本发明属于药物化学领域，涉及二苯并[b,d]噻吩类stat3抑制剂的酒石酸盐及其制备方法与用途，具体地，本发明涉及4-(二苯并[b,d]噻吩-4-基)-6-(4-烯丙酰氨基苯基)-n-(2-甲基-4h-色烯-4-酮基)-1,3,5-三嗪-2-胺的酒石酸盐及其制备方法与用途。
背景技术：
：癌症是一大类恶性肿瘤的统称，其特点是无限制、无止境地增生。癌细胞使患者体内的营养物质被大量消耗，同时释放出多种毒素，使人体产生一系列症状，导致人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热以及严重的脏器功能受损，引起坏死出血合并感染，患者最终由于器官功能衰竭而死亡。信号传导与转录激活因子-3(signaltransducerandactivatoroftranscription-3，stat3)是一种可以被不同的细胞因子受体激活的相关蛋白，在细胞因子-受体相互作用的过程中充当载体，保持信号在细胞内传递的内在特异性，并通过诱导靶基因转录来表达生物刺激的效应作用，除了参与血管生成和免疫应答之外，还与细胞的增殖、生存、分化、抗凋亡等密切关联。stat3在多种肿瘤细胞(包括白血病、多发性骨髓瘤等血液肿瘤以及肺癌、乳腺癌、前列腺癌等多种实体肿瘤)中表达异常升高，与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。通过抑制stat3活性有望使癌细胞出现凋亡从而达到治疗癌症的目的，最近研究发现，抑制stat3信号可以克服包括视网膜母细胞瘤、肺癌、白血病等多种肿瘤的化学耐药性，stat3已经成功研发为一个新的抗肿瘤靶标。因此，积极寻找新的stat3抑制剂对于癌症的治疗有着极为重要的意义。化合物(i)的化学名称为4-(二苯并[b,d]噻吩-4-基)-6-(4-烯丙酰氨基苯基)-n-(2-甲基-4h-色烯-4-酮基)-1,3,5-三嗪-2-胺，体外细胞活性检测发现其对前列腺癌细胞du-145和人乳腺癌细胞mda-mb-468具有优异的抑制活性，对前列腺癌细胞du-145的ic50值为10.2nm，对人乳腺癌细胞mda-mb-468的ic50值为4.8nm，具有良好的应用前景。但在化合物(i)的成药性研究过程中，本发明的发明人发现不同化合物(i)药用盐在水溶性、生物利用度等方面有较大的差异。因此，深入研究找到适合药用的4-(二苯并[b,d]噻吩-4-基)-6-(4-烯丙酰氨基苯基)-n-(2-甲基-4h-色烯-4-酮基)-1,3,5-三嗪-2-胺盐型，十分必要。技术实现要素：一方面，本发明提供了一种紫杉醇和二苯并[b,d]噻吩类stat抑制剂酒石酸盐联合用药物组合物，包含活性成分和药学上可接受的辅料，所述的活性成分由紫杉醇和式(i)所示的二苯并[b,d]噻吩类stat抑制剂酒石酸盐组成，所述活性成分中紫杉醇和式(i)所示的二苯并[b,d]噻吩类stat抑制剂酒石酸盐的质量比为(0.08-0.14)：1；其中，式(i)所示的二苯并[b,d]噻吩类stat抑制剂酒石酸盐，化学式为：优选地，本发明提供4-(二苯并[b,d]噻吩-4-基)-6-(4-烯丙酰氨基苯基)-n-(2-甲基-4h-色烯-4-酮基)-1,3,5-三嗪-2-胺酒石酸盐的制备方法，包括以下步骤：步骤a:2-羟基苯乙酮乙酰化制得式(1)的化合物；步骤b：式(1)的化合物环合制得式(2)的化合物；步骤c：式(2)的化合物溴代制得式(3)的化合物；步骤d：式(3)的化合物氨基取代制得式(4)的化合物；步骤e：4-硝基苯甲酸甲酯与缩二脲环合制得式(5)的化合物；步骤f：式(5)的化合物氯代制得式(6)的化合物；步骤g：式(6)的化合物与式(4)的化合物反应制得式(7)的化合物；步骤h：式(7)的化合物与4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂戊环硼烷)-9-氧代-9h-硫杂蒽反应制得式(8)的化合物；步骤i：式(8)的化合物还原氢化制得式(9)的化合物；步骤j：式(9)的化合物与烯丙酰氯反应制得式(i)的化合物；步骤k：式(i)的化合物与酒石酸反应制得式(i)化合物酒石酸盐，反应路线如下：在一些优选的实施方案中，式(i)化合物与酒石酸反应的溶剂选自醇、酮或它们的混合物；在进一步优选的实施方案中，式(i)化合物与酒石酸反应的溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮或它们的混合物；在更进一步优选的实施方案中，式(i)化合物与酒石酸反应的溶剂为甲醇或乙醇。