合。
在某些实施方案中，装置或生物骨架可包含细胞外基质。在特定的非限制性示例中，细胞外基质来自食管细胞、膀胱细胞、小肠黏膜下层或真皮。
在某一实施方案中，ecm可以是自体的，使得ecm和源自ecm的纳米囊泡来自相同的受试者。具体地，可收获来自受试者如人的ecm并用于纳米囊泡的分离。这些源自ecm的纳米囊泡可与来自相同受试者的ecm一起使用。因此，可产生包含来自相同受试者的ecm和源自ecm的纳米囊泡的生物骨架或装置。
在另一个实施方案中，ecm可以是同种异体的，使得ecm和源自ecm的纳米囊泡来自相同物种的不同受试者。具体地，可收获来自受试者如人的ecm并用于纳米囊泡的分离。这些源自ecm的纳米囊泡可与来自不同受试者的ecm一起使用。因此，可产生包含来自不同受试者但是物种相同的ecm和源自ecm的纳米囊泡的生物骨架或装置。
在另一个实施方案中，ecm可以是异种的，使得ecm和源自ecm的纳米囊泡来自不同物种。在一个非限制性示例中，可收获来自受试者如人的ecm并用于纳米囊泡的分离。这些源自ecm的纳米囊泡可与来自不同物种如猪的ecm一起使用。在另一个非限制性示例中，可收获来自受试者如人的ecm并用于纳米囊泡的分离。这些源自ecm的纳米囊泡可与来自不同物种如人的ecm一起使用。因此，可产生包含来自不同物种的ecm和源自ecm的纳米囊泡的生物骨架或装置。
在进一步的实施方案中，ecm和源自ecm的纳米囊泡来自相同的组织来源。在另一个实施方案中，ecm和源自ecm的纳米囊泡来自不同的组织来源。因此，在某些非限制性示例中，ecm和源自ecm衍生的纳米囊泡都可由食管组织、膀胱、小肠粘膜下层、真皮、脐带、心包、心脏组织，或骨骼肌，或来自这些组织的培养物中的细胞产生。在其他非限制性示例中，可由食管组织、膀胱、小肠粘膜下层、真皮、脐带、心包、心脏组织，或骨骼肌细胞产生源自ecm的纳米囊泡，而ecm不来自这些组织来源。在进一步的非限制性示例中，可由食管组织、膀胱、小肠粘膜下层、真皮、脐带、心包、心脏组织，或骨骼肌产生ecm，而源自ecm的纳米囊泡不来自这些组织来源。
在一个非限制性实施方案中，除了源自ecm的纳米囊泡以外，骨架(或装置)包含其他物质，如生物学活性剂。这些生物学活性剂可用于帮助组织愈合、组织重塑和/或血管生成。在另一个非限制性实施方案中，骨架(或装置)包含另外的生物学活性剂以防治细菌和其他病原体，募集选定的细胞类型如干细胞，或者诱导细胞分化。在另外的非限制性实施方案中，骨架包括有孔以允许伤口引流或细胞通过以及缔结组织沉积。
如上所述，除了源自ecm的纳米囊泡以外，骨架或装置还可包含ecm。在另一个非限制性实施方案中，在患者的位点进行移植之前或期间将细胞与生物学活性剂的组合添加至包含源自ecm的纳米囊泡的骨架或装置中。所公开的纳米囊泡可应用于或并入这些骨架中的任意一者。
骨架可包括任意适宜的合成聚合物部件、生物聚合物部件或其组合。“生物聚合物”为可由生物来源(如但不限于哺乳动物或脊椎动物组织和细胞外基质)获得的聚合物。生物聚合物可通过另外的处理步骤修饰。一般地，聚合物包括，例如但不限于，单聚物、共聚物、聚合物混合物、嵌段聚合物、嵌段共聚物、交联聚合物、非交联聚合物，线性、分支、梳子形、星形和/或树突状聚合物，其中，聚合物可形成为任意有用的形式，例如但不限于水凝胶、多孔网、纤维、编织网或非编制网，如，例如但不限于通过电沉积形成的非编织网。
在某些实施方案中，适用于骨架的聚合物部件可以是可生物降解和可生物相容的聚合物。“可生物降解”意指一旦聚合物被移植且与体液和/或组织接触放置，其将通过化学、生物化学和/或酶促过程部分地或完全地降解。这种化学反应的非限制性示例包括酸/碱反应、水解反应和酶裂解。在某些非限制性实施方案中，可生物降解聚合物可包括均聚物、共聚物和/或聚合物混合物，所述聚合物混合物包含但不限于以下单体的一个或多个：乙交酯、丙交酯、己内酯、对二氧环己酮和碳酸三亚甲酯。可生物降解的聚合物的非限制性示例包括聚(酯-尿烷)尿素弹性体(peuu)和聚(醚-酯-尿烷)尿素弹性体(peeuu)。在其他的非限制性实施方案中，聚合物包含易变的化学部分，其非限制性示例包括酯类、酐类、聚酐类或酰胺类，其可用于例如但不限于控制骨架的降解速率和/或治疗剂从骨架释放的速率。可替换地，聚合物可包含肽或生物大分子作为构件，其一旦放置就位就易于发生化学反应。在一个非限制性示例中，聚合物为包含氨基酸序列丙氨酸-丙氨酸-赖氨酸的多肽，其向聚合物赋予酶不稳定性。在另一个非限制性实施方案中，聚合物组合物可包含源自ecm的生物大分子组分。例如，聚合物组合物可包含生物大分子胶原蛋白，使得原位存在的胶原酶可降解胶原蛋白。
可选择聚合物组分，使得它们在与伤口或组织的预期愈合速率类似的时间量程内原位降解。原位降解速率的非限制性示例包括在一周至一年之间，或者例如在两周与10个月之间以及在一个月与6个月之间。
可生物降解骨架的力学性质可在对植入位点的天然组织上的正常应变和应力下进行优化。在某些非限制性实施方案中，骨架的力学性能优化为与天然软组织如筋膜、连续组织、骨、软骨、血管、肌肉、肌腱、脂肪等类似或相同的力学性能。
骨架的力学性质也可优化为适用于外科手术处理。在一个非限制性实施方案中，骨架是挠性的并且可缝合于所述位点。在另一个实施方案中，骨架是可折叠的并且可通过微创腹腔镜手术递送至所述位点。
可根据预期用途优化可生物降解骨架的物理和/或力学性质。被优化的变量包括但不限于在包含聚合物组分的网络中的物理、化学或光学氧化交联的程度、聚合物组分在网络内的比例、聚合物组分的分子量的分布和加工聚合物的方法。聚合物通常为半晶体，其物理性质和/或形态取决于多种因素，包括单体组成、多分散性、平均分子量、交联和溶解/结晶条件。例如，已知在冷却聚合物熔体期间的流动和/或剪切条件影响组合物中晶体结构的形成。在一个非限制性实施方案中，骨架包含聚合物组分，所述聚合物组分使骨架具有强度和耐久性，但仍是弹性体，从而使得骨架的力学性质与伤口周围的天然组织或需要组织再生的部位的力学性质类似。
