专利名称：N－吡唑a的制作方法
技术领域：
本发明背景发明领域本发明包括可用作A2A受体激动剂的N-吡唑取代的2-腺苷化合物。本发明化合物是可用作辅助心脏显像的血管扩张剂，有助于识别患有提示冠状动脉疾病(CAD)紊乱例如冠脉灌注不良的哺乳动物，特别是人。本发明化合物可用作冠状动脉疾病以及由其他A2A受体介导的疾病的治疗剂。
技术描述在用T1闪烁法或超声波心动描记术显像之前，在用腺苷或二双嘧达莫怀疑患有CAD的病人中常常诱导药理性应激反应。两种药物都通过激活细胞表面A2受体而影响冠状阻力血管的扩张。尽管最初诱导药理性应激反应是作为一种刺激不能运动的病人冠脉血管扩张的方法，但某些研究显示，对于由腺苷或二双嘧达莫诱导产生药理性应激反应的病人和进行传统的运动应激反应试验的病人来说，201T1或超声波心动描记术显像的诊断价值是相等的。然而，在用这些药物诱导的药理性应激反应显像时，与药物相关的副作用如头痛和恶心的发生率高，这可用新的治疗剂来改善。
肥大细胞在脱颗粒过程中涉及腺苷A2B和A3受体，因此哮喘者不适宜用非特异性腺苷激动剂诱导药理性应激反应试验。另外，在心房和A-V结中，用腺苷刺激A1受体将使可诱导AV阻滞的S-H间隙减少，(N.C.Gupto等人；J.Am.Coll.Cardiol；(1992)19248-257)。用腺苷刺激腺苷A1受体也可能引起恶心，因为在肠道中发现有A1受体(J.Nicholls等人；Eur.J.Pham.(1997)338(2)143-150)。
动物数据提示，在冠状阻力血管上的特异性腺苷A2A亚型受体介导腺苷引起的冠脉血管扩张反应，而刺激A2B亚型受体使外周血管舒张(注意后者降低全身的血压)。因此，需要寻求作为A2A受体激动剂的药物组合物，它们不具有在体内刺激A1受体时所引起的药理作用。此外需要寻求半衰期短并且可被进行药理性冠脉应激反应评估病人很好地耐受的A2A受体激动剂。
本发明概述一方面，本发明包括可用作A2A受体激动剂的2-腺苷N-吡唑化合物。
另一方面，本发明包括包含耐受性好、副作用少的2-腺苷N-吡唑化合物的药物组合物。
另一方面，本发明包括可以很容易地与放射性显像剂联合使用以便促进冠脉显像的N-吡唑化合物。
在一个具体实施方案中，本发明包括下列通式2-腺苷N-吡唑化合物 在另一具体实施方案中，本发明包括利用本发明化合物刺激哺乳动物特别是人冠脉血管扩张，使心脏应激反应引起“窃血”现象以便于心脏显像的方法。
在另一具体实施方案中，本发明包括包含一种或多种本发明化合物和一种或多种药物赋形剂的药物组合物。
附图描述
图1A为CPX和ZM241385灌注前和灌注后，由本发明化合物16引起的冠脉传导增加的模拟记录；
图1B为图1A所显示数据的概述，它表明CPX不减弱而ZM241385减弱由本发明化合物16引起的冠脉传导增加。在图1B中，条形线代表由6只大鼠离体灌注心脏单独测定的平均值±SEM；图2为本发明化合物16在离体的大鼠灌注心脏中产生的A1腺苷受体(AdoR)-介导的负性变传导(AV传导时间)作用和A2AAdoR-介导的血管扩张(增加冠脉传导)作用的浓度反应曲线。符号和误差线代表分别由四个心脏测定结果的平均值±SEM。EC50(效力)为化合物16引起50％最大反应的浓度；图3为本发明化合物16在离体的猪灌注心脏中产生的A1腺苷受体(AdoR)-介导的负性变传导(AV传导时间)作用和A2AAdoR-介导的血管扩张(增加冠脉传导)作用的浓度反应曲线。符号和误差线代表分别由四个心脏测定结果的平均值±SEM。EC50(效力)为化合物16引起50％最大反应的浓度；并且图4为CVT510(A1腺苷受体激动剂)和本发明化合物16(A2A腺苷受体激动剂)在离体的鼠灌注心脏中产生的对房室(AV)传导时间的效应图。
现有实施方案的描述本发明化合物包括具有如下通式的一类2-腺苷N-吡唑类化合物 其中R1为-CH2OH，和-C(＝O)NR5R6；R3独自地选自下列组C1-15烷基、卤、NO2、CF3、CN、OR20、SR20、N(R20)2、S(O)R22、SO2R22、SO2N(R20)2、SO2NR20COR22、SO2NR20CO2R22、SO2NR20CON(R20)2、N(R20)2NR20COR22、NR20CO2R22、NR20CON(R20)2、NR20C(NR20)NHR23、COR20、CO2R20、CON(R20)2、CONR20SO2R22、NR20SO2R22、SO2NR20CO2R22、OCONR20SO2R22、OC(O)R20、C(O)OCH2OC(O)NR20和OCON(R20)2、-CONR7R8、C2-15烯基、C2-15炔基、杂环基、芳基和杂芳基，其中烷基、烯基、炔基、芳基、杂环基和杂芳基是可任选地由1-3取代基取代，所述取代基独立地选自于下列组卤、烷基、NO2、杂环基、芳基、杂芳基、CF3、CN、OR20、SR20、N(R20)2、S(O)R22、SO2R22、SO2N(R20)2、SO2NR20COR22、SO2NR20CO2R22、SO2NR20CON(R20)2、N(R20)2NR20COR22、NR20CO2R22、NR20CON(R20)2、NR20C(NR20)NHR23、COR20、CO2R20、CON(R20)2、CONR20SO2R22、NR20SO2R22、SO2NR20CO2