肝素铁复合物对慢性炎症性贫血的治疗应用的制作方法

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种肝素铁复合物对慢性炎症性贫血的治疗应用，尤其涉及以铁调素为靶点的低抗凝治疗应用。

背景技术：

慢性病贫血(anemia of chronic disease，ACD)发病率很高，仅次于缺铁性贫血。ACD多见于慢性疾病患者中，如风湿性疾病、肿瘤、慢性感染以及其他慢性病患者等。ACD治疗中，通常主要针对慢性疾病进行，如果有效，贫血可自动缓解，现有的抗贫血药物对ACD均无效。

ACD曾被称为“铁粒幼细胞贫血伴网状内皮系统含铁血黄素沉着症”，随着研究的不断深入，改称为“慢性病贫血”。ACD发病机理还不很清楚，主有三方面：(1)铁调素引起的铁代谢失调；(2)EPO分泌相对不足/作用钝化；(3)骨髓内红细胞生成受到抑制并伴随红细胞寿命缩短。ACD的铁代谢特点为血清铁下降，血清转铁蛋白水平正常或升高，血清转铁蛋白受体水平不升高，总铁结合率下降。铁代谢异常在ACD发病中发生的作用受到广泛关注，近年来，铁调素(Hepcidin)在ACD铁代谢异常的发病机制中越来越受到重视。

铁调素是Krause首先在2000年从人血中分离纯化出来，2001年Park等研究发现铁调素具有抗微生物特性。根据其合成部位在肝脏(Hep-)及其在体外的抗微生物(-cidin)特性而命名为hepcidin。随后研究发现，铁调素对体内的铁循环具有重要的调节作用而被命名为铁调素。铁调素能够与肝细胞表面的膜铁转运蛋白(ferroportin，FPN)结合，促进FPN的内化和降解而间接调节铁稳态。正常生理状况下，机体铁调素表达与铁水平呈负反馈关系。当机体铁过载时，肝脏合成分泌铁调素增多，加速了FPN的降解，即关闭了肝脏中储存的铁向血液中转运的出口，同时，也抑制小肠上皮细胞和巨噬细胞向血液中输送铁；当机体铁不足时，肝脏表达铁调素量减少，FPN通道开放增多，肝脏中的铁向血液中转运增加，同时小肠加大了对食物中铁的吸收，进而维持铁稳态。

研究显示，铁调素合成与炎症因子密切相关，如IL-6对HepG2细胞铁调素表达具有正向调节作用，当机体遭遇败血症、烧伤、炎性肠病、恶性肿瘤等病症时，通常伴有IL-6升高，IL-6刺激肝脏合成分泌的铁调素，后者抑制了小肠上皮细胞摄取食物铁及巨噬细胞向血液中释放铁的过程，于是，铁被封闭于储铁组织中难以被机体利用，从而导致贫血；同时，铁在胞内的累积会刺激氧化损伤通路，加速细胞衰亡，因此,靶向调节铁调素来治疗ACD成为研究热点。

Maura Poli等研究发现，肝素具有较好的抗铁调素活性，通过BMPs或IL-6通路调节体内铁调素的含量(Maura Poli et al，Heparin:a potent inhibitor of hepcidin expression in vitro and in vivo，BLOOD,VOLUME 117,NUMBER 3)，这为慢性炎症性贫血的治疗提供了一种途径；然而由于肝素的抗凝血活性带来的出血及血小板减少、出血并发症等副作用，限制其仅能小剂量或短时间使用。因此，开发具有以铁调素为靶点的低抗凝肝素治疗慢性炎症性贫血，具有良好应用前景。

技术实现要素：

针对上述现有技术存在的问题，本发明针对肝素用于慢性炎症性贫血的治疗进行研究，开发了肝素铁纳米复合物，一是发挥肝素的抗铁调素与抗炎活性，二是利用与肝素静电结合的铁离子抑制铁调素的作用，三是本发明发现形成肝素铁纳米粒可以大幅降低肝素的抗凝活性，从而可以使其可以更安全地用于ACD的治疗。

对于上述发明目的，具体的，本发明涉及以下技术方案：

首先，本发明公开了一种用于慢性炎症性贫血治疗的低抗凝的肝素铁纳米复合物，该肝素铁纳米复合物的制备方法为：将NaOH溶液加入FeCl3溶液中，按照摩尔比Fe³⁺:OH^-＝1:2混合后，调节pH至2.8左右形成亚铁离子[Fe(OH)2]⁺溶液，将亚铁离子溶液加入肝素溶液中，制备获得肝素铁纳米复合物。