如本文描述，根据某些非限制性实施方案，可生物降解骨架的一个或多个聚合物组分是弹性体的。在一个非限制性示例中，骨架具有与软骨类似的物理性质。在某些非限制性实施方案中，可生物降解骨架包含高度可扩张的聚合物组分。适宜的聚合物的示例包括具有断裂应变的那些聚合物，所述断裂应变的范围为大约100％至大约900％，包括其间的任何增量(increment)，例如在200％与800％之间或在325％至600％之间。在其他的非限制性实施方案中，聚合物的断裂应变在50％至100％之间，包括在其间的任何增量。进一步的，选择拉伸强度从10kpa至30mpa(包括其间的任何增量，如从5mpa至25mpa，和在8mpa与20mpa之间)的聚合物通常是有用的。在某些非限制性实施方案中，初始系数在10kpa至100mpa之间，包括其间的任何增量，如在10mpa与90mpa之间且在20mpa与70mpa。
由以下非限制性实施例说明本发明。
实施例
实施例1、材料与方法
化学制品与试剂。由mpbiomedical(solon,oh)获取来自猪胃粘膜的胃蛋白酶。由sigmaaldrich(st.louis,mo)获取溶组织梭状芽孢杆菌(clostridiumhistolyticum)的胶原酶。由thermoscientific(waltham,ma)获取蛋白酶k溶液、quant-itpicogreendsdna测定试剂盒和核酶rnasea。由qiagen(valencia,ca)获取无rnsase的dnase。
ecm生物骨架生产
真皮ecm。如前文所述制备真皮ecm。简而言之，由市售(marketweight)(～110kg)猪(tissuesource,inc.,lafayette,in)收获全厚皮肤，皮下脂肪和表皮通过机械分层去除，然后用0.25％胰蛋白酶(thermofisherscientific,waltham,ma)处理6h，用70％乙醇处理19h，用3％h2o2处理15分钟，用0.26％edta/0.69％tris中的1％tritonx-100(sigma–aldrich,st.louis,mo)处理6h，再进行另外16h的溶液变化，用0.1％过乙酸/4％乙醇(rochestermidland,rochester,ny)处理2h。用替换的水在各个化学变化之间进行水洗，在最后步骤之前进行磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤。全部化学暴露在搅拌下，在轨道摇床上，以300rpm进行。然后，冻干真皮ecm并使用带有#40网筛的wiley磨机研磨为颗粒形式。
膀胱基质(ubm)。如前文所述制备ubm(wolf等biomaterials2012oct；33(29):7028-38)。来自市售动物的猪膀胱由组织来源获取，llc(lafayette,indiana)。简而言之，机械去除浆膜、外肌层、粘膜下层和粘膜肌层。通过用去离子(di)水洗涤将粘膜层的腔尿路上皮细胞与基底膜分离。剩余的组织由基底膜和下方的粘膜层的固有层组成，且通过在0.1％过氧乙酸和4％乙醇中以300rpm搅拌2小时来去细胞。然后，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)和无菌水大量冲洗组织。然后，再冻干ubm并使用带有#60网筛的wiley磨机研磨为颗粒形式。
小肠黏膜下层(sis)。前文已描述了sis生物骨架的制备。简而言之，由6月龄市售(240-260lbs)猪收获空肠，并纵向切开。机械去除粘膜层浅层。同样地，机械去除浆膜和外肌层，留下粘膜层的粘膜下层和基底部分。通过在0.1％过氧乙酸和4％乙醇中以300rpm搅拌2小时来完成组织的去细胞化和杀菌。然后，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)和无菌水大量冲洗组织。然后，冻干sis并用带有#60网筛的wiley磨机研磨为颗粒形式。
bardxenmatrixtm(猪真皮),
ecm样本的酶消化。将ecm样本冻干至干燥，人工切成小片并使用带有#60网筛的wiley磨机研磨为粉末。通过以下方式进行酶消化：室温下在缓冲液(50mmtris-hcl,ph8,200mmnacl)中用0.1mg/ml蛋白酶k消化每个5mg/ml干重的样本24小时；室温下在缓冲液(50mmtrisph8,5mmcacl2,200mmnacl)中用0.1mg/ml胶原酶消化每个5mg/ml干重的样本24小时；或室温下在缓冲液(0.01mhcl)中用1mg/ml胃蛋白酶消化每个5mg/ml干重的样本24小时。在进行核酸提取之前，用naoh中和胃蛋白酶促溶样本至ph8.0。通过在盐缓冲液(50mmtris-hcl,ph8,200mmnacl)或酸性缓冲液(0.01mhcl)中再悬浮每个5mg/ml干重的样本来而不用酶处理来制备未消化的样本(对照)。
核酸提取和打谱(profiling)。通过添加等体积的ph8的苯酚和氯仿从ecm粉末样本中提取核酸。对样本进行简单地涡旋，并在12,000x离心10分钟，将水相转移至新的试管中。通过添加1/10体积3m的醋酸钠和3体积的100％乙醇使核酸沉淀，倒置混合，4℃、20,000xg下离心20分钟。核酸微丸用75％乙醇洗涤一次，并再悬浮于无核酸酶的水中。使用agilent2100生物分析仪(agilenttechnologies)或通过在2％(wt/vol)琼脂糖凝胶进行电泳并用溴化乙锭染色来分析回收的核酸的碱基对长度。使用thermoscientificnanodrop1000分光光度计通过在260nm处的uv吸光度对总核酸定量。根据制造商推荐的方案使用quant-itpicogreendsdna测定试剂盒对dsdna定量。