在一些优选的实施方案中，式(i)化合物与酒石酸反应的摩尔比为约1:0.5-0.55；在进一步优选的实施方案中，式(i)化合物与酒石酸反应的摩尔比为约1:0.5。在一些具体的实施方案中，式(i)化合物与酒石酸在溶剂乙醇中，按照式(i)化合物与酒石酸的摩尔比为1:0.5，回流反应0.5-1h即得。本发明的4-(二苯并[b,d]噻吩-4-基)-6-(4-烯丙酰氨基苯基)-n-(2-甲基-4h-色烯-4-酮基)-1,3,5-三嗪-2-胺酒石酸盐、紫杉醇与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合制备成药物制剂，以适合于经口或胃肠外给药。给药方法包括，但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内和经口途径。所述制剂可以通过任何途径施用，例如通过输注或推注，通过经上皮或皮肤粘膜(例如口腔粘膜或直肠等)吸收的途径施用。给药可以是全身的或局部的。经口施用制剂的实例包括固体或液体剂型，具体而言，包括片剂、丸剂、粒剂、粉剂、胶囊剂、糖浆、乳剂、混悬剂等。所述制剂可通过本领域已知的方法制备，且包含药物制剂领域常规使用的载体、稀释剂或赋形剂。本发明还提供了一种二苯并[b,d]噻吩类stat抑制剂酒石酸盐联合用药物组合物，包含活性成分和药学上可接受的辅料，所述的活性成分由紫杉醇、来那度胺、式(i)所示的二苯并[b,d]噻吩类stat抑制剂酒石酸盐组成，所述活性成分中紫杉醇和式(i)所示的二苯并[b,d]噻吩类stat抑制剂酒石酸盐的质量比为(0.08-0.14)：(0.08-0.12)：1。具体实施方式以下结合实施例更详细的解释本发明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的范围。实施例12-氨甲基-4h-色烯-4-酮盐酸盐的制备步骤12-乙酰氧基苯乙酮的制备将2-羟基苯乙酮(100mmol)、乙酰氯(250mmol)和碳酸钾(500mmol)加入反应瓶中，加入300ml丙酮，回流反应12h，反应结束后，减压蒸除溶剂，加入水，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩得油状物，直接投下一步。步骤22-甲基-4h-色烯-4-酮的制备称取2-乙酰氧基苯乙酮(50mmol)于反应瓶中，加入100mldmso溶解，0-5℃下分批加入钠氢(150mmol)，加毕，升至室温搅拌3h，反应结束后，向反应液中加入水，稀盐酸调ph值到弱酸性，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩得油状物，向所得油状物中加入100ml乙酸和5滴浓盐酸，回流反应约3h，反应结束，将反应液旋干，加入水，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析纯化得标题化合物。es：m/z161[m+h]+。步骤32-溴甲基-4h-色烯-4-酮的制备将步骤2所得2-甲基-4h-色烯-4-酮(10mmol)、n-溴代琥珀酰亚胺(nbs，10mmol)和过氧化苯甲酰(bpo，0.95mmol)加入反应瓶中，加20ml四氯化碳溶解，回流反应12h，反应结束后，反应液加水，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析纯化，得标题化合物。es：m/z239[m+h]+。步骤42-氨甲基-4h-色烯-4-酮盐酸盐的制备将步骤3所得2-溴甲基-4h-色烯-4-酮(0.5mmol)加入反应瓶中，加入5mldmf溶解，加入2ml氨水，室温搅拌12h，反应结束后，反应液加入水，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，加入乙酸乙酯5ml，搅拌溶解后加入饱和的乙酸乙酯氯化氢溶液至上清层无沉淀生成，过滤，干燥，得标题化合物。es：m/z239[m+h]+。