具体的实施方案中，本发明所述用于慢性炎症性贫血治疗的低抗凝的肝素铁纳米复合物粒径为50-90nm，优选的，肝素铁纳米复合物粒径为60-70nm。

优选的实施例中，本发明所述肝素的平均分子量约为15000。

优选的实施例中，肝素铁纳米复合物的制备过程中，肝素:[Fe(OH)2]⁺＝1:1-1:4；更为优选的是，肝素:[Fe(OH)2]⁺＝1:2。

优选的，肝素铁纳米复合物的制备过程中，在超声条件下将亚铁离子溶液缓慢加入肝素溶液中，滴加完成后继续超声半小时完成肝素铁纳米复合物的制备。

其次，本发明公开了上述肝素铁纳米复合物在制备低抗凝药物中的应用。肝素具有抗铁调素与抗炎活性，例如，本发明所述的肝素铁纳米复合物可用于低抗凝水平的抗炎治疗。

尤其是，本发明公开了上述肝素铁纳米复合物在制备用于慢性炎症性贫血治疗的低抗凝药物中的应用。由于其低抗凝性质，制备药物可用于较高剂量或相应长时间服药方式。

优选的，所述用于慢性炎症性贫血治疗包括缓解炎症贫血、升高血红蛋白水平、降低铁调素含量、抑制细胞中铁调素转录。

本发明取得了以下有益效果：

(1)本发明发现肝素铁纳米复合物具有显著地降低铁调素含量的作用。炎症贫血模型组小鼠铁调素含量较正常对照组十分显著地升高(P＜0.01)；与炎症贫血模型组相比，肝素组及肝素铁组均能显著降低炎症小鼠铁调素水平(P＜0.05)，尤其是肝素铁组，其铁调素水平已经恢复到与正常组相同的水平(P>0.05)。

(2)本发明发现肝素铁纳米复合物具有显著地升高炎症贫血模型中血红蛋白水平的作用。炎症贫血模型组小鼠血红蛋白水平较正常对照组显著降低(P＜0.01)；与模型组相比，肝素组和肝素铁组小鼠血红蛋白水平均显著提高升高(P＜0.05)；虽然与正常组小鼠相比，肝素铁组小鼠血红蛋白水平仍具有显著差异(P＜0.05)，但二者的平均水平已十分接近。

(3)本发明由RT-PCR实验发现，肝素铁纳米复合物能够在较低浓度下(0.5-3.2μg/mL)即可显著降低HepG2细胞中铁调素的转录。

(4)本发明发现肝素形成肝素铁纳米复合物可显著降低其抗凝活性，与正常组比较，肝素十分显著地延长出血时间(P＜0.001)；与肝素组相比，肝素铁组的出血时间显著缩短(P＜0.001)；肝素铁组的出血时间与正常组比较没有显著性差异(P>0.05)。

附图说明

图1a为肝素粒径

图1b为肝素铁纳米复合物1粒径

图1c为肝素铁纳米复合物2肝素粒径

图1d为肝素铁纳米复合物3肝素粒径

图1e为肝素铁纳米复合物4肝素粒径

图2为肝素铁纳米复合物对炎症贫血小鼠模型铁调素表达的影响；*表示P<0.05；**表示P<0.01

图3为肝素铁纳米复合物对炎症贫血小鼠模型血红蛋白水平的影响；*表示P<0.05；**表示P<0.01

图4为肝素铁纳米复合物对HepG2细胞中铁调素mRNA含量的影响

图5为正常小鼠剪尾实验中肝素铁纳米复合物小鼠凝血时间的影响；***表示P<0.001

图6为炎症贫血小鼠模型中肝素铁纳米复合物小鼠凝血时间的影响；***表示P<0.001；**表示P<0.01

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

诚如本发明背景技术所述，肝素的抗凝血活性带来的出血及血小板减少、出血并发症等副作用，限制其在慢性炎症性贫血治疗中仅能小剂量或短时间使用。本发明的目的在于将肝素铁纳米复合物安全地应用于治疗以铁调素为靶点的炎症性贫血，且无出血风险。本发明所制备的肝素铁纳米复合物靶向铁调素治疗炎症贫血作用通过体内外实验进行了考察，分别为1)建立炎症贫血动物模型，考察了肝素铁对其血红蛋白含量及铁调素水平的影响；2)采用RT-PCR技术考察了肝素铁纳米复合物对于HepG2细胞铁调素mRNA水平的影响；3)采用小鼠剪尾实验考察了肝素铁纳米复合物的抗凝活性。

