本发明涉及微生物技术领域，具体地，涉及一种海洋真菌土曲霉丁内酯类化合物丁内酯-i的制备方法和应用。
背景技术：
阿尔茨海默症（ad）和帕金森综合征（pd）等神经退行性疾病严重威胁老年人身心健康，目前的研究结果表明，它们的发生与氧化应激和神经炎症有着密切关系。β-淀粉样蛋白（aβ）、磷酸化微管蛋白（tau）、非结合铁的堆积以及多巴胺（da）的代谢等，能刺激活性氧簇（ros）的生成，引起氧化应激，损伤神经元，引起认知或运动功能障碍。氧化应激状态的持续激活能够进一步促进aβ和磷酸化tau的聚集和沉积和线粒体损伤等，最终导致神经退行性疾病的发生并加速其病理进程。抗氧化剂可以清除大脑中的氧化物并防止氧化物的形成，抑制促氧化酶活性，中和自由基，或通过螯合促进自由基生成的过渡金属离子，减轻炎症反应，进而起到保护神经的作用，缓解患者病症。
现有的应用于临床的阿尔茨海默症治疗药物主要是ache抑制剂，包括毒扁豆碱、加兰他敏、石杉碱甲、利斯的明、安吖啶他克林及哌啶多奈哌齐等，用于治疗帕金森氏症的药物主要是左旋多巴、金刚烷胺、司来吉兰等，这些药物价格昂贵，并且除了石杉碱甲外均具有一定的毒副作用。因此，筛选毒性低、活性好、产量高的天然来源的抗氧化-抗炎-神经保护剂对于神经退行性疾病的预防和治疗具有重要的现实意义。
技术实现要素：
本发明的另一目的在于提供上述丁内酯-i的制备方法。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一般情况下，丁内酯类化合物具有清除dpph自由基的作用，但是本发明的发明人发现，丁内酯类化合物丁内酯-i除了该作用外，还具有清除abts自由基和oh自由基的作用；在20～100μm的浓度范围内，该化合物可抑制raw264.7和bv-2细胞内no和活性氧的产生，这与该化合物能够显著抑制细胞内inos和cox-2蛋白的表达有关，因此，其具有较好的抗炎、抗氧化作用，在制备抗外周及神经炎症药物方面具有广泛的应用前景。
优选地，上述丁内酯-i在抑制外周和神经细胞内no和活性氧的产生方面的应用。
本发明的发明人发现，丁内酯-i对mpp+诱导的神经细胞损伤具有逆转作用，因此具有神经保护的作用，对神经退行性疾病具有潜在的较好的治疗作用。
优选地，上述丁内酯-i在制备治疗阿尔茨海默症药物或帕金森综合症药物中的应用。
本发明提供一种从海洋真菌土曲霉的代谢产物中制备丁内酯-i的方法。
s1.发酵：将海洋真菌土曲霉c23-3接种于真菌液体培养基中静置发酵后，收集菌丝体和发酵液；
s2.粗提：将步骤s1的发酵液经乙酸乙酯萃取后浓缩，菌丝体经有机溶剂超声提取后浓缩，将所得浓缩物合并后得粗提物；
s3.分离纯化：将步骤s2的粗提物进行减压硅胶柱梯度层析，经硅胶薄层层析检测，将含有目标物质的洗脱组分继续进行凝胶柱层析、反相硅胶柱和反相相制备液相色谱分离纯化，即得所述丁内酯-i；
其中，所述海洋真菌土曲霉c23-3于2018年1月22日保存于广东微生物菌种中心，保藏编号为gdmccno.60316。
本发明在对海洋真菌土曲霉c23-3的代谢产物进行分析时发现，其代谢产物中含有丁内酯-i，通过收集菌丝液和发酵液，并粗提和纯化其中的丁内酯-i可得到高纯度的丁内酯类化合物。
本发明所使用的真菌液体培养基为常规的的培养基，优选地，步骤s1所述真菌液体培养基的配方为：新鲜土豆汁400～600ml，海盐15～25g，蔗糖15～25g，蛋白胨3～8g，蒸馏水400～600ml，ph值6～8。
优选地，步骤s1中的发酵条件为静置发酵18～25天。
优选地，步骤s2中乙酸乙酯萃取的次数为2～4次。
本领域常用的有机溶剂均可用于本发明s2中对菌丝体进行提取，优选地，步骤s2中有机溶剂为氯仿、丙酮、乙酸乙酯、乙醇、甲醇中一种或几种。