R22、OCONR20SO2R22、OC(O)R20、C(O)OCH2OC(O)R20和OCON(R20)2，并且其中各杂芳基、芳基和杂环基取代基可任选地被卤素、NO2、烷基、CF3、氨基、一或二烷基氨基、烷基或芳基或杂芳基酰胺、NCOR22、NR20SO2R22、COR20、CO2R20、CON(R20)2、NR20CON(R20)2、OC(O)R20、OC(O)N(R20)2、SR20、S(O)R22、SO2R22、SO2N(R20)2、CN或OR20取代；R5和R6各自独立地选自于下列组氢，和可任选地由1-2个取代基取代的C1-15烷基，所述取代基独立地选自下列组卤素、NO2、杂环基、芳基、杂芳基、CF3、CN、OR20、SR20、N(R20)2、S(O)R22、SO2R22、SO2N(R20)2、SO2NR20COR22、SO2NR20CO2R22、SO2NR20CON(R20)2、N(R20)2NR20COR22、NR20CO2R22、NR20CON(R20)2、NR20C(NR20)NHR23、COR20、CO2R20、CON(R20)2、CONR20SO2R22、NR20SO2R22、SO2NR20CO2R22、OCONR20SO2R22、OC(O)R20、C(O)OCH2OC(O)R20和OCON(R20)2，并且其中各个任选的杂芳基、芳基和杂环基取代基可任选地被卤素、NO2、烷基、CF3、氨基、一或二烷基氨基、烷基酰胺，芳基酰胺，杂芳基酰胺、NCOR22、NR20SO2R22、COR20、CO2R20、CON(R20)2、NR20CON(R20)2、OC(O)R20、OC(O)N(R20)2、SR20、S(O)22、SO2R22、SO2N(R20)2、CN和OR20取代；R7选自下列组氢、C1-15烷基、C2-15烯基、C2-15炔基、杂环基、芳基和杂芳基，其中烷基、烯基、炔基、芳基、杂环基和杂芳基取代基可任选地被1-3个取代基取代，所述取代基独立地选自下列组卤素、NO2、杂环基、芳基、杂芳基、CF3、CN、OR20、SR20、N(R20)2、S(O)R22、SO2R22、SO2N(R20)2、SO2NR20COR22、SO2NR20CO2R22、SO2NR20CON(R20)2、N(R20)2NR20COR22、NR20CO2R22、NR20CON(R20)2、NR20C(NR20)NHR23、COR20、CO2R20、CON(R20)2、CONR20SO2R22、NR20SO2R22、SO2NR20CO2R22、OCONR20SO2R22、OC(O)R20、C(O)OCH2OC(O)NR20和OCON(R20)2并且其中各个任选的杂芳基、芳基和杂环基取代基可任选地被卤素、NO2、烷基、CF3、氨基、一或二烷基氨基、烷基或芳基或杂芳基酰胺、NCOR22、NR20SO2R22、COR20、CO2R20、CON(R20)2、NR20CON(R20)2、OC(O)R20、OC(O)N(R20)2、SR20、S(O)22、SO2R22、SO2N(R20)2、CN和OR20取代；R8选自下列组氢、C1-15烷基、C2-15烯基、C2-15炔基、杂环基、芳基和杂芳基，其中烷基、烯基、炔基、芳基、杂环基和杂芳基取代基可任选地被1-3个取代基取代，所述取代基独立地选自下列组卤素、NO2、杂环基、芳基、杂芳基、CF3、CN、OR20、SR20、N(R20)2、S(O)R22、SO2R22、SO2N(R20)2、SO2NR20COR22、SO2NR20CO2R22、SO2NR20CON(R20)2、N(R20)2NR20COR22、NR20CO2R22、NR20CON(R20)2、NR20C(NR20)NHR23、COR20、CO2R20、CON(R20)2、CONR20SO2R22、NR20SO2R22、SO2NR20CO2R22、OCONR20SO2R22、OC(O)R20、C(O)OCH2OC(O)NR20和OCON(R20)2并且其中各杂芳基、芳基和杂环基取代基是可任选地被卤素、NO2、烷基、CF3、氨基、一或二烷基氨基、烷基或芳基或杂芳基酰胺、NCOR22、NR20SO2R22、COR20、CO2R20、CON(R20)2、NR20CON(R20)2、OC(O)R20、OC(O)N(R20)2、SR20、S(O)22、SO2R22、SO2N(R20)2、CN和OR20取代；R20选自下列组LH、C1-15烷基、C2-15烯基、C2-15炔基、杂环基、芳基和杂芳基，其中烷基、烯基、炔基、杂环基、芳基和杂芳基取代基可任选地被可1-3个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、烷基、一或二烷基氨基、烷基或芳基或杂芳基酰胺、CN、O-C1-6烷基、CF3、芳基和杂芳基；R22选自下列组C1-15烷基、C2-15烯基、C2-15炔基、杂环基、芳基和杂芳基，其中烷基、烯基、炔基、杂环基、芳基和杂芳基取代基可任选地被1-3个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、烷基、一或二烷基氨基、烷基或芳基或杂芳基酰胺、CN、O-C1-6烷基、CF3，芳基和杂芳基；并且，其中R2和R4选自下列组H、C1-6烷基和芳基，其中烷基和芳基是可任选地被卤素、CN、CF3、OR20和N(R20)2取代，前提条件是当R2不为氢时，R4为氢，并且当R4不为氢时，R2为H。
