本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抑制乙酰胆碱酯酶活性的方法。
背景技术：
根据《2016年世界老年痴呆症报告》，目前全世界有4680万人在遭受ad（阿兹海默症）的折磨。世界人口老龄化将进一步加剧这一问题，并导致ad患者数量急剧增加，预计ad患者的数量将近乎每20年翻一番。因此，到2030年，患ad的人数将达到7470万，2050年将达到1.315亿。ad已经成为老年人残疾和死亡的第三大原因，仅次于心脑血管疾病和恶性肿瘤。自从第一个ad病人被确诊，fda在过去100年的时间里批准的用于治疗ad的药物只有五种。不仅如此，这些被批准的药物，包括胆碱酯酶抑制剂、n-甲基-d-天门冬氨酸（nmda）受体拮抗剂或它们的组合通常提供暂时的和不完整的症状缓解，并伴有严重的副作用。因此，迫切需要开发更有效的ad治疗药物。
在ad中，突触的参与是明确的，基于胆碱能假说的药物开发已经取得了成功。药效学研究表明，抑制乙酰胆碱酯酶(ache)的活性，来调节胆碱能系统，可以发挥促智作用，减轻ad症状。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种抑制乙酰胆碱酯酶活性的方法。
本发明的技术方案如下：
一种抑制乙酰胆碱酯酶活性的方法，包括使用黄皮叶、果皮、果核、果肉、枝条的提取物制剂对乙酰胆碱酯酶进行活性抑制。
进一步的，提取物制剂包括黄皮果皮水浸膏溶液，其有效成分浓度为8-12mg/ml，溶剂为乙醇水溶液，优选50%体积分数的乙醇溶液。
进一步的，提取物制剂包括黄皮枝乙酸乙酯浸膏溶液和水浸膏溶液、黄皮果肉的石油醚浸膏溶液、黄皮果核的水浸膏溶液，有效成分浓度均为0.5-1.5mg/ml，溶剂均为乙醇水溶液，优选50%体积分数的乙醇溶液。
一种提取物制剂的制备方法，包括如下步骤：
a.将原材料洗净，去皮除核，将分离到的黄皮枝、叶、果肉、果核、果皮分类并烘干；
b.将烘干后的物料粉碎后，加入乙醇溶解，溶解后超声，多次抽滤并合并得提取液；
c.对提取液进行减压蒸馏后得乙醇提取物浸膏，加入蒸馏水浸泡溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯分别萃取多次，合并提取液，保留水相，分离水相、石油醚相、乙酸乙酯相后进行减压蒸馏，分别获得相应的石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏和水浸膏；
d.取c步骤所得浸膏用乙醇水溶液配置成成品溶液。
进一步的，减压蒸馏的同时进行物料搅拌，搅拌转速为50-70rpm。
进一步的，减压蒸馏的温度为48-50摄氏度。
一种测试提取物制剂对乙酰胆碱酯酶活性抑制率的方法，包括如下步骤：
配制测试管：取pbs于容器中，置于35-40℃水浴中预热，然后依次加入提取物制剂样品溶液、乙酰胆碱酯酶溶液、dtnb溶液、atci溶液，35-40℃水浴反应15min以上，加入sds溶液终止反应，测其在412nm时的od值；sds溶液为十二烷基硫酸钠高浓度水溶液。od值为od是opticaldensity（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度。
配制标准管：取pbs于容器中，置于35-40℃水浴中预热，然后依次加入提取物制剂样品溶液所用的溶剂、乙酰胆碱酯酶溶液、dtnb溶液、atci溶液，35-40℃水浴反应15min以上，加入sds溶液终止反应，测其在412nm时的od值；
配制测试调零管：取pbs于容器中，置于35-40℃水浴中预热，然后依次加入提取物制剂样品溶液、dtnb溶液、atci溶液，37℃水浴反应15min以上，加入sds溶液终止反应，测其在412nm时的od值；
配制标准调零管：取pbs于容器中，置于35-40℃水浴中预热，然后依次加入提取物制剂样品溶液所用的溶剂、dtnb溶液、atci溶液，35-40℃水浴反应15min以上，加入sds溶液终止反应，测其在412nm时的od值；
