一种共载siRNA与化疗药物的阳离子脂质-介孔硅复合纳米载体的制备方法与流程

本发明属于化学制药
技术领域：
，涉及一种共载sirna与化疗药物的阳离子脂质-介孔硅复合纳米载体的制备方法。
背景技术：
尽管近年来肿瘤化疗取得了长足进步，但在大多数恶性肿瘤治疗中仍效果不佳，其中一个重要原因是肿瘤细胞多药耐药性(multidrugresistance，mdr)的产生。mdr普遍存在于各类肿瘤细胞中，是化疗失败的主要原因。因此，抑制或逆转mdr对肿瘤治疗具有重要的理论和临床实际意义。mdr被普遍认为是肿瘤细胞对抗化疗药物毒性损伤的自我保护防御机制，其发生与多种因素有关。针对常见的耐药机制，人们设计了多种逆转mdr的方法，包括化学药物、免疫技术、基因技术等。其中，使用rna干扰(rnainterference，rnai)技术，利用mdr1-sirna通过特异性抑制mdr1编码的mrna，使p-gp的表达水平下调，增强肿瘤细胞对药物的敏感性，逆转效率高，可作为肿瘤治疗的新策略。纳米制剂用作抗肿瘤药物传递载体已有深入的研究与开发，近年来一些研究证实，有多种纳米载药系统不但可以增强药物对肿瘤的杀伤作用，还能降低肿瘤耐药性的产生及逆转mdr，同时不显著改变药物的体内处置过程，且可靶向肿瘤组织。因而，利用纳米载体技术克服肿瘤mdr，较其它策略更为可靠易行，具有广阔的开发应用前景。介孔二氧化硅(msns)是一种无机纳米粒，其用作化疗药物传递载体有诸多优势，包括理化性质稳定、比表面积大、孔径和粒度均一可控、可修饰性强以及生物相容性良好等，同时，msns也可与其它手段合用，如联合能够下调p-gp和诱导凋亡的sirna，共同作用于耐药细胞，增强克服mdr的效果。制备脂质体包裹msns，制成核/壳复合纳米粒(lmsns)新型传递系统，可获得更优良的载药性能。由于msns的支撑，提高了脂质双分子层的物理稳定性，载体进入细胞后脂质膜被溶酶体破坏，msns暴露，药物快速释放，从而达到减少胞外泄漏、于胞内集中释放的效果。更重要地，制备表面带有正电荷的阳离子脂质体，以msns包载化疗药物，以脂质体包裹载药msns，再通过静电作用于表面吸附mdr1-sirna，可实现化疗与基因治疗的协同作用，有效克服肿瘤的mdr。技术实现要素：本发明的目的在于提出了一种共载sirna与化疗药物的阳离子脂质-介孔硅复合纳米载体的制备方法，首先设计合成对mdr1基因具有高抑制效率的sirna序列，构建其表达质粒，以阳离子膜材制备脂质体(cationicliposomes，cls)，通过静电吸附作用携载mdr1-sirna；以msns包载化疗药物dox，再以脂质体包裹载药msns，即得sirna/dox-clmsns。该复合载体表面剩余的正电荷可使其与肿瘤细胞结合，载体进入细胞后脂质膜被破坏，sirna脱落并沉默mdr1基因，使p-gp蛋白的外排作用下降，同时msns暴露并释放dox，从而增强药物的细胞毒性、诱导细胞凋亡，在抑制mdr的基础上发挥协同抗肿瘤作用。其技术方案如下：一种共载sirna与化疗药物的阳离子脂质-介孔硅复合纳米载体的制备方法，包括以下步骤：(1)使用模板剂法合成介孔硅纳米粒，合成mdr1-sirna；(2)将介孔硅和化疗药物在有机溶剂中混合，清洗并干燥后得到载药介孔硅；(3)将载药介孔硅分散于溶有脂质类材料的氯仿溶液中，蒸干溶剂成膜后加入分散介质，超声至完全分散，过滤除菌，反复挤出调整粒径大小；(4)将sirna溶解后与脂质体溶液混合、静置即得。本发明中，步骤(1)中，介孔硅的粒径在40-100nm之间，孔径在1.2-6.0nm之间。介孔硅通过以下步骤合成：以表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵为模板剂，正硅酸乙酯为硅源，在碱性条件下反应，再在甲醇-hcl溶液和去离子水中回流，除去表面活性剂，得到介孔硅。本发明中，步骤(2)中，化疗药物可为疏水性药物或多肽、蛋白质、核酸类生物大分子。