实施例22,4-二氯-6-(4-硝基苯基)-1,3,5-三嗪的制备步骤14-硝基苯甲酸甲酯的制备称取4-硝基苯甲酸(250mmol)于反应瓶中，加入300ml甲醇溶解，滴加氯化亚砜(375mmol)，滴毕回流反应12h，反应结束后，减压旋干，加入饱和碳酸氢钠溶液调节ph至7-8，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩得标题化合物，直接投下一步。步骤26-(4-硝基苯基)-1,3,5-三嗪-2,4-(1h,3h)-二酮的制备称取缩二脲(100mmol)于反应瓶中，加入150ml乙二醇二甲醚溶解，0-5℃下分批加入氢化钠(83.4mmol)，加毕，50℃下搅拌反应1h，再加入4-硝基苯甲酸甲酯(83.4mmol)，加毕，升温至85℃反应20h，反应结束后，将反应液倒入水中，用浓盐酸调节ph至酸性，过滤，滤饼烘干，得标题化合物。es：m/z235[m+h]+。步骤32,4-二氯-6-(4-硝基苯基)-1,3,5-三嗪的制备将6-(4-硝基苯基)-1,3,5-三嗪-2,4-(1h,3h)-二酮(200mmol)加入反应瓶中，加入200ml三氯氧磷，五氯化磷(800mmol)，105℃反应12h，反应结束后，将反应液倒入水中，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩得标题化合物。es：m/z275[m+h]+。实施例34-氯-6-(4-硝基苯基)-n-(2-甲基-4h-色烯-4-酮基)-1,3,5-三嗪-2-胺的制备称取实施例2所得物2,4-二氯-6-(4-硝基苯基)-1,3,5-三嗪(50mmol)于反应瓶中，加入100ml四氢呋喃溶解，加入实施例1所得物2-氨甲基-4h-色烯-4-酮盐酸盐2-(三氟甲基)-吡啶-4-胺(55mmol)，碳酸钠(100mmol)，回流反应72h，过滤，柱层析纯化得标题化合物。es：m/z416[m+h]+。实施例44-(二苯并[b,d]噻吩-4-基)-6-(4-烯丙酰氨基苯基)-n-(2-甲基-4h-色烯-4-酮基)-1,3,5-三嗪-2-胺的制备步骤14-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂戊环硼烷)-9-氧代-9h-硫杂蒽的制备称取2-溴-二苯并[b,d]噻吩(1mmol)、联硼酸频哪醇酯(1.1mmol)、醋酸钾(2mmol)和1,1'-二(二苯膦基)二茂铁二氯化钯(pd(dppf)cl2，2mmol)于反应瓶中，加入5ml1,4-二氧六环，氮气保护条件下100℃反应24h，反应结束后，加入水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤，合并有机相，干燥，过滤，浓缩，柱层析纯化得到标题化合物。es：m/z311[m+h]+。步骤24-(二苯并[b,d]噻吩-4-基)-6-(4-硝基苯基)-n-(2-甲基-4h-色烯-4-酮基)-1,3,5-三嗪-2-胺的制备在30ml微波反应瓶中，依次加入实施例3所得混合物4-氯-6-(4-硝基苯基)-n-(2-甲基-4h-色烯-4-酮基)-1,3,5-三嗪-2-胺(10mmol)、步骤1所得物4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂戊环硼烷)-9-氧代-9h-硫杂蒽(10mmol)、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物(0.1mmol)、x-phos(0.4mmol)、碳酸铯(100mmol)和1,4-二氧六环/h2o(60ml/10ml)，溶解，氩气置换，105℃微波反应90min，浓缩，柱层析纯化得标题化合物。es：m/z564[m+h]+。步骤34-(二苯并[b,d]噻吩-4-基)-6-(4-氨基苯基)-n-(2-甲基-4h-色烯-4-酮基)-1,3,5-三嗪-2-胺的制备称取步骤2所得物4-(二苯并[b,d]噻吩-4-基)-6-(4-硝基苯基)-n-(2-甲基-4h-色烯-4-酮基)-1,3,5-三嗪-2-胺(1mmol)、10％pd-c(10mg)于反应瓶中，加入15ml甲醇，在1个标准大气压下，h2还原1h，停止反应，过滤，浓缩标题化合物，直接用于下一步。es：m/z534[m+h]+。