rna分离。使用mirneasymini试剂盒(qiagen,valencia,ca)分离细胞rna以及ecm“游离rna”(由于去细胞过程而截留在ecm生物骨架内)。根据制造商的说明书经seramir试剂盒(sbi,mountainview,ca)分离纳米囊泡rna。在纳米囊泡rna分离之前，于37度用2单位(10μg/ml)的rnase(abi,fostercity,ca)处理样本30分钟以降解任意受污染的rna，如来自去细胞过程的剩余rna(“游离rna”)。通过加入rnase抑制剂(abi,fostercity,ca)使反应终止。使用nanodrop分光光度仪(nanodrop,wilmington,de)确定rna量，经agilent生物分析仪2100(agilenttechnologies,santaclara,ca)确定其质量。
纳米囊泡分离。以500g(10分钟)、2,500g(20分钟)和10,000g(30分钟)对消化物进行连续离心以去除胶原原纤维剩余物。上述每个离心步骤进行三次。然后，于4℃在100,000g(beckmancoulteroptimal-90k超速离心机)下离心无纤维上清液70分钟。洗涤100,000g微丸并悬浮于500μlpbs中。不用ecm而对消化酶进行上述过程，作为对照。
纳米囊泡成像。在负载于碳包覆的网格上且在4％多聚甲醛中固定的ecm运载体上透射电子显微镜(tem)成像。用具有高分辨率amt数字摄像头的jeol1210透射电子显微镜在80kv使网格成像。使用jeoltem软件根据表征图像确定mv的大小。
凝胶电泳和western印记。使用pierce二喹啉甲酸蛋白质定量测定试剂盒(piercechemical,rockford,il)确定纳米囊泡蛋白质浓度，并再悬浮于含有5％β-巯基乙醇(sigma,st.louis,mo)的薄片缓冲液(r&dsystems,minneapolis,mn)中。然后，将相同浓度的蛋白质负载在5％-15％梯度sds-page(bio-rad,hercules,ca)的孔中。在双蒸馏水中的运行缓冲液(25mmtris碱，192mm甘氨酸和0.1％sds)中，在150mv，使用mini-protean电泳模块组件(bio-rad)进行电泳，然后再在转移缓冲液(25mmtris,ph7.5,192mm甘氨酸,20％甲醇和0.025％十二烷基硫酸钠)中在280ma半干燥转移至聚乙二烯二氟化物膜(millipore,bedford,ma)，进行45分钟。然后，再用pierce无蛋白质阻断缓冲液(piercechemical,rockford,il)对膜进行阻断45分钟，并且用如下的一抗温育过夜：cd63和cd81(sbi,mountainview,ca)。在用适宜的二抗温育膜之前和之后各洗膜三次，每次15分钟。将经洗涤的膜暴露于化学发光底物(bio-rad)，然后使用chemidoctouchinstrument(bio-rad)进行可视化。
纳米囊泡尺寸的确定。将纳米囊泡稀释在无颗粒pbs中，采用所述纳米颗粒追踪分析(nta)(webber,j.&clayton,a.howpureareyourvesicles)确定其大小。简而言之，通过使用nanosightlm10仪器(nanosightnta2.3nanoparticletrackingandanalysisreleaseversionbuild0025)进行nta测量。通过用装配有快速视频捕获和颗粒追踪软件的nanosightlm10系统(nanosight,wiltshire,unitedkingdom)测量布朗运动的速率来分析纳米囊泡的尺寸分布。将纳米囊泡稀释在无颗粒pbs中并且注入到nanosight样本室中。确定平均±标准偏差(sd)尺寸分布。
rna测序。采用iontotalrnaseqkitv2并且根据制造商的说明书制备小rna文库。简而言之，在10-20nt范围内的基于珠的尺寸选择rna之后，通过对索引测序连接物进行杂交和连接，再进行逆转录和pcr，产生cdna。使用基于珠的方法再次对所扩增的文库进行大小选择并在生物分析仪上运行以验证文库大小分布符合预期。使用iononetouch2系统以对所制备的文库进行自动乳化pcr和进行模板化的ionspheretmparticle(isp)富集。使用单一p1测序芯片在ionproton上进行测序。移除质量过滤器，以便报告所有序列数据。分析序列用于质量控制(fastqc)并采用torrentsuite与人基因组(hg19)比对。上传输出文件(.bam)，作图到mirbasev2.0并采用clcgenomic(qiagen,valencia,ca)进行进一步分析。将读数标准化至每百万条读数(rpm)的读数。
独创性路径分析。通过独创性路径分析(ipa)来分析经rna测序鉴定的mirna以确定mirna信号传导路径标记。
qpcr。使用sybrgreen基因表达测定(abi，fostercity,ca)来确定inos、tnfa、stat1、stat2、stat5a、stat5b、irf3、irf4、irf5、il1rn、cd206、tgm2、stat3、stat6、klf4、pparg的相对表达水平。通过δδct法分析结果，使用β-葡萄糖醛酸酶(β-gus)对照以使结果标准化。以纳米囊泡对照为基准计算倍数变化。
细胞培养。如前文所述分离血管周干细胞(pvsc)(imothy等，biomaterials.2013sep；34(28):6729-6737)。于37℃，在5％co2中，在含有20％胎牛血清(fbs，thermofisher)、100u/ml青霉素和100ug/ml链霉素(sigmaaldrich)的高葡萄糖dulbecco改良的eagle培养基(dmem,invitrogen)中培养分离的细胞。