优选的，所述疏水性药物选自阿霉素(dox)、紫杉醇、伊利替康或顺铂中任一种。本发明中，sirna序列为5′-gattgcatttggaggacaa-3′。本发明中，脂质体由dotap、dopc、胆固醇、dppg制备得到。本发明中，介孔硅和化疗药物的质量比为2∶1-10∶1，介孔硅与脂质膜的质量比为1∶1-1∶2。本发明的有益效果为：①可融合msns比表面积大、载药量多以及独特的释药特性和脂质体生物相容性好的优势，克服两者的不足；②脂质膜的包覆可防止药物提前泄露，实现集中释药，并降低全身毒副作用。③以msns包载化疗药物、以阳离子脂质体负载mdr1-sirna，复合载体同时载运并传递化学药物与基因药物，④以sirna下调外排蛋白表达，联合使用脂质体与msns增强细胞摄取与药物蓄积性能、抑制肿瘤mdr，提高抗肿瘤化疗效果，在抑制mdr的基础上发挥协同抗肿瘤作用。附图说明图1：透射电镜图，其中，图1a为msns，图1b为liposomes，图1c为clmsns，图1d为sirna-clmsns的透射电镜图。图2：各纳米载体的zeta电位对比图。图3：各载药(dox)纳米样品的体外释放曲线图，其中，图3a为ph7.4，图3b为ph5。图4：体外抑瘤活性(mtt)结果。图5：不同载体在倒置荧光显微镜下的荧光成像结果。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。本发明采用模板法制备具有规则孔道结构的介孔二氧化硅纳米材料，再用阳离子脂质体将其包裹，通过静电作用于表面吸附mdr1-sirna，构建出能够在肿瘤细胞内集中定位释放药物、并有效抑制mdr、提高抗肿瘤活性的复合纳米载体。实施例1(1)介孔硅纳米颗粒的制备：在三颈瓶中加入磁石转子和1.0gctab，再加入100ml去离子水，95℃下搅拌30min。向瓶中加入160μldea液，继续搅拌15min。取8mlteos，缓慢滴加(滴加1个小时)，滴加完成后，回流3h，离心，弃去上清液。用甲醇-hcl溶液(4∶1)和去离子水交叉洗3次，去除模板剂。在50℃干燥箱中干燥12h，再真空干燥12h。即得平均粒径约为80nm的介孔硅纳米粒(msns)。(2)取介孔硅颗粒于10ml离心管内，加适量pbs分散，滴加5mg/ml的阿霉素(dox)溶液，混合后定容。搅拌24h，离心，用pbs冲洗至冲洗液无颜色时即得载药介孔硅(dox-msns)。(3)分别称取1，2-二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)30mg、胆固醇30mg、(2，3-二油酰基-丙基)-三甲胺(dotap)60mg、1，2-棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)30mg与圆底烧瓶，溶于8ml氯仿，取10mgmsns分散于以上氯仿溶液中，超声至完全溶解。将烧瓶安装到旋转蒸发仪上，设置温度60℃度，调好转速，关闭气阀，气压不超过0.03mpa，开始蒸发。待氯仿完全蒸干成膜后，打开气阀，取下烧瓶，加入分散介质，超声至完全分散，过滤除菌，反复挤出调整粒径大小，即得阳离子脂质体包裹的介孔硅纳米粒溶液(clmsns)。使用dox-msns重复以上制备过程，得载药阳离子脂质-介孔硅核/壳复合纳米粒(dox-clmsns)。另制备不包载msns的阳离子脂质体(cationicliposomes，cls)，使用普通磷脂材料同法制备普通脂质体(liposomes)，以及普通脂质体包载msns的lmsns。用马尔文粒径仪测定各纳米载体的粒径、pdi和zeta电位，结果见表1，表明所制备msns粒径小，分散度好，zeta电位为负值；liposomes与cls的粒径大于msns，cls的zeta电位很高；包载msns的lmsns与clmsns比不包载msns时略有变大、zeta电位明显降低，证明普通脂质体与阳离子脂质体均成功的包裹在msns表面。