步骤44-(二苯并[b,d]噻吩-4-基)-6-(4-烯丙酰氨基苯基)-n-(2-甲基-4h-色烯-4-酮基)-1,3,5-三嗪-2-胺的制备称取步骤3所得物4-(二苯并[b,d]噻吩-4-基)-6-(4-氨基苯基)-n-(2-甲基-4h-色烯-4-酮基)-1,3,5-三嗪-2-胺(0.1mmol)、二异丙基乙胺(0.3mmol)于反应瓶中，加入15ml无水二氯甲烷溶解，缓慢滴入溶解有烯丙基酰氯(0.12mmol)的二氯甲烷(1ml)溶液，10min反应完全，浓缩，柱层析纯化得标题化合物。1hnmr(600mhz,cdcl3)(δ,ppm):10.12(s,1h),8.47～8.48(m,1h),7.97～7.98(m,1h),7.79～7.81(m,3h),7.67～7.69(m,2h),7.50～7.52(m,3h),7.38～7.40(m,2h),7.28～7.30(m,1h),7.07～7.09(m,2h),6.48～6.50(m,1h),6.01～6.03(m,1h),5.55(s,1h),5.50～5.52(m,1h),4.89(s,1h),4.47～4.50(m,1h),3.06～3.08(m,2h),2.81～2.83(m,2h),2.01～2.03(brs,2h),1.91～1.93(brs,1h).es：m/z588[m+h]+。实施例54-(二苯并[b,d]噻吩-4-基)-6-(4-烯丙酰氨基苯基)-n-(2-甲基-4h-色烯-4-酮基)-1,3,5-三嗪-2-胺酒石酸盐的制备称取实施例4化合物(1.0mmol)于反应瓶中，加乙醇10ml，室温下搅拌溶解后，加入酒石酸0.5mmol，加毕，回流0.5h，冷却至室温，减压蒸除溶剂，室温下真空干燥获得标题化合物。实施例6：4-(二苯并[b,d]噻吩-4-基)-6-(4-烯丙酰氨基苯基)-n-(2-甲基-4h-色烯-4-酮基)-1,3,5-三嗪-2-胺酒石酸盐的制备称取实施例4化合物(1.0mmol)于反应瓶中，加甲醇10ml，室温下搅拌溶解后，加入酒石酸0.55mmol，加毕，回流0.5h，冷却至室温，减压蒸除溶剂，室温下真空干燥获得标题化合物。实验例1：生物活性测定化合物准备：将pod810全自动微孔板预处理系统将本发明实施例4和实施例5制备的化合物加入孔板中，化合物起始浓度为100um，每个化合物做双复孔，2倍稀释10个点。细胞的培养：分别将前列腺癌细胞du-145、人乳腺癌细胞mda-mb-468用含15％胎牛血清(fbs)的rpmi-1640培养基，在37度培养箱内培养，取对数生长期细胞用于实验。mtt细胞存活性实验：分别将前列腺癌细胞du-145、人乳腺癌细胞mda-mb-468接种于96孔板中(5-10×104cells/well)，分别用实施例5和6的化合物处理48h，每孔中加入20μl3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(mtt)孵化4h，然后加入每孔中100μldmso，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪od490nm处测量各孔的吸光值，使用graphpadprism处理得到对应曲线和ic50值，结果见表1。表1实验结果表明，本发明对具有持续激活的stat3活性的mda-mb-468细胞、du-145细胞具有优异的抑制作用。实验例2水溶性评价按2015年药典四部水溶性实验，实验结果见表2.表2化合物水溶性实施例5化合物38.29mg/ml实验例3稳定性研究称取3份4-(二苯并[b,d]噻吩-4-基)-6-(4-烯丙酰氨基苯基)-n-(2-甲基-4h-色烯-4-酮基)-1,3,5-三嗪-2-胺酒石酸盐1.0g，分别平铺于培养皿中，1份开口置于光照照度为4500lx±500lx条件下放置3个月，1份开口置于室温75％相对湿度(rh)条件下放置3个月，1份开口置于室温92.5％相对湿度(rh)条件下放置3个月，于第0、1、2、3个月取样，考查最大单杂、总杂质的变化，实验结果见表3。表3上述实验结果均表明，本发明的4-(二苯并[b,d]噻吩-4-基)-6-(4-烯丙酰氨基苯基)-n-(2-甲基-4h-色烯-4-酮基)-1,3,5-三嗪-2-胺酒石酸盐具有良好的化学稳定性。当前第1页12