从美国典型培养物保藏中心(atcc,manassas,va)获得c2c12肌肉成肌细胞并根据atcc指南在补充有10％fbs和1％青霉素/链霉素(sigmaaldrich)的dmem(invitrogen)中进行培养。
从atcc获得thp-1人单核细胞并于37℃在含有5％co2的潮湿气氛下保持在rpmi、10％fbs、1％青霉素/链霉素和0.05mmβ-巯基乙醇中。用320nm12-十四烷酰佛波醇13-乙酸酯(pma)对每孔两百万个thp-1细胞进行铺板24小时以诱导分化为巨噬细胞。在pbs中洗涤附着的巨噬细胞并置于新鲜的培养基中，然后在新鲜的培养基中进行72小时温育直至休眠(rest)。用pma分化的且休眠的thp1巨噬细胞已显示出具有与人外周血巨噬细胞几乎不可区分的活性(diagneault等plosone2010jan13；5(1):e8668)。如前文所述分离和表征源自小鼠骨髓的巨噬细胞(bmdm)(sicari等biomaterials2014oct；35(30):8605-12)。简而言之，从6-8周龄的c57b1/6小鼠收获骨髓。采用无菌技术，去除从近端后肢到脚的皮肤，踝骨和后膝关节脱节，并分离胫骨。类似地，使髋股关节脱节以股骨分离。将骨保留在冰上并在含有巨噬细胞完全培养基的无菌盘中冲洗，所述巨噬细胞完全培养基由dmem、10％胎牛血清(fbs)、10％l929上清液、0.1％β-巯基乙醇、10mm非必需氨基酸和10mmhepes缓冲液组成。然后，横切每个骨头的端部，使用30-号针以完全培养基冲洗骨髓腔。洗涤收获的细胞并以106细胞/ml铺板，并允许细胞分化为巨噬细胞，进行7天，每隔48小时更换一次完全培养基。在补充有热灭活的10％胎牛血清的dulbecco改良的eagle培养基(dmem)中使n1e-115细胞(一种小鼠成神经细胞瘤细胞系)生长。在加入纳米囊泡之前在6孔板中铺板1百万个细胞。
纳米囊泡荧光标记。根据制造商的说明书使用exo-glow(sbi,mountainview,ca)标记纳米囊泡。简而言之，用exo-glow标记500μl再悬浮的纳米囊泡并在37℃下温育10分钟。加入100μlexo-quick-tc以停止反应，将样本置于冰上30分钟。然后，在14,000下离心样本10分钟。去除上清液，用500μl1xpbs再悬浮微丸。然后，将体外细胞暴露于标记的纳米囊泡4小时并经axioobserverz1显微镜成像。
体外刮擦测定。如上文所述，在6孔板中培养细胞。当培养物是融合性的(24h后播种)时，将纳米囊泡加入至培养基中。通过模拟“伤口”的融合性细胞层，使用p-200移液管尖端，划两条竖直线。由axioobserverz1显微镜每20分钟获取图像。
迁移测定。通过对血管周干细胞(pvsc)进行8mmcytoselect细胞迁移测定(cellbiolabs,sandiego,ca)来评估纳米囊泡影响细胞功能的能力。对pvsc饥饿培养并用纳米囊泡在未添加生长因子的含有0.5％热灭活的fcs的培养基中处理14-17h。用胰蛋白酶收获饥饿培养的细胞，以4×105个细胞/ml的浓度下再悬浮于无血清培养基中，并在潮湿的95％空气/5％co2在37℃温育箱中预温育1h。将96孔膜室镶块置于进给器托盘上，将100μl的细胞悬浮液加入至膜室的每个孔中，终浓度为每孔40,000个细胞。覆盖孔板，并在95％空气/5％co2中在湿润的气氛下于37℃温育4h。将150微升的细胞脱落溶液加入至干净的收获盘的每个孔中。96孔膜室与进给器盘分离，通过吸气去除膜室顶侧上的剩余细胞，将膜室置于含有细胞脱落溶液的收获盘上并在细胞培养温育器中温育1h，将来自膜底部的任意细胞冲洗至收获盘孔中。通过在裂解缓冲液中稀释(1:75)染料来制备cyquantgr染料＝细胞裂解溶液，从收获盘中移去膜室，将50ml的染料＝细胞裂解溶液加入至收获盘的每个孔中。在室温下温育盘20分钟以裂解细胞和对核酸染色。然后，将每个孔的150微升内容物转移至适用于荧光测量的板中。在480-520nm用spectramaxm2酶标仪(moleculardevices,sunnyvale,ca)测量荧光。每个实验条件测试三次，对每个条件确定迁移的细胞平均数。双配对t检验用于检测纳米囊泡处理的细胞与对照之间的显著差异。p值<*0.05被认为是显著的。
巨噬细胞免疫标记。ecm降解产物已表明会影响巨噬细胞表型。进行巨噬细胞免疫标记以评估ecm包埋的微囊泡是否对巨噬细胞表型有相似的影响。分离源自原代小鼠骨髓的巨噬细胞(bmdm)，使用为促炎性细胞因子“m1-样”和抗炎性“m2-样”(分别)表型的强指示剂的两个标记物(inosandfizz-1)。用于免疫荧光染色的一抗为：(1)单克隆抗f4/80(abcam,cambridge,ma)，1:200稀释，用于泛巨噬细胞标记物；(2)多克隆抗inos(abcam,cambridge,ma)，1:100稀释，用于m2标记物；(3)多克隆抗fizzl(peprotech,rockyhill,nj)，用于m2标记物。在由pbs，0.1％triton-x，0.1％tween-20、4％山羊血清和2％牛血清白蛋白组成的阻断溶液中在室温下温育细胞1h以预防非特异性结合。去除阻断溶液，于4℃在一抗中温育细胞16h。在pbs中洗涤后，室温下，在荧光团共轭的二抗(alexafluor驴抗大鼠488或驴抗兔488，invitrogen,carlsbad,ca)中温育细胞1h。在用pbs再次洗涤之后，成像前，用4’6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)复染细胞核。使用活细胞显微镜拍摄每个孔的三个20x场的图像。根据细胞因子处理的巨噬细胞的曝光次数(作为对照)对ecm处理的巨噬细胞的曝光次数标准化。使用cellprofiler管道就阳性f4/80，inos和fizz-1百分率对图像进行定量。