优选地，步骤s2中有机溶剂超声提取的次数为2～4次。
优选地，步骤s3中减压硅胶柱梯度层析的条件为：依次用石油醚-乙酸乙酯和氯仿-甲醇进行梯度洗脱，收集以洗脱液体积比100:0～0:100梯度的洗脱的组分。
优选地，硅胶薄层层析的条件为：硅胶薄层层析板上展开剂为体积比2:1的石油醚-乙酸乙酯溶液，收集rf值为0.2～0.8的混合物组分。
优选地，凝胶柱层析的流动相为甲醇，流速0.5～1ml/min。
优选地，反相硅胶柱为ods反相硅胶柱层析，流动相为体积比2:3～3:2的甲醇-水。
优选地，反相制备液相色谱纯化的条件为：流动相为体积比1:3～3:2的甲醇-水，在硅胶柱填充10～15g反相硅胶，流速为4～8ml/min，收集保留时间为5～20min的主峰，得到的收集物即为所述丁内酯-i。
为了提高海洋真菌土曲霉c23-3的代谢产物中丁内酯-i的产量，本发明经过多次试验，找到了一种化学诱导剂zncl2。
优选地，步骤s1的真菌液体培养基中还含有诱导剂zncl2，所述诱导剂zncl2的含量为0.0001～1mm/ml。
上述诱导剂zncl2在提高海洋真菌土曲霉代谢产物丁内酯类化合物丁内酯-i的产量的应用也在本发明的保护范围内。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明发现丁内酯-i除可清除dpph自由基外，还可较好地清除abts自由基和oh自由基，具有较好的抗氧化、抗炎以及神经保护的活性，在制备抗神经退行性疾病药物方面具有良好的应用前景。
同时，本发明提供的丁内酯-i的制备方法，可成功制备得到该丁内酯-i，方法简单，易于实现大规模生产；且还可通过诱导剂的添加来优化培养条件，从而大幅提高其产量。
附图说明
图1为本发明提供的丁内酯类化合物丁内酯-i的核磁共振氢谱。
图2为本发明提供的丁内酯类化合物丁内酯-i的核磁共振碳谱。
图3为本发明提供的丁内酯类化合物丁内酯-i的细胞毒性作用和对lps诱导的bv-2(a)和raw264.7(b)胞内no的抑制作用。
图4为本发明提供的丁内酯类化合物丁内酯-i对lps诱导的bv-2(a)和raw264.7(b)胞内ros的抑制作用。
图5为本发明提供的丁内酯类化合物丁内酯-i对raw264.7胞内inos(a)和cox-2(b)蛋白表达的影响。
图6为本发明提供的丁内酯类化合物丁内酯-i对mpp+诱导的sh-sy5y细胞的保护作用。
图7为海洋真菌土曲霉c23-3化学诱导前后乙酸乙酯提取物的hplc对比分析谱图。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1海洋真菌土曲霉c23-3丁内酯类化合物丁内酯-i的制备方法
本实施例提供一种丁内酯-i的制备方法，具体如下：
发酵：将土曲霉（aspergillusterreus）gdmccno.60316接种于真菌液体培养基中静置发酵18～25天，过滤，分别收集菌丝体和发酵液；
其中，所述真菌液体培养基的配方为：
新鲜土豆汁400～600ml，海盐15～25g，蔗糖15～25g，蛋白胨3～8g，蒸馏水400～600ml，ph值6～8。
2.粗提：将步骤1获得的发酵液经乙酸乙酯超声萃取3次并浓缩，将步骤1获得的菌丝体用甲醇超声提取并减压浓缩，将所得浓缩物合并，即为粗提物；
3.分离纯化：
a.将步骤s2获得的粗提物经减压硅胶柱层析，依次用石油醚-乙酸乙酯和氯仿-甲醇进行梯度洗脱，收集以洗脱液体积比100:0～0:100梯度的洗脱的组分；组分特征为硅胶薄层层析板上展开剂为体积比2:1的石油醚-乙酸乙酯溶液展开下，rf值为0.2～0.8的混合物组分；
b.将步骤a收集的洗脱组分进行sephadexlh-20凝胶柱层析，流动相为甲醇，流速0.5～1ml/min；