计算抑制率：扣除调零值后，计算抑制率，样品的抑制率=(a标准-a测试)/a标准×100%，不同组分、浓度的样品同时做3个平行试验，求其od值的平均值a，作为各样品的平均抑制率。
其原理为：在乙酰胆碱酯酶（ache）的催化下，底物碘化硫代乙酸胆碱（atch）分解，生成硫代胆碱（thiocholine）和乙酸，硫代胆碱与显色剂dtnb迅速反应生成412nm波长下有最大光吸收的黄色物质5一疏基一2一硝基苯甲酸盐。当酶促反应处于稳态阶段，酶促反应下生成的5一疏基一2一硝基苯甲酸盐的od值可代表起始反应速率（即酶活）。若待测样品对酶有抑制作用，则酶水解能力下降，产物硫代胆碱量减少，从而与显色剂反应生成的黄色物质减少,即其在412nm波长下的吸光值变小，便可利用吸光值的差异来计算抑制率的大小。
进一步的，不同组分、浓度的样品同时做3个平行试验。
进一步的，pbs为ph8.0的磷酸盐缓冲液。
进一步的，dtnb为二硫代二硝基苯甲酸与pbs的混合液，二硫代二硝基苯甲酸与pbs的混合液的质量体积比为6g：1l，atci为碘化硫代乙酰胆碱与pbs的混合液，碘化硫代乙酰胆碱与pbs的混合液的质量体积比为4.4g：1l。
本发明采用黄皮各器官的提取液制剂来抑制乙酰胆碱酯酶活性，具有较好的效果。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明作进一步详细描述。
提取物制剂的制备方法如下：
黄皮鲜品洗净，去皮除核；将分离到的黄皮枝、叶、果肉、果核、果皮于45℃电热鼓风干燥箱中烘干。
用中药粉碎机粉碎，过筛，取10g粉末，用100ml95%乙醇溶解，300w超声波提取30min，抽滤，连续提取3次，合并提取液。
将提取液进行减压蒸馏（温度不高于50℃；转速：60rpm）后得乙醇提取物浸膏，加入100ml蒸馏水浸泡溶解，依次用石油醚（100mlx3）、乙酸乙酯（100mlx3）分别萃取3次，合并提取液，保留水相，减压蒸馏，分别获得相应的石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏、和水浸膏3个组份。
分别称取0.01g石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏、和水浸膏，用50%乙醇分别配成10mg/ml、1mg/ml浓度的石油醚样品溶液、乙酸乙酯样品溶液及样品水溶液备用。
主要测试仪器为：紫外可见光分光光度计，测试样品对乙酰胆碱酯酶活性抑制率的方法如下：
一、配制试剂：
1.50mm（毫摩尔每升，下同）ph8.0的pbs溶液：将94.7ml0.2mol/lna2hpo4和5.3ml0.2mol/lna2hpo4混合均匀，得到100ml0.2mol/l的磷酸盐缓冲液，稀释4倍得到400ml50mmol/lph8.0的pbs溶液。
0.2mol/lna2hpo4:100ml*0.2mol/l*358.14=7.1628g；称取7.163gna2hpo4・12h2o定容至100ml。
0.2mol/lna2hpo4:100ml*0.2mol/l*156.01=0.31202g；称取0.312gna2hpo4·2h2o，用10ml蒸馏水溶解。
2.15mmatci溶液：取0.022g碘化硫代乙酰胆碱（atci）溶于5mlpbs中，摇匀避光处理后，置于4℃冰箱中保存，仅供当天使用。
3.15mmdtnb溶液：取0.030g二硫代二硝基苯甲酸(dtnb)溶于5mlpbs中，摇匀避光处理后，置于4℃冰箱中保存，仅供当天使用。
4.2u/ml乙酰胆碱酯酶（标准液）：先加入1mg（0.001g）bsa作为稳定剂，再加入10mg（0.01g）的乙酰胆碱酯酶粉，然后用1mlpbs溶解，制成2u/ml的工作液，最后分装到10支1.5ml的微型离心管中，每管100ul，避光保存于4℃冰箱备用，仅供当天使用。
5.4%的sds溶液：称取2gsds，用蒸馏水定容到50ml容量瓶。.