实施例2、ecm生物骨架材料中核酸的定量
ecm纳米囊泡的发现是一项令人意想不到的研究结果，所述研究是为了评价生物骨架是否存在替代形式的核酸作为去细胞过程的剩余物。尽管双链dna(dsdna)的定量通常用作评估去细胞效率的度量标准，但是在这些分析中忽视了对其他形式的核酸如rna或单链dna(ssdna)的定量。为确定在ecm生物骨架中是否存在替代形式的核酸，采用苯酚：氯仿法从粉碎的(非细胞)ecm骨架材料中提取核酸。采用picogreen测定对dsdna定量。通过260nm处的uv吸光度对总核酸定量，这检测到存在的所有形式的核酸，包括rna。结果显示dsdna的量仅代表存在于去细胞的ecm骨架材料中的总核酸的部分(图1)。令人惊讶的是，观察到如果在核酸提取之前先用各种蛋白酶对这些ecm骨架进行酶消化，则总核酸的量与未消化的(对照)样本相比显著增加。重要的是，该总核酸的增加并不是由于增加了dsdna，这意味替代形式的核酸以某种方式被封装在ecm中并被ecm保护。在所测试的所有形式的ecm骨架中都能观察到这种模式，所测试的所有形式的ecm骨架包括膀胱基质(ubm)和
实施例3、生物骨架的酶消化释放小rna分子
为确定在ecm骨架中是否存在rna，将核酸提取暴露于dnasei或rnasea核酸酶中，通过琼脂糖凝胶电泳分析产物(图2a)。结果显示dnasei处理去除了所有的核酸材料，除了～25与200bp之间的弥散的带。反之，rnasea处理去除了该小核酸部分，表明这些短长度的核酸分子实际上为小rna分子。而且，与未消化的对照样本相比，这些小rna分子只有在酶降解ecm骨架后才可被高效提取(如图2a)，结果与图1观察的总核酸的增加平行。使用agilent2100生物分析仪进一步分析核酸制剂(图2b)。结果显示，与未暴露于核酸酶的样品(图2b，上幅)相比，dnasei处理去除了所有的核酸材料，除了25-200bp范围内的小rna分子(下幅)，从而证实了ecm骨架中存在小rna分子。尽管如2a和2b显示的结果是使用实验室产生的ubm骨架获得的，但是随后可在所测试的所有骨架中鉴定这些小rna分子(图2c)。有趣的是，在核酸提取之前，用rnasea核酸酶对酶消化的ecm骨架进行的预处理不能去除小rna分子(图2d)。rnasea不能从酶消化形式的ecm中去除小rna分子表明可能通过将rna并入纳米囊泡中而使rna被保护免受核酸酶降解，这保护了rna免受核酶活性的影响(koga等jgastrointestoncol.2011；2(4):215–222)。
实施例4、ecm包埋的纳米囊泡的鉴定
在四氧化锇固定的ubm片材上使用透射电子显微镜(tem)获得了包埋在ecm内的纳米囊泡的第一证据。圆形结构被鉴定为对锇染色阳性，表明存在脂质膜(图3a)。该观察表明这些纳米囊泡只有在对ecm骨架材料的酶消化后才能与基质分离。用只部分消化ecm骨架的胃蛋白酶(图3b，左幅)进行的酶消化揭示了这些纳米囊泡被真正地(literally)编织为基质本身的胶原蛋白网络。然而，在用胶原酶或蛋白酶k(图3b，右幅)对ecm骨架进行完全消化之后，这些纳米囊泡可与纤维网络完全分离。这些囊泡的结构、组分和大小与纳米囊泡和外泌体的期望相符。通过利用酶消化外加超速离心的策略，可从所有测试形式的包括可商购产物的ecm骨架材料中分离纯化出这些纳米囊泡(图3c)。这些结果表示首次鉴定出包埋在细胞外基质内的纳米囊泡。
然后，通过sdspage和银染评估不同产物之间的纳米囊泡蛋白质货物。人们发现跨越不同商品及其平行内部(in-house)产品的带模式显著不同。有趣的是，内部产品(ubm和sis二者)都呈现出类似的带模式(图3d)。
cd63和cd81是最常用的外泌体确认表面标记物。使用western印记分析(图3e)，在所有样本中均为检出cd63和cd81的阳性条带。阳性对照，即人骨髓衍生的间叶干细胞外泌体对这两个标记物呈阳性，然而，人的合并的血清外泌体仅对cd63呈阳性。这表明包埋在ecm内的纳米囊泡和外泌体与循环外泌体具有不同的特征。
进行纳米颗粒跟踪分析(nta)以确定每个样本的纳米囊泡的平均大小。发现所有样本都与范围在107nm-216nm的纳米囊泡尺寸一致(图3f)。
实施例5、ngs发现在纳米囊泡货物中存在独一无二的mirna标记
在rna分离步骤之前，用rnase处理来自不同的商品和平行内部产品中分离的ecm纳米囊泡30分钟以降解来自去细胞过程(“游离rna”)的任意剩余rna。进行该步骤以确保rna测序数据仅表示纳米囊泡内的rna。有趣的是，纳米囊泡能够保护其rna货物，且发现rna浓度无显著变化。进行rna测序以确定每个样本中存在明显的小rna谱。在与人基因组比对之前，用fastqc对测序数据进行质量检查。然后，使样本标准化以进一步分析并作图到mirbase(释放21)。每个样本鉴定出33-240个mirna并证实mirna丰富地存在于ecm包埋的纳米囊泡中(图4a)。虽然内部真皮样本显示最少量的不同的mirna(33)，但内部ubm的量最多(240)。显著地，在商品和内部产品之间存在超过50％共同的mirna，在
实施例6、暴露于ecm包埋的纳米囊泡可改变细胞行为
基于吖啶橙化学法标记分离自ubm的纳米囊泡。在图5a中，红色荧光代表rna，而绿色代表dna。证明成功标记了纳米囊泡内容物以及由肌成肌细胞c2cl2细胞吞噬的纳米囊泡货物。该实验是分离的纳米囊泡含量可与靶细胞整合的概念的证据。
发现在ubm-ecm降解产物处理后5天，成神经细胞瘤细胞(n1e-115)具有神经突延伸。仅使用分离自胶原酶消化的ubm的纳米囊泡模拟该了效果。令人印象深刻的是，在暴露于ubm纳米囊泡后的3天内，n1e-115细胞显示出了神经突延伸，而对照组无变化(图5b)。
然后确定血管周干细胞(pvsc)暴露于纳米囊泡是否会影响其在融合培养物中重新填充划伤区的能力。如图5c所示，在暴露后24小时的划伤测定中，暴露于纳米囊泡的pvsc可在受伤区域更快地恢复完全融合。此外，注意到，与对照相比，暴露于纳米囊泡后96小时细胞计数增加(图5d)。