c.将步骤b收集的洗脱组分进行ods硅胶柱层析，流动相为体积比2:3～3:2的甲醇-水；
d.将步骤c收集的洗脱组分进行反相制备液相色谱纯化，流动相为体积比2:3的甲醇-水，在硅胶柱填充14g反相硅胶，流速为4～8ml/min（优选5ml/min），收集保留时间为5～20min的主峰，收集得到的目标物质还符合下述特征：
（1）tlc检测收集在254nm紫外线照射下呈单个、均匀的黑色，310nm下呈均匀的蓝色荧光斑点，在254nm和310nm下呈暗蓝色斑点；茴香醛硫酸显色为紫色，铁氰化钾-三氯化铁显色为深蓝色，异羟肟酸铁显色为暗紫色物质；
（2）在检测用的薄层层析条件下rf值为0.5的物质；所述的检测用薄层层析板为gf254硅胶板，展开剂为体积比8:1的氯仿-甲醇；
（3）在检测用的高效液相分析条件下保留时间为17.3min的单一色谱峰的组分；所述的检测用高效液相色谱分析条件为agilent反相分析柱，填料粒径4微米，柱尺寸4.6mm×250mm，流动相为甲醇水溶液，0～5min甲醇比例从10%线性升至60%，5～20min，甲醇比例为60%，20～35min甲醇比例线性升至100%，35～45min甲醇比例线性升至10%，流速1ml/min。
4、经上述分离过程得到的化合物，确定为纯化合物。
该化合物具有以下理化和波谱特性：
无色油状物，核磁共振氢谱(1hnmr，meod,700mhz)δ7.59(d,8.4),6.87(d,9.1),6.54(dd,8.05,2.1),6.50(d,8.4),6.41(d,2.1),5.07(m),3.78(s),3.43(d,14.0),3.08(m),1.67(s),1.57(s)，如图1所示。
核磁共振碳谱(13cnmr，meod,176mhz)δ171.41,170.11,159.13,154.88,139.46,132.78,132.19,130.19,129.56,129.01,128.23,124.85,123.36,122.94,116.41,114.83,86.59,53.64,40.19,39.41,28.48,25.75,17.56，如图2所示。
结果表明，20l的c23-3发酵液可得到约1.5g的上述丁内酯类化合物丁内酯-i。
实施例2丁内酯-i的清除自由基实验
（1）测试方法
dpph自由基清除活性测试：以vc作为阳性对照。实验组（a1）：在96孔板中依次加入不同质量浓度的单体化合物nyy-1（0.05～100μm），晾干，依次加入dmso和0.16mm的dpph溶液各50μl；对照组（a2）：用50μl甲醇代替0.16mm的dpph溶液，其他同实验组；空白组（a3）：不加样品，其他同实验组；空白对照组（a4）：不加样品，其他同对照组。暗处反应30min，测定其在517nm波长处的吸光度值。用origin软件做清除率-浓度半对数曲线，计算其半清除浓度（ec50)值。
abts自由基清除活性测试：采用总抗氧化能力检测试剂盒（碧云天，s0119），在96孔板每个检测孔中加入200μl的abts工作液，将trolox标准溶液（10mm）配置成反应终浓度为7.5、15、30、45、60、75μm的标准品，分别取10μl于每个检测孔中，测定734nm处的吸光度值，绘制标准曲线；单体化合物nyy-1设置6个反应终浓度梯度（10～150μm），空白组用10μl甲醇代替样品，每组实验设置2个平行，同法测定其734nm处的吸光度值，用origin软件做清除率-浓度半对数曲线，计算其半清除浓度（ec50)值。