本发明所采用实验材料如下：

1.无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级的BALB/c小鼠，雌性，6～8周龄，体重20～25g，购于山东大学实验动物中心；

2.Hepg2细胞株，胎牛血清，DMEM培养基，PBS缓冲液等；

3.肝素钠(购于东营天东制药有限公司，平均分子量约为15000)，FeCl3·6H2O，NaOH，Trizol，氯仿，异丙醇，乙醇，松节油等；

4.实时定量PCR仪，马尔文电位测定仪、酶标仪等仪器；

实施例1肝素及肝素铁粒径的测定

实验设置肝素组、肝素铁复合物组进行实验。称取适量肝素，溶解得肝素溶液。

肝素铁纳米复合物制备：将NaOH溶液缓慢加入FeCl3溶液中，按照摩尔比Fe³⁺:OH^-＝1:2混合后，调节pH至2.8左右形成亚铁离子[Fe(OH)2]⁺溶液。根据肝素二糖结构中糖醛酸个数，肝素二糖结构中含有的硫酸基团和羧酸根基团数量，与[Fe(OH)2]⁺离子结合，制备成肝素:[Fe(OH)2]⁺＝1:1、1:2、1:3、1:4的复合物溶液，分别称为肝素铁复合物1、肝素铁复合物2、肝素铁复合物3、肝素铁复合物4，超声条件下将亚铁离子溶液缓慢加入肝素溶液中，滴加完成后继续超声半小时完成制备。

粒径的测定：制备完成后使用0.22μm滤膜过滤，收集过滤所得澄清溶液。使用Zetasizer Nano ZS分析仪以固定的173°散射角和外部光纤角度和633nm氦氖激光进行粒径得测量，所测结果为肝素铁复合物1粒径为85.94nm，肝素铁复合物2粒径为64.63nm，肝素铁复合物3粒径为74.73nm，肝素铁复合物4粒径为58.67nm，肝素所测粒径为0.69nm，如图1a-图1e所示。抗铁调素预实验，肝素铁复合物1-4性质相近，但肝素铁复合物2更优，因此选取肝素铁复合物2进行后续试验。

实施例2肝素铁复合物靶向抑制铁调素发挥抗炎症贫血的作用考察

1.肝素铁复合物对炎症贫血模型小鼠血浆中铁调素水平的影响

炎症贫血小鼠模型的建立、干预及血样采集：SPF级BALB/c小鼠，6～8周，体重20～25g，适应性喂养1周，环境温度25～28℃，自由饮食，饮水。采用数字法随机分成4组，即正常对照组、模型组、肝素用药组、肝素铁纳米复合物用药组。采用小鼠双肩胛骨脂肪拿给垫内注射0.1mL/20g的松节油建立炎症贫血模型；肝素用药组每天尾静脉注射6mg/kg的肝素，肝素铁纳米复合物用药组每天尾静脉注射6mg/kg的肝素铁。给药结束后取8只小鼠，摘眼球取血，加入EDTA抗凝。血液于3000r/min离心10min，收集血浆，-80°保存待测。

小鼠血浆铁调素含量的测定：每只小鼠取20μL血浆，按照小鼠铁调素ELISA检测试剂盒说明步骤，以酶标仪与450nm处测定炎症贫血模型小鼠血浆中铁调素含量。

结果如图2所示。与正常组相比，炎症贫血模型组小鼠铁调素十分显著地增加(P＜0.01)；与炎症贫血小鼠模型组相比，肝素组及肝素铁纳米复合物组铁调素水平均显著降低(P＜0.05)；尤其是肝素铁纳米复合物组，其铁调素水平已经恢复到与正常组相同的水平(P>0.05)，表明肝素铁纳米复合物可以显著降低炎症贫血小鼠铁调素水平，且使其恢复至正常水平。

