聚吡咯纳米球在制备防治阿尔茨海默病药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种聚吡咯纳米球的新应用，即用于制备防治阿尔茨海默病药物。

背景技术：

阿尔茨海默病（alzheimerdisease，ad）俗称老年性痴呆，是一种中枢神经系统变性病，其起病隐袭，病程呈慢性进行性，是老年期痴呆最常见的一种类型，主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等症状，严重影响社交、职业与生活功能。ad的病因及发病机理目前还未阐明，特征性病理改变为β淀粉样蛋白（aβ）沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结，以及神经元丢失伴胶质细胞增生等。大量研究表明，aβ在ad发病中起着主导作用。目前针对aβ的神经毒作用的防治措施主要有：减少aβ的生成、抑制aβ生成和形成纤丝、增加aβ降解或清除等。

有报道称，目前大致有六类物质对蛋白的抑制或者降解有相应的作用。这六类物质分别为：小分子多酚类、多肽及其衍生物、抗体、聚合物和各种纳米粒子等。这些抑制剂对蛋白的聚集能够起到一定的抑制作用，但同时也存在一些不足与缺点，如生物相亲性不好、本身具有一定的毒性、稳定性差等。因此，研发生物相亲性好、稳定性好的蛋白抑制剂，对于ad的防治有重要作用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种聚吡咯纳米球在制备防治阿尔茨海默病药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

聚吡咯纳米球在制备防治阿尔茨海默病药物中的应用，所述聚吡咯纳米球具体为表面经聚乙烯吡咯烷酮改性的聚吡咯（ppy-pvp）纳米球，其粒径为40-60nm，电位为20mv，具有抑制及降解aβ蛋白的活性，可作为治疗阿尔茨海默病的潜在药物。

所述ppy-pvp纳米球的制备方法包括以下步骤：

1）将聚乙烯吡咯烷酮（pvp，mw=3000-4000）用超纯水分散并在室温下搅拌30min；

2）向上述溶液中加入吡咯单体，并在室温下搅拌10min；

3）向上述混合液中快速滴加fecl3溶液，反应3h，离心洗涤得到ppy-pvp纳米球。

其中所用吡咯单体、聚乙烯吡咯烷酮与fecl3的质量比为1:8.1:6.07。

本发明所得ppy-pvp纳米球具有粒径小、易被清除、生物相亲性良好、光热强、稳定性好等优异特性。通过将aβ蛋白与ppy-pvp纳米球一起孵育发现，ppy-pvp纳米球中的pvp可以与aβ蛋白通过疏水作用结合从而使aβ蛋白的聚集受到抑制；此外，在镭射条件下，利用ppy-pvp纳米球中ppy的光热作用能将已纤维化aβ蛋白降解。即ppy-pvp纳米球对aβ蛋白显示出显著地抑制作用且对纤维化aβ蛋白具有明显的降解作用。

与其他淀粉样蛋白抑制剂相比，本发明的显著优点在于：

（1）本发明所述ppy-pvp纳米球粒径小、稳定性高、生物相容性好且易被体内清除；

（2）本发明所述ppy-pvp纳米球在低浓度时，对蛋白的抑制率可高达40%；

（3）本发明首次将ppy-pvp纳米球应用于抑制淀粉样蛋白聚集及降解纤维蛋白。

附图说明

图1为所得ppy-pvp纳米球的tem图；

图2为所得ppy-pvp纳米球的粒径分布图；

图3为不同浓度ppy-pvp纳米球随时间变化的光热图；

图4为aβ蛋白与不同浓度ppy-pvp纳米球（a）或ppy-pva纳米球（b）一起孵育不同时间所得的荧光强度图；

图5为aβ蛋白与不同浓度ppy-pvp纳米球一起孵育48h后的tem图，其中a为aβ（20μm）+0μg/mlppy-pvp，b为aβ（20μm）+2μg/mlppy-pvp，c为aβ（20μm）+50μg/mlppy-pvp；

图6为aβ蛋白与不同浓度ppy-pvp纳米球一起孵育48h后的afm图，其中a为aβ（20μm）+0μg/mlppy-pvp，b为aβ（20μm）+2μg/mlppy-pvp，c为aβ（20μm）+10μg/mlppy-pvp，d为aβ（20μm）+50μg/mlppy-pvp；

图7为aβ纤维蛋白与不同浓度ppy-pvp纳米球经不同镭射时间处理后所得的荧光强度图；

图8为aβ纤维蛋白与不同浓度ppy-pvp纳米球经镭射处理30min后的tem图，其中a为aβ（20μm）+0μg/mlppy-pvp，b为aβ（20μm）+2μg/mlppy-pvp，c为aβ（20μm）+50μg/mlppy-pvp；