oh自由基清除活性测试：利用fenton反应体系，以vc作为阳性对照。实验组（a1）：在96孔板中依次加入feso4（9mm），水杨酸（9mm），不同质量浓度的单体化合物nyy-1（0.5～4mg/ml）和h2o2（8.8mm）各50μl；对照组（a2）：feso4（9mm），水杨酸（9mm），不同浓度的单体化合物nyy-1（0.5～4mg/ml）和h2o各50μl；空白组（a3）：feso4（9mm），水杨酸（9mm），甲醇和h2o2各50μl；空白对照组（a4）：乙醇和甲醇各50μl，h2o加100μl。37℃条件下反应1小时，测定其在517nm波长处的吸光度值。用origin软件做清除率-浓度半对数曲线。
（2）结果
丁内酯类化合物（nyy-1）对dpph自由基清除的半效应浓度（ec50）为27.3μm，优于阳性对照抗坏血酸为36.9μm；丁内酯类化合物对abts自由基清除的半效应浓度（ec50）为22.5μm，阳性对照trolox为8.1μm；丁内酯类化合物在10mm浓度下对oh自由基的清除率为20%，阳性对照抗坏血酸为48.9%。
上述结果显示，海洋真菌土曲霉c23-3丁内酯类化合物丁内酯-i具有良好的抗氧化活性。
实施例3丁内酯-i的胞内抗氧化、抗炎症活性测定
（1）测试方法
取对数期生长良好的小鼠小胶质细胞bv2和巨噬细胞raw267.4，随机分为空白对照组、lps组、丁内酯类化合物预处理+lps组。mtt法评价丁内酯-i对bv2和raw264.7细胞的自身毒性，gress法测定丁内酯i对lps诱导的bv2和raw264.7胞内no的抑制作用，dcfh-da荧光探针检测丁内酯-i对lps诱导的bv-2和raw264.7细胞内ros的抑制作用，westernblot测定丁内酯-i对raw264.7细胞内inos和cox-2蛋白表达的影响。
（2）结果
如图3~图5所示，该丁内酯类化合物丁内酯-i能够通过抑制lps诱导的小鼠小胶质细胞bv2和巨噬细胞raw267.4内no的产生，保护细胞免受氧化损伤，其ic50分别为46.0μm和16.7μm，并且在100μm条件下未表现出明显的细胞毒性；利用dcfh-da荧光探针检测结果表明，丁内酯i对lps诱导的bv-2和raw264.7细胞内ros的产生具有明显抑制作用，同时，在20～100μm的浓度范围内，该化合物能够显著抑制raw264.7细胞内炎症蛋白inos和cox-2的表达。
上述结果显示，海洋真菌土曲霉c23-3丁内酯i具有显著的胞内抗氧化活性，对lps所致raw267.4和bv2细胞炎症具有明显抑制作用，提示丁内酯i潜在的抗外周及神经炎症的作用。
实施例4丁内酯-i的神经保护活性测定
（1）测试方法
将生长状态良好的sh-sy5y细胞利用不同浓度（0.24μm，2.36μm，23.58μm）的丁内酯类化合物进行处理，24小时后测细胞活力，之后加入mpp+孵育24小时，测细胞活力。
（2）结果
丁内酯类化合物在0.24μm～23.58μm的剂量范围内对sh-sy5y细胞均无明显毒性。并且，丁内酯类化合物对mpp+诱导的sh-sy5y细胞损伤具有显著(0.24μm和2.36μm剂量)和极显著的逆转作用（23.58μm剂量），如图6所示。
实施例5化学诱导提高海洋真菌丁内酯-i产量的方法
1.诱导剂的配置：将zncl2利用无菌水溶解，配置成0.001～10mm（优选100µm）的水溶液；
2.培养：在2个250ml锥形瓶中分别加入100ml液体培养基，接种，28℃恒温自然光照培养1～3天（优选2天）天之后，每瓶加入10ml步骤1配置的诱导剂溶液，混合均匀，将加好样的锥形瓶在28℃条件下恒温培育18～25天；
3.粗提：将培养18～25天之后发酵液和菌丝体加入100ml乙酸乙酯浸泡过夜，超声萃取2～4次，将提取物浓缩干燥；
4.诱导前后上述丁内酯类化合物产量分析：
hplc分析结果显示（如图7），经过化学诱导（zncl2）之后1l发酵液中丁内酯-i的产量相当于诱导前（blank）3.2l发酵液中丁内酯-i的产量。