2.肝素铁纳米复合物对炎症贫血模型小鼠血红蛋白水平的影响

炎症贫血小鼠模型的建立、干预及血样采集：SPF级BALB/c小鼠，6～8周，体重20～25g，适应性喂养1周，环境温度25～28℃，自由饮食，饮水。采用数字法随机分成4组，即正常对照组、模型组、肝素用药组、肝素铁纳米复合物用药组。采用小鼠双肩胛骨脂肪拿给垫内注射0.1mL/20g的松节油建立炎症贫血模型；肝素用药组每天尾静脉注射6mg/kg的肝素，肝素铁纳米复合物用药组每天尾静脉注射6mg/kg的肝素铁。给药结束后取5只小鼠，眼眦取血约150-200μL，放入抗凝管中。使用全自动血液分析仪进行检测，测定小鼠全血中血红蛋白含量。

实验结果如图3所示。与正常组相比，炎症贫血模型组血红蛋白水平显著降低(P＜0.01)；与炎症贫血模型组相比，肝素组和肝素铁纳米复合物组均显著提高血红蛋白水平(P＜0.05)；虽然与正常组小鼠相比，肝素铁纳米复合物组小鼠血红蛋白水平仍具有显著差异(P＜0.05)，但二者的平均水平已十分接近。

3.肝素铁纳米复合物对HepG2细胞铁调素mRNA表达的影响

实验设置肝素组、肝素铁纳米复合物组进行实验。每个实验组设置6个给药浓度，培养HepG2细胞，提取细胞总RNA，通过RT-PCR技术，得到不同细胞中铁调素mRNA的含量。结果如图4所示。肝素能够降低铁调素含量，在低浓度(0.5-3.2μg/mL)时即可显著降低细胞中铁调素mRNA表达。与肝素组相比，肝素铁纳米复合物在最小剂量时(0.5μg/mL)即可抑制铁调素mRNA表达，而后随着剂量增加铁调素mRNA表达量基本保持不变。

实施例3肝素铁复合物抗凝作用的考察

实验分为正常组、肝素组以及肝素铁纳米复合物组共3组进行实验。采用小鼠剪尾法进行实验，给药20min后，将小鼠放于固定器种，将尾部垂直，扎破小鼠静脉血管，造成小鼠静脉出血，从血液自行溢出开始计时，每隔30s用滤纸吸去血液，直至血液自然停止流出，记录每组小鼠出血时间。

实验结果如图5所示。结果表明，与正常组比较，肝素十分显著地延长凝血时间(P＜0.001)；与肝素组相比，肝素铁纳米复合物组的凝血时间显著缩短，(P＜0.001)；并且与正常组比较，肝素铁纳米复合物组的凝血时间没有显著性差异(P>0.05)。这表明本发明研制的肝素铁复合物可以有效消除肝素的抗凝活性，在用于贫血治疗时会更安全。

炎症贫血小鼠模型的建立、干预及血样采集：SPF级BALB/c小鼠，6～8周，体重20～25g，适应性喂养1周，环境温度25～28℃，自由饮食，饮水。采用数字法随机分成4组，即正常对照组、模型组、肝素用药组、肝素铁纳米复合物用药组。采用小鼠双肩胛骨脂肪拿给垫内注射0.1mL/20g的松节油建立炎症贫血模型；肝素用药组每天尾静脉注射6mg/kg的肝素，肝素铁纳米复合物用药组每天尾静脉注射6mg/kg的肝素铁。采用小鼠剪尾法进行实验，将小鼠放于固定器种，将尾部垂直，扎破小鼠静脉血管，造成小鼠静脉出血，从血液自行溢出开始计时，每隔30s用滤纸吸去血液，直至血液自然停止流出，记录每组小鼠出血时间。

实验结果如图6所示。结果表明，与正常组比较，肝素十分显著地延长凝血时间(P＜0.001)；与肝素组相比，肝素铁纳米复合物组的凝血时间显著缩短，(P＜0.01)；并且与正常组比较，肝素铁纳米复合物组的凝血时间没有显著性差异(P>0.05)。这表明本发明研制的肝素铁复合物在慢性炎症性贫血模型中亦可以有效消除肝素的抗凝活性。

本发明所举实施方式或者实施例对本发明的目的、技术方案和优点进行了进一步详细说明,所应理解的是,以上所举实施方式或者实施例仅为本发明的优选实施方式而已，并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内对本发明所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。