二、配制测试管：
取50mm的pbs2630µl于试管中，置于37℃水浴锅中预热2min，然后依次加入溶于50％乙醇溶液不同浓度（10mg/ml、1mg/ml）的样品100µl、乙酰胆碱酯酶13µl、15mm的dtnb100µl、15mm的atci100µl，37℃水浴反应15min，加入1ml4%的sds终止反应，用测其在412nm时的od值。
三、配制标准管
取50mm的pbs2630µl于试管中，置于37℃水浴锅中预热2min，然后依次加入50％乙醇溶液100µl、乙酰胆碱酯酶13µl、15mm的dtnb100µl、15mm的atci100µl，37℃水浴反应15min，加入1ml4%的sds终止反应，测其在412nm时的od值。
四、配制调零测试管
取50mm的pbs2643µl于试管中，置于37℃水浴锅中预热2min，然后依次加入溶于50％乙醇溶液不同浓度（10mg/ml、1mg/ml）的样品溶液100µl、15mm的dtnb100µl、15mm的atci100µl，37℃水浴反应15min，加入1ml4%的sds终止反应，测其在412nm时的od值。
五、配制调零标准管
取50mm的pbs2643µl于试管中，置于37℃水浴锅中预热2min，然后依次加入50％乙醇溶液100µl、15mm的dtnb100µl、15mm的atci100µl，37℃水浴反应15min，加入1ml4%的sds终止反应，测其在412nm时的od值。
六、抑制率计算：
扣除调零值后，样品的抑制率=(a标准-a测试)/a标准×100%，不同组分、浓度的样品同时做3个平行试验，求其od值的平均值a，作为各样品的平均抑制率。
如表1所示：
测试结果如下：
表2：
表3：
表4：
表5：
根据表2-5的结果可知，在实验制备的黄皮叶三种测试组分中，乙酸乙酯组分和水溶性组分对乙酰胆碱酯酶活性的抑制效果较好，其10mg/ml浓度下的平均抑制率十分接近，分别为48.09±1.06%和48.94±0.34%。三种组分的乙酰胆碱酯酶抑制性都随浓度的增加而增强。
黄皮果皮三种测试组分对乙酰胆碱酯酶的抑制性都较强，其中水溶性组分的抑制效果最好。组分浓度为10mg/ml时，石油醚组分、乙酸乙酯组分及水溶性组分的平均抑制率分别达到79.57±1.57%、62.13±1.32%和92.77±1.57%。同时，随着组分浓度的增大，黄皮果皮三种测试组分对乙酰胆碱酯酶抑制能力显著增强。
黄皮果肉三种测试组分中，除10mg/ml的乙酸乙酯组分的平均抑制率为45.74±1.49%以外，其他浓度组分对乙酰胆碱酯酶活性的抑制效果均不佳，平均抑制率皆低于15%。同时，低浓度（1mg/ml）的石油醚组分的乙酰胆碱酯酶平均抑制率反而高于10mg/ml的石油醚组分；低浓度（1mg/ml）的乙酸乙酯组分对乙酰胆碱酯酶活性可能存在轻微的促进作用。
黄皮果核三种组分对乙酰胆碱酯酶的抑制性均较低，平均抑制率都小于40%，其中10mg/ml的石油醚组分和乙酸乙酯组分的平均抑制率相对较高，分别为36.17±0.68%和33.40±0.21%，同时该两种组分的平均抑制率都呈现出了：浓度增加，抑制效果增强的趋势。然而，黄皮果核水溶性组分却有低浓度（1mg/ml）抑制效果更好的特点。
黄皮枝三种组分对乙酰胆碱酯酶活性的抑制性大小不存在显著差异：10mg/ml的石油醚组分的平均抑制率为44.68±2.47%，在三种组分中抑制效果最好；但随浓度增加，三种组分对乙酰胆碱酯酶的抑制性并没有明显的提高，并且，低浓度（1mg/ml）的乙酸乙酯组分和水溶性组分的平均抑制率略高于同种高浓度（10mg/ml）溶剂组分，分别为37.02±1.74%、31.91±0.72%。
通过对比，高浓度的水溶性的黄皮果皮提取物对乙酰胆碱酯酶活性的抑制效果显著。
虽然对本发明的描述是结合以上具体实施例进行的，但是，熟悉本技术领域的人员能够根据上述的内容进行许多替换、修改和变化、是显而易见的。因此，所有这样的替代、改进和变化都包括在附后的权利要求的精神和范围内。