评估ecm包埋的纳米囊泡对巨噬细胞极化的影响。已显示出ecm降解产物(如ubm和sis)可促进m2“样”表型(sicari等biomaterials2014oct；35(30):8605-12)。将bmdm暴露于分离自ubm的纳米囊泡中24小时。与il-4暴露对照类似，暴露于纳米囊泡中可促进m2“样”巨噬细胞活化。采用fizz-1免疫荧光染色确认m2巨噬细胞表型。显著地，注意到m1标记物inos无变化。
将纳米囊泡暴露于thp-1细胞中24小时后，采用qpcr检查m1和m2相关标记物的基因表达。m1标记物有显著变化。虽然观察到了tnf-a、stat5a/b和irf5基因表达水平增加，但stat1/2表达水平降低。在m2相关标记物幅内，tgm2和irf4都显示出在纳米囊泡暴露后的增加，但仅irf4发现有统计学显著差异。
实施例7、另外的分离方法
图8a和图8b示出的方法允许分离组织内的外泌体。首先，酶消化一块组织(其可以经预处理、冻干、冷冻、取自活检、尸检或其他来源)，然后再通过差速离心处理以便去除细胞、细胞剩余物和其他最终步骤中不期望的污染物。在这些离心步骤后，将上清液置于梯度顶部，所述梯度包括密度屏障，该密度阻隔物由典克沙醇、蔗糖或其他密度梯度介质制成。可根据待分离的组织和外泌体谱改变该介质的浓度。然后超速离心梯度，收集在密度屏障处的部分并再次超速离心以洗去密度梯度介质和其他不期望的剩余物。最终保留的微丸为分离自初始组织的外泌体。
可在本文公开的任意方法中使用从组织中收集的外泌体。这些方法也可用于打谱，处理细胞和进一步表征组织样本中存在的外泌体。
实施例8、ecm-纳米囊泡在募集细胞、促进细胞生长和促进细胞分化中的用途
先前的研究已显示出(非细胞)ecm生物骨架材料可以帮助结构性、功能性的骨骼肌修复和再生(mase等orthopedics.2010；33(7):511；sicari等tissueengparta.2012；18(19-20):1941–1948)。ecm-纳米囊泡可概括用完整的ecm-骨架观察的功能性肌肉重塑反应。使用体积肌肉损失的鼠模型。已表明，将ecm骨架置于肌肉损伤部位会导致从瘢痕组织沉积的默认反应至结构性重塑的结果的显著偏离(sicari等tissueengparta.2012；18(19-20):1941–1948)。ecm-纳米囊泡有利于完整生物骨架产生的多个作用，包括内源性干/祖细胞的募集和分化、区域血管生成、神经分布和先天免疫应答的调制。
a.体积肌肉损失的鼠模型：在这些研究中使用了在αsma启动子控制下表达gfp的αsma-gfp小鼠模型(c57bl6)。该转基因小鼠模型(yokota等stemcells.2006；24(1):13-22；kalajzic等bone.2008；43(3):501-510)允许在骨骼肌再生期间追踪浸润祖细胞。在小鼠的四头肌中造成临界尺寸缺陷。简而言之，直接在股四头肌之上做一个平行于股近端远端轴的0.5-1.0cm切口。使用无菌活检钳去除一段大约3mm2(大约70％的缺陷)的肌肉。该缺陷可用以下测试物品中的一者替换：1)ecm水凝胶；2)悬浮于无菌pbs中的ecm-纳米囊泡；或3)pbs运载体对照。未修复的缺陷作为对照组。ecm-水凝胶测试物品在缺陷中分层，用相同的ecm的片材覆盖，放置不可降解的聚丙烯缝合线以在组织收获时明确地鉴定损伤和/或移植。通过直接注射至损伤部位的边界处的伤口边沿来施用ecm-纳米囊泡和进行pbs对照处理。使用纳米囊泡定量和剂量反应实验作为指南来确定用于体内研究的适宜浓度。接受了ecm-纳米囊泡治疗的动物被随机地分为两个不同的组：组1在受到损伤时接受了单次注射，组2在损伤后第4天和第7天接受了额外的注射。在指定时间点处死小鼠，包括术后早期(3、6、12和24小时)和晚期(4、7、14和28天)时间点。在每个时间，缺陷位点与小部分的天然周围组织一起取出(explant)。由功效分析确定样本大小以实现<0.05d的显著差异，并进行统计分析。
组织形态学分析。将取出的标本固定在福尔马林中并用苏木精和伊红染色。采用先前确认的炎症和组织重塑响应方面的定量标准评估组织学切片(valentin等jbonejointsurgam.2006；88(12):2673-86)。标准包括细胞浸润的密度、浸润细胞的表型、血管分布、结缔组织结构、封装和移植部位内肌肉细胞的存在。在组织学评价中回避了缝合部位。
通过免疫标记确定巨噬细胞表型。对移植位点的切片进行免疫标记，如前文所述(brown等actabiomater.2012；8:978,2012)。将每个取出的标本暴露于泛巨噬细胞标记物(cd68)、m1巨噬细胞表型标记物(ccr7)和m2巨噬细胞表型标记物(fizz1)的抗体。使用装配有nuance多谱成像系统的nikone600显微镜对免疫标记的标本进行检查和成像。对荧光图像进行光谱分离和再着色以用于自体荧光去除和定量分析。以盲检方式评价图像，从而确定m2(fizz1+)细胞与m1(ccr7+)细胞的数目比。
功能评估。通过体外肌肉收缩研究来评估重塑组织的功能性。体外器官浴系统可用于研究由来自重塑肌肉和未损伤肌肉的分离的股四头肌肌肉条响应于电场刺激而产生的收缩力。确定并记录产生最大抽动反应的最优电压和组织长度。还采用标记的α-金环蛇毒素并对β-微管蛋白3免疫标记，评估再生组织的功能神经分布以鉴定神经纤维和功能运动终板。肌肉收缩和神经元标记的组合帮助对肌肉强度和功能进行评价。