图9为aβ纤维蛋白与不同浓度ppy-pvp纳米球经镭射处理30min后的afm图，其中a为aβ（20μm）+0μg/mlppy-pvp，b为aβ（20μm）+2μg/mlppy-pvp，c为aβ（20μm）+50μg/mlppy-pvp。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1ppy-pvp纳米球的制备

1）将0.2gpvp（mw=3000-4000）溶解到5ml超纯水中，并在室温下搅拌30min；

2）向上述溶液中加入26μl吡咯单体，并在室温下搅拌10min；

3）向上述混合液中快速滴加200μl0.75g/ml的fecl3溶液，反应3h，经离心洗涤得到ppy-pvp纳米球。

1.取所得ppy-pvp纳米球加入到去离子水中，配制浓度为1mg/ml的溶液，然后将其滴加到铜网上，待其干燥后进行电镜扫描，结果如图1所示。由图1可见，所得ppy-pvp纳米球的粒径为50nm左右。

2.取所得ppy-pvp纳米球加入到去离子水中，配制浓度为1mg/ml的溶液，用zeta粒度分析仪测定其粒径，结果如图2所示。由图2可见，所得ppy-pvp纳米球的光学粒径约为60nm。

3.取所得ppy-pvp纳米球加入到去离子水中，分别配成浓度为50μg/ml及100μg/ml的溶液，在808nm、2w·cm^-2条件下镭射处理10min，测定其温度变化，结果如图3所示。由图3可见，当ppy-pvp纳米球浓度为50μg/ml时，△t=20℃，说明其光热强。

实施例2

（1）对淀粉样蛋白aβ进行预处理，即将aβ蛋白先用高极性溶剂六氟异丙醇（hfip）溶解，配成浓度为1mg/ml的溶液，然后在4℃、450rpm条件下搅拌2h，经冷冻干燥后，用ph=7.4、10mm的pbs和去离子水分散，得到浓度为0.25mm的淀粉样蛋白储备液；

（2）将步骤（1）制备的淀粉样蛋白储备液与实施例1所得ppy-pvp纳米球按不同比例混合，使所得溶液中蛋白终浓度为20μm，ppy-pvp纳米球的浓度分别为0μg/ml、2μg/ml、10μg/ml、50μg/ml；然后将其分别加入到96孔板中，每孔加入100μl，于振荡器中37℃、150rpm进行振荡；

（3）每隔6h或12h测定荧光，测荧光前每孔加入100μl100μmtht，10min后，置于酶标仪中测定各样品溶液的荧光强度，结果如图4所示，并计算出ppy-pvp纳米球对蛋白的抑制率，计算公式如下：

。

另以相同尺寸的ppy-pva纳米球替代ppy-pvp纳米球按步骤进行处理作为对照。

由图4可见，含有ppy-pvp纳米球的蛋白溶液的荧光值比单独的aβ组低，说明ppy-pvp纳米球对蛋白的聚集具有一定的抑制效果；且随着ppy-pvp纳米球浓度的增高，抑制效果逐渐增强。经计算，2μg/ml、10μg/ml、50μg/mlppy-pvp纳米球对aβ的抑制率分别为45.4%、47%、53.2%。而当ppy纳米球表面修饰分子替换为pva分子时，其对aβ的抑制率不明显，2μg/ml、10μg/ml、50μg/mlppy-pva纳米球对aβ的抑制率分别为3.4%、4.3%、6.6%。通过对比相同浓度下ppy-pvp纳米球与ppy-pva纳米球对蛋白的抑制率可以推断，ppy-pvp纳米球对aβ蛋白起抑制作用的主要是表面的pvp分子，其通过强烈的疏水作用与蛋白结合，从而起到抑制蛋白聚集的作用。

实施例3

（1）将浓度为0.25mm的淀粉样蛋白储备液与实施例1所得ppy-pvp纳米球按不同比例混合，使所得溶液中蛋白终浓度为20μm，ppy-pvp纳米球的浓度分别为0μg/ml、2μg/ml、50μg/ml；然后将其分别加入到48孔板中，每孔加入800μl，于振荡器中37℃、150rpm进行振荡；

（2）两天后，将上述混合液分别滴加到铜网上，静置数分钟后用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1~2分钟后用滤纸吸去负染色液，再用蒸馏水洗1~2次，待其干燥后，进行电镜扫描，结果如图5所示。