在本发明优选的化合物中，R3选自下列组C1-15烷基、卤素、CF3、CN、OR20、SR20、S(O)R22、SO2R22、SO2N(R20)2、COR20、CO2R20、-CONR7R8、芳基和杂芳基，其中烷基、芳基和杂芳基取代基可任选地被1-3个取代基取代，所述取代基独立地选自下列组卤素、芳基、杂芳基、CF3、CN、OR20、SR20、S(O)R22、SO2R22、SO2N(R20)2、COR20、CO2R20或CON(R20)2，并且其中各个任选的杂芳基和芳基取代基可任选地由卤素、烷基、CF3、CN和OR20取代；R5和R6各自独立地选自下列组氢和包含一个可选的芳基取代基的C1-15烷基并且各个所述可选的芳基取代基可任选地由卤素或CF3取代；R7选自C1-15烷基、C2-15炔基、芳基和杂芳基，其中烷基、炔基、芳基和杂芳基取代基是可任选地由1-3个取代基取代，所述取代基独立地选自下列组卤素、芳基、杂芳基、CF3、CN、OR20，并且各个任选的杂芳基和芳基取代基可任选地由卤素、烷基、CF3、CN或OR20取代；R8选自氢和C1-15烷基；R20选自H、C1-4烷基和芳基，其中烷基和芳基取代基是可任选地由一个烷基取代基取代；并且R22选自C1-4烷基和芳基，其中烷基和芳基是可任选地由1-3个烷基取代。
在更优选的化合物中，R1为CH2OH；R3选自CO2R20、-CONR7R8和芳基，其中芳基取代基可任选地由1-2个独立地选自卤素、C1-6烷基、CF3和OR20的取代基取代的；R7选自氢、C1-8烷基和芳基，其中烷基和芳基取代基是可任选地由一个选自卤素、芳基、CF3、CN、OR20的取代基取代的并且其中各可有可无的芳基取代基是可任选地由卤素、烷基、CF3、CN或OR20取代的；R8选自氢和C1-8烷基；并且R20选自氢和C1-4烷基。
在进一步更优选的具体实施方案中，R1＝CH2OH；R3选自CO2R20、-CONR7R8和可任选地由一个选自卤素、C1-3烷基和OR20的取代基取代的芳基；R7选自氢和C1-3烷基；R8为氢；并且R20选自氢和C1-4烷基。在优选的该具体实施方案中，R3最优选地选自-CO2Et和-CONHEt。
在另一更优选的具体实施方案中，R1＝CONHEt，R3选自CO2R20、-CONR7R8和可任选地由1-2个独立地选自卤素、C1-3烷基、CF3或和OR20的取代基取代的芳基；R7选自氢和可任选地由一个选自卤素、CF3、CN或OR20的取代基取代的C1-8烷基；R8选自氢和C1-3烷基；并且R20选自氢和C1-4烷基。在更优选的该具体实施方案中，R8优选地为氢，R7优选地选自氢和C1-3，并且20优选地选自氢和C1-4烷基。
在最优选的具体实施方案中，本发明化合物选自1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)oxolan-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-羧酸乙酯，(4S，2R，3R，5R)-2-{6-氨基-2-[4-(4-氯苯基)吡唑基]嘌呤-9-基}-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇，(4S，2R，3R，5R)-2-{6-氨基-2-[4-(4-甲氧基苯基)吡唑基]嘌呤-9-基}-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇，(4S，2R，3R，5R)-2-{6-氨基-2-[4-(4-甲基苯基)吡唑基]嘌呤-9-基}-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇，(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)oxolan-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基甲酰胺，1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)oxolan-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N，N-二甲基甲酰胺，(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)oxolan-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-乙基甲酰胺，1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)oxolan-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基吡唑-4-甲酰胺，1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)oxolan-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基}-N-(环戊基甲基)甲酰胺，(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)oxolan-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-[(4-氯苯基)甲基]甲酰胺，2-[(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)oxolan-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)羰基氨基]乙酸乙酯及其混合物。