血管周细胞的迁移。通过检测与cd146和ng2的阳性染色共定位的gfp信号来评估血管周祖细胞至损伤部位的浸润。可采用骨骼肌(myod、骨骼肌肌动蛋白、肌球蛋白和肌集钙蛋白)、神经(β-微管蛋白3、神经丝、gfap)和血管(cd31、vonwillebrand因子)的标记物组织学评估血管周细胞随时间对骨骼肌缺损的组织重塑的贡献。这些标记物与gfp标记的共定位用于鉴定这些细胞分化为骨骼肌组织重塑的关键结构。此外，血管周细胞的免疫标记物(即cd146、ng2和cd133)用于确认重塑组织内的未分化血管周细胞的存在。为了对从增殖到分化的再生转变进行形态学评估，还对肌肉切片进行了针对多个细胞增殖标记物(例如，ki67,pcna)的免疫组织化学染色。
分离自生物骨架的ecm-纳米囊泡的添加促进了响应于结构性m2样巨噬细胞表型的免疫调节和促进迁移的血管周细胞分化为新的肌纤维，伴随神经分布的增加。然而，虽然有所改善，但所有的肌肉功能并没有完全恢复。
因此，ecm包埋的纳米囊泡代表一类独一无二的具有与循环外泌体不同的生物特性和功能的外泌体，并可调节ecm骨架的与结构、功能重塑有关的诱导特性。
实施例9、通过将ecm再悬浮于加入了盐(kcl)的pbs中来分离源自ecm的纳米囊泡
将来自膀胱(ubm)的100mg冻干ecm再悬浮于pbs中，在37℃水合30分钟，然后，将不同浓度的kcl添加至ubm-pbs悬浮液中。在4℃温育含有kcl的悬浮液1h。在4,500g下离心样本30分钟以去除ecm组分，收集上清液，通过0.2um过滤器，转移至超速离心管中，其中上清液在100,000g下超速离心2小时形成微丸，并获得mbv。
通过测定rnase处理后的rna的量，比较源自ecm的纳米囊泡(也称为膜结合的囊泡(mbv))的数量。于37℃，在0.5ug/ul的浓度下，用rnasea处理最终的样本，随后，从样本中分离rna并定量。因为已知保护rna不被rnase降解的细胞外囊泡如mbv，所以获得的rna的量与mbv的量有关，因为任意未保护的rna都会被rnase降解且不可量化。
通过该方法，确定了将kcl添加至pbs可增加抗rnaserna的量，该量表示mbv的量，然而，kcl额外浓度高于0.4m并没有增加被分离的mbv的量(图9a)。透射电子显微术显示出采用kcl分离的mbv的特征形态和大小(图9b)。
实施例10、mbv的盐分离可产生与酶分离相当的mbv数目
为了比较用不同方法获得的mbv的量，采用两种基于酶的方法(胶原酶和蛋白酶k)和用kcl进行的盐分离来分离mbv。然后，基于在rnase处理之后和之前的rna量对mbv定量。
对于蛋白酶k和kcl，在rnase处理前后的rna数量之间未发现有显著差异，提示囊泡外的rna的量最小。在对胶原酶分离的mbv进行rnase处理前后存在较高的差异。这提示了rna的外部来源。有可能的是，因为胶原酶是纯化自细菌，所以其可能包括来自胶原酶的另外的剩余rna。能够去除酶的使用可防止将外来不期望的元素引入至制剂，如可包括在酶制剂内的那些。
蛋白酶k处理18和24小时后分离的mbv的量之间无差异，提示达到了通过该方法可获得的mbv的最大量。从kcl分离的mbv获得相同的量，表明这些方法的效率相似。24小时内，使用浓度为1mg/ml的胶原酶可获得比使用蛋白酶k和盐(kcl)更多的量(图10)。
实施例11、kcl分离的mbv的较高纯度允许使用诸如超滤的高效分离细胞外囊泡的方法
超速离心是最常用的分离细胞外囊泡的方法，因为超速离心可在产量与纯度之间提供充分的平衡。用于浓缩蛋白质的方法如超滤可产生较高的产量，但却纯度较低，因为它们可共同分离样本中存在的蛋白质。尽管超滤可获得较高的产量，但对于基于酶的mbv分离却是不可行的，因为酶可从ecm组分的消化中产生小片段，超滤不能将其与mbv分离。此外，因为超滤是浓缩蛋白质的方法，所以其会浓缩用于消化最终mbv制剂中的ecm的酶。使用盐解离mbv不产生任何来自基质的片段并使ecm保持在悬浮液中。然后，采用常规的离心步骤去除ecm，而mbv仍保持在上清液中。对该含有mbv的上清液进行超滤以分离mbv。
将用0.1mg/ml胶原酶超速离心(uc)分离的mbv与用kcl采用uc和超滤(uf)分离的mbv比较。为了确定kcl是否能够解离出在ecm中存在的所有mbv，用0.1mg/ml的胶原酶消化暴露于0.8mkcl后的微丸化的ecm，表明kcl处理后在ecm中仍留有mbv。使用kcl和超滤产生了所有所比较的方法的最高量的mbv，显示了四倍的产量(图11a)。然后，使用
实施例12、超滤的使用允许使用pbs分离mbv
磷酸盐缓冲盐水由0.01mmpo43-、0.137mnacl和0.0027mkcl构成。nacl和kcl用量的组合使盐的总浓度为0.139m。尽管低，也可仅使用pbs分离mbv，这是考虑到超滤允许分离较高产量的mbv(图4a)。为了说明它是pbs内的盐的作用而不是ecm再悬浮的作用，将样本再悬浮于水中，不产生mbv。
使用水进行再悬浮还会导致产生以下疑问：将ecm置于低渗介质如水中是否会导致mbv破裂，这是上述水制剂中不存在mbv的原因。为了回答这个问题，在超滤柱中对用pbs分离的mbv进行介质交换，使得pbs分离的mbv再悬浮于水中。在如图4b所示的混合物中仍可检测得到mbv。而且，为了更明确的表明可通过使用盐来分离mbv，将ecm再悬浮于含和不含kcl的磷酸钾(kh2po4)缓冲液中。仅用kh2po4缓冲液不能分离出mbv。然而，当添加了kcl时，获得了mbv(图4b)。
实施例13、盐分离的mbv具有与酶分离的mbv相当的生物学活性
为了测试因使用盐而从ecm中解离分离的mbv是否具有与用酶分离的mbv相同的生物特性，将小鼠骨髓源性巨噬细胞暴露于由这两种方法分离的mbv中24小时。将相同体积的mbv用于酶分离和盐分离(每毫升bmdm介质中30ul)的mbv，也测试较高量的盐分离的mbv(60ul/ml)。在暴露24小时后，从细胞中收集rna，进行rt-pcr，定量pcr用于分析cd206、pdk4、stat1、tnfa、klf4、arg1、inos的基因表达。结果显示在暴露于相同的体积和时间的条件下，用胶原酶和盐分离的mbv对基因表达有相似的作用，然而，盐分离的mbv得出比胶原酶分离的mbv和胶原酶对照低的inos和arg1表达(图5b)。这可能是由于由酶消化产生的与基于酶的方法共分离得到的ecm片段。由于胶原酶可用作分离这些mbv的酶，所以还用样本，其获自使用与用于分离mbv相同量的胶原酶，分离方案相同，但不添加ecm(胶原酶对照)，处理bmdm。如结果所示，剩余的胶原酶也可影响细胞的基因表达。