由图5可知：不含ppy-pvp纳米球的aβ聚集形成纤维蛋白，且纤维蛋白呈细长形状；而含有ppy-pvp纳米球的蛋白aβ仅部分聚集形成纤维蛋白，纤维蛋白较短，这进一步证明ppy-pvp纳米球对aβ的聚集具有抑制效果。

实施例4

（1）将浓度为0.25mm的淀粉样蛋白储备液与实施例1所得ppy-pvp纳米球按不同比例混合，使所得溶液中蛋白终浓度为20μm，ppy-pvp纳米球的浓度分别为0μg/ml、2μg/ml、50μg/ml；然后将其分别加入到48孔板中，每孔加入800μl，于振荡器中37℃、150rpm进行振荡；

（2）两天后，分别对上述混合液进行超滤处理，然后取超滤上清20μl滴加到云母片上，待其干燥后用去离子水清洗1~2次，干燥后进行原子力显微镜（afm）测试，结果如图6所示。

由图6可见：不含ppy-pvp纳米球的aβ蛋白聚集形成纤维蛋白，含有ppy-pvp纳米球的aβ蛋白仅少量聚集形成纤维蛋白，进一步说明ppy-pvp纳米球对aβ的聚集具有抑制效果。

实施例5

（1）从浓度为0.25mm的淀粉样蛋白储备液中取一定体积的淀粉样蛋白储备液于4ml离心管中，然后置于37℃水浴中孵育2天，得到纤维蛋白，备用；

（2）将纤维蛋白与实施例1所得ppy-pvp纳米球按不同比例混合均匀，使得溶液中纤维蛋白的终浓度为20μm，ppy-pvp纳米球的浓度分别为0μg/ml、2μg/ml、10μg/ml、50μg/ml；然后将其分别加入到96孔板中，每孔加入100μl，于振荡器中37℃、150rpm孵育1天；

（3）1天后，将96孔板取出来，分别于808nm、2w·cm^-2条件下进行镭射，镭射时间分别为5min、10min、20min、30min；镭射后，向其中加入100μl100μmtht，10min后，置于酶标仪测定各样品溶液的荧光强度，结果如图7所示，并计算出ppy-pvp纳米球对纤维蛋白的降解率。

由图7可见：不含ppy-pvp纳米球的纤维蛋白受镭射强度影响小，而含有ppy-pvp纳米球的纤维蛋白的荧光值明显降低，表明镭射条件下ppy-pvp纳米球中ppy的光热性对纤维蛋白具有降解效果。

实施例6

（1）从浓度为0.25mm的淀粉样蛋白储备液中取一定体积的淀粉样蛋白储备液于4ml离心管中，然后置于37℃水浴中孵育2天，得到纤维蛋白，备用；

（2）将纤维蛋白与实施例1所得ppy-pvp纳米球按不同比例混合均匀，使得溶液中纤维蛋白的终浓度为20μm，ppy-pvp纳米球的浓度分别为0μg/ml、2μg/ml、50μg/ml；然后将其分别加入到96孔板中，每孔加入100μl，于振荡器中37℃、150rpm孵育1天；

（3）1天后，将96孔板取出来，分别于808nm、2w·cm^-2条件下镭射30min；将镭射后的纤维蛋白混合溶液分别滴加到铜网上，静置数分钟，然后用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体，滴上负染色液，染色1~2分钟后用滤纸吸去负染色液，再用蒸馏水洗1~2次，待其干燥后进行电镜扫描，结果如图8所示。

由图8可见：在镭射条件下，ppy-pvp纳米球对纤维蛋白具有降解效果。

实施例7

（1）从浓度为0.25mm的淀粉样蛋白储备液中取一定体积的淀粉样蛋白储备液于4ml离心管中，然后置于37℃水浴中孵育2天，得到纤维蛋白，备用；

（2）将纤维蛋白与实施例1所得ppy纳米球按不同比例混合均匀，使得溶液中纤维蛋白的终浓度为20μm，ppy纳米球的浓度分别为0μg/ml、2μg/ml、50μg/ml；然后将其分别加入到96孔板中，每孔加入100μl，于振荡器中37℃、150rpm孵育1天；

（3）1天后，将96孔板取出来，分别于808nm、2w·cm^-2条件下镭射30min；将镭射后的纤维蛋白混合液分别进行超滤，超滤后取上清20μl滴加到云母片上，待其干燥后用去离子水清洗1~2次，干燥后对其进行原子力显微镜（afm）测试，结果如图9所示。

由图9进一步表明：在镭射条件下，ppy-pvp纳米球对纤维蛋白具有降解效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。