图1是msns(a)、liposomes(b)与clmsns(c)的透射电镜图。在图a中可以看出msns具有清晰的孔道结构，表面特征明显，图b、c中则能够清晰地观察到msns外包裹了一层明显的脂质体膜。表1.纳米载体的粒径与电位测定结果粒径(nm)多分散系数(pdi)zeta电位(mv)msns72.4±160.220-33.1±0.5liposomes143.8±250.2360.0±0.9cls174.0±310.18586.7±2.3lmsns160.2±270.277-13.1±0.8clmsns202.6±350.31444.8±2.3sirna-clmsns248.6±290.36323.1±3.8实施例2(1)化学方法合成两条与sirna1相对应的互补单链dna，两端带有hindiii和bglii酶切位点。退火后与经过双酶切的质粒pdual进行连接，将产物转化入大肠杆菌感受态dh5a，挑取单克隆菌落扩增培养，提取质粒并测序鉴定。(2)sirna1的负载：将干粉状的sirna离心10分钟，以375μl的deoc水溶解，将所得溶液与上述clmsns混合、静置即得，记为sirna-clmsns。用马尔文粒径仪测定sirna-clmsns的粒径、pdi和zeta电位，结果见表1，与clmsns相比，sirna-clmsns的粒径明显增大，zeta电位明显降低，这是由于带负电的sirna中和了其表面的部分正电荷。图1(d)是sirna-clmsns的透射电镜图，可以看出负载sirna后其粒径变大，且形状更为圆整。各纳米载体的zeta电位对比见图2。应用实施例1应用本发明实施例1、2中提供的各载体lmsns、clmsns、sirna-clmsns(均包载dox)，测定载药量与包封率。1.标准曲线的绘制：称取2.0mgdox，溶解在ph7.4的pbs中，配成0.04mg/ml标准溶液。进行梯度稀释，最终得0.04、0.02、0.01、0.005以及0.0025mg/ml的dox标准溶液。在490nm波长下测定吸光值并绘制标准曲线。2.取以上各载体，在12000r/min转速下离心10min，量取上清液的体积，测定上清液紫外吸光值，代入标准曲线求出上清液中阿霉素的dox。带入公式计算：载药量＝药物量(包载)/载体量包封率＝药物量(包载)/总药量。表2为载药量与包封率测定结果，各载体均能有效包载dox，其中clmsns的载药量与包封率最高，sirna-clmsns的载药量与包封率相对较低，这是由于负载sirna对其载药能力有一定的影响。表2.载药量、包封率测定结果lmsnsclmsnssirna-clmsns载药量(μg/mg)4.405.873.44包封率(％)83.5596.8158.53应用实施例2应用本发明实施例1、2中提供的各载体msns、lmsns、clmsns、sirna-clmsns(均包载dox)，测定体外释放度。将以上各载体放置于透析袋中，两端系口后置于盛有100ml释放介质的烧杯中(ph分别为7.4、5)，用保鲜膜密封烧杯。置于摇床，分别在10、30min及1、2、4、6、8、12、24h时刻取样用紫外分光光度计测吸光度。每次取液后补加等体积同ph的释放介质。将测得的吸光度值代入标准曲线计算，得到一系列的dox浓度。根据以下公式计算释放百分率；qn＝cnvo+∑civi(i＝0～n-1)释放百分率(％)＝q/w100％以时间为横坐标，药物释放度为纵坐标作图。图3为各载体在两种ph条件下的释放曲线图。结果表明ph为7.4时能看出药物释放度msns＞lmsns＞clmsns＞sirna-clmsns。因为msns的包封率较小，投药量相同，致使透析袋内游离的阿霉素的量较多，所以其释放度最大；带负电荷的lmsns比带正电荷的clmsns更容易释放药物；sirna的存在影响了dox的释放。ph为5时在短时间内msns释放度最大，随着时间的增加其释放度最小；因为随着时间的增加另外几种载体释放出较多的dox。