实施例14、mbv对肿瘤细胞的影响
图14和图15提供了示出结合基质的纳米囊泡对肿瘤细胞的影响的结果。显示了对两种示例性类型的肿瘤，胶质瘤和食管癌的影响。
实施例15、结合基质的纳米囊泡概括了细胞外基质对巨噬细胞表型的影响
已证明，最近描述的源自ecm的纳米囊泡(又称为结合基质的囊泡(mbv))能够概括ecm生物骨架的巨噬细胞活化作用，所述源自ecm的纳米囊泡从所述ecm生物骨架产生。当与mbv处理的对应物相比时，对特定mirna，mirna125b-5p、143-3p和145-5p的抑制会导致相反的基因表达谱和蛋白质表达，表明它们在促进调节巨噬细胞表型上有潜在的作用。因此，mbv及其mirna货物在巨噬细胞响应于ecm生物骨架中和在整个结构性重塑过程中起重要作用。
用0.1％胶原酶溶液，室温下，对微粒状的ubm-ecm或sis-ecm酶消化16小时。以增加的g力离心是得到的ecm以提取mbv。使用透射电子显微镜(tem)在100,000x放大倍率下使mbv可视化(图16a)。通过用吖啶橙标记mbv来确定mbv的细胞摄取。标记的mbv在添加至培养基后2小时即可在bmdm内看到(图16b)。通过对超过25种常用巨噬细胞活化标记物进行qpcr分析来评价mbv对巨噬细胞活化的影响，所述常用标记物包括表面标记物、细胞因子、转录因子和代谢标记物。用mbv处理的巨噬细胞的基因表达谱与用ecm处理的巨噬细胞的基因表达谱几乎相同(图16c)。将巨噬细胞暴露于胃蛋白酶或胶原酶中后几乎没有至没有观察到对基因表达的影响，表明这些用于在进行mbv提取之前消化ecm的酶不是巨噬细胞活化的原因。将bmdm暴露于ifnγ+lps(mifnγ+lps)或il-4(mil-4)中会导致基因表达发生明显改变具有相反的谱。
如图17所示，进行免疫标记以评价bmdm的蛋白质表达。与基因表达结果相似，mbv处理组具有与ecm处理组几乎相同的蛋白质表达谱。然而，与基因表达数据相反，ecm组与其对应的mbv组都具有与il-4处理组而非ifnγ+lps处理组相似的蛋白质表达谱。用sis-ecm和ubm-ecm及其对应的mbv进行的巨噬细胞处理导致fizz-1和arg-1(与mil-4表型相关的标记物)的阳性表达。在sis-mbv组中仅略微检测得到inos表达。仅在ubm-mbv组中检测到tnf-α。tnf-α和inos都是与mifn+lps表型相关的标记物。在对照组中无这些蛋白质的表达。超过99％的细胞表达了f4/80，这证实了其巨噬细胞的分化状态。
如图18所示，与胰蛋白酶大豆液体培养基相比，用mbv-sis处理的巨噬细胞分泌产物显著降低了金黄色葡萄球菌(s.aureus)的生长(p＝0.033)。用mir-125抑制剂、mir-143抑制剂和mir-145抑制剂中的每一个或其组合处理的巨噬细胞的条件培养基未降低金黄色葡萄球菌的生长。相反地，与胰蛋白酶大豆液体培养基相比，用杂乱的对照(scr)处理的巨噬细胞分泌产物显著降低了s.aureus的生长(p＝0.018)。
未处理的
通过摄取fitc-e来测量吞噬作用的基础水平。所有的巨噬细胞显示coli颗粒。用ifn-γ/lps的处理导致吞噬活性显著增加。ecm和源自ecm的mbv处理导致吞噬摄取显著增加。数据表明mbv可更有效地诱导吞噬作用或者当从ecm骨架中释放时变得更有活性。用ubm或sis处理的不同巨噬细胞的吞噬作用无显著差异。然而，与用sis-mbv处理的巨噬细胞相比，来自ubm的mbv会引起巨噬细胞的吞噬作用显著增加。
用rnase处理ubm-mbv和sis-mbv30分钟以降解已在ecm去细胞过程或mbv分离过程期间累积的任意剩余rna。然后，停止rnase反应，并从mbv中分离rna。由从mbv提取的rna构建小cdna文库。用ionproton平台读取该文库。在与人基因组比对之前，在尺寸和phred评分的基础上整理测序数据。将34％以上的小rna读取作图到人基因组内的已知序列中。读取标注为mirbase(释放21)。在ubm-mbv和sis-mbv中最频繁鉴定出的mirna序列如下表所示：
选择突出显示的mirna用于下游分析，因为它们都参与了巨噬细胞活化。(chaudhuri等jimmunol,2011.187(10):p.5062-8；banerjee等jbiolchem,2013.288(49):p.35428-36；zang等intjmolmed,2013.31(4):p.797-802)。为了研究mbv活化巨噬细胞的机制，在bmdm中抑制mir-145-5p、mir-143-3p和mir-125b-5p。qpcr显示成功抑制了mirna(图19a)。mir-145表达水平降低了70％以上，mir-143表达水平降低了65％，mir-125b表达水平降低了95％以上。
显示巨噬细胞是损伤后正常愈合和正常组织发育的关键调节因子。本文公开了mbv可很大程度地概括整个ecm对巨噬细胞表型的影响。因此，mbv，像ecm一样，可用于修饰巨噬细胞表型，如用于诱导调节性巨噬细胞。
鉴于所公开本发明的原理可应用其中的许多可能的实施方案，应认识到所说明的实施方案仅仅是本发明的优选示例，不应被视为限制本发明的范围。相反地，本发明的范围由以下权利要求限定。因此，我们要求保护落入这些权利要求的范围和精神内的全部我们的发明。
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