此时sirna的影响小于ph的影响，所以lmsns＞sirna-clmsns＞clmsns，ph为5时即模拟肿瘤的弱酸性微环境更有利于药物的释放。应用实施例3以mtt法检测不同纳米载体(lmsns、clmsns、sirna-clmsns，均包载dox)载药进入细胞后的细胞毒性，检验体外抗肿瘤效果。将细胞密度达到80％-90％融合的mcf-7细胞用胰酶/edta消化，吹散使细胞分散均匀。以1×105个/孔接种于96孔板中，加入dmem培养液，放入37℃的co2培养箱中培养48h后，将系列浓度(dox浓度分别为1、5、10、20、50μg/ml)的药物载体加入到96孔板中，继续培养48h。孵育培养结束后，每孔加入20μl的mtt溶液继续孵育4h。弃去孔中液体，每孔加入100μl二甲基亚砜溶解生成蓝色(或蓝紫色)不溶于水的甲臜，将96孔板在气浴振荡器中振摇30min，用酶标仪在570nm波长处测定吸光度。图4为mtt测定结果，由结果可知各纳米载体载药后均能抑制肿瘤细胞生长，且均有明显的浓度依赖性，载药浓度越高，抑瘤效果越好，各载体载药后对mcf-7细胞的抑制作用明显高于游离dox(溶液)。在同等dox浓度的情况下clmsns杀死细胞的能力最强，因为其带正电荷，更易进入细胞。lmsns带负电荷，进入细胞的能力较弱，因此其细胞杀伤力低于其它载体。sirna-clmsn在低dox浓度情况下杀死肿瘤细胞的能力低于lmsns，随着dox浓度的增加情况相反。推测部分原因是因为sirna中和了阳离子脂质体的电荷，其电荷值介于lmsns与clmsns之间，因此入胞能力低于clmsns，在低dox浓度下脂质体表面负载的sirna干扰了dox的释放，随着dox浓度的增加，sirna大量从clmsns表面脱落进入细胞，有效抑制了肿瘤细胞的mdr作用，有利于dox分子滞留于细胞内，因此表现出了较强的抑瘤活性。应用实施例4考察并测定不同纳米载体(msns、lmsns、clmsns、sirna-clmsns)携载dox被细胞摄取的量，验证载体的细胞转运能力。将mcf-7细胞以1×105个/孔接种，每孔加入2ml10％的dmem培养液，放入37℃的co2培养箱中培养24h后，弃去培养基，加入pbs洗涤2-3次，分别按比例加入含有以上各载体的培养液(均包载dox)，同时以dox溶液作空白对照，继续培养12h后染色。弃去培养基，pbs冲洗后加入核染色剂(hoechst33342)，胰酶消化收集细胞，继续培养30min。取出后离心、洗涤并以pbs悬浮，使用流式细胞仪(fcm)测定细胞荧光阳性率及平均荧光强度，同时使用荧光显微镜进行观察。图5是不同载体在显微镜下的荧光成像结果与转运dox进入mcf-7细胞内的荧光强度对比，其中红色荧光表示dox，即dox与各载体在细胞内的摄取情况，蓝色荧光表示细胞核定位情况。结果表明各载体均能有效转运进入细胞，lmsns与clmsns的细胞传递效能相对更高，荧光强度从高到低依次为clmsns、lmsns、sirna-clmsns、msns。此结果与mtt测定结果基本一致，证实阳离子脂质体包载msns的clmsns因静电吸附作用而与肿瘤细胞有很强的亲和力及杀伤作用，负载sirna的sirna-clmsns仍保留了较强的细胞摄取能力，同时在高dox浓度下，sirna的抑制mdr作用有利于dox分子滞留于细胞内，使其抑瘤活性强于普通脂质体包载msns的lmsns。综上，本发明制备方法简单，制得的阳离子脂质-介孔硅复合纳米载体能够同时包载化疗药物dox并负载sirna，其载药量、包封率较高，体外释药行为良好，能被摄取进入细胞，相比于普通脂质体包载msns的lmsns，其具有更强的细胞转运能力与肿瘤抑制作用，对于恶性肿瘤尤其是带有mdr特征的肿瘤治疗有极大的潜在应用价值。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。当前第1页12