下列定义应用于本文所使用的术语。
“卤”或“卤素”独立地或组合地指所有的卤素，即氯(Cl)、氟(F)、溴(Br)、碘(I)。
“羟基”是指基团-OH。
“硫醇”或“巯基”是指基团-SH。
“烷基”独立地或组合地指链烷烃衍生的含1-20个，优选1-15个碳原子(除非特别限定)的基团。所述烷基是直链烷基、支链烷基或环烷基。优选包含1-15个，更优选1-8个，甚至更优选1-6个，还更优选1-4个并且最优选1-2个碳原子的直链或支链烷基基团，如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、t-丁基等。本文使用术语“低级烷基”来描述上述直链烷基基团。优选地，环烷基为每个环上含有3-8个，更优选3-6个环成员的单环、二环或三环系统，如环丙基、环戊基、环己基、金刚烷基等。烷基也包括含有环烷基或由环烷基部分间隔的直链或支链烷基。直链或支链烷基可在可利用的点连接以产生稳定的化合物。其实例包括但不限于4-(异丙基)-环己基乙基或2-甲基-环丙基戊基。取代烷基为前面定义的、各自地由1-3个基团或取代基取代的直链烷基、支链烷基或环烷基，其中所述基团或取代基选自卤素、羟基、烷氧基、烷硫基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、酰氧基、芳氧基、杂芳氧基、可任选地由一个或二个烷基、芳基或杂芳基取代可任选地氨基、脒基，可任选地由烷基、芳基、杂芳基或杂环基取代的脲，可任选地由烷基、芳基或杂芳基N-一取代或N，N-二取代的氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、杂芳基磺酰基氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基等。
“烯基”单独或组合地指含有2-20个，优选2-17个，更优选2-10个，甚至更优选2-8个，最优选2-4个碳原子并且至少含有一个，优选1-3个，更优选1-2个，最优选一个碳碳双键的直链、支链或环状烃。对于环烷基，一个以上碳碳双键共轭不能为该环提供芳香性。碳碳双键也可以包含在环烷基部分中，环丙基除外，或包含在直链或支链部分中。烯基的实例包括乙烯基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、环己烯基、环己烯基烷基等。取代的链烯基为先前定义的、独立地由1-3个基团或取代基取代的直链链烯基、支链链烯基或环烯基，其中所述基团或取代基选自卤素、羟基、烷氧基、烷硫基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、酰氧基、芳氧基、杂芳氧基、可任选地由烷基、芳基或杂芳基一取代或二取代的氨基、脒基、可任选地由烷基、芳基、杂芳基或杂环基取代的脲、可任选地烷基、芳基或杂芳基N-一取代或N，N-二取代的氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、杂芳基磺酰基氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基、羧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基等，这些取代基可在可利用的点连接以产生稳定的化合物。
“链炔基”单独或组合地指含有2-20个，优选2-17个，更优选2-10个，甚至更优选2-8个，最优选2-4个碳原子并且至少含有一个，优选一个碳碳三键的直链或支链烃。链炔基的实例包括乙炔基、丙炔基、丁炔基等。取代的链炔基是指先前定义的、独立地由1-3个基团或取代基取代的直链链炔基或支链链炔基，其中所述基团或取代基选自卤素、羟基、烷氧基、烷硫基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、酰氧基、芳氧基、杂芳氧基、可任选地由一个或二个烷基、芳基或杂芳基取代的氨基、脒基、可任选地或由烷基、芳基、杂芳基或杂环基取代的脲、可任选地由烷基、芳基或杂芳基N-一取代或N，N-二取代的氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、杂芳基磺酰基氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基等，这些取代基可在可利用的点连接以产生稳定的化合物。
“烷基链烯基”是指基团-R-CR’＝CR”’R””，其中R为低级烷基或取代的低级烷基，R’、R”’、R””可以独立地为氢、卤素、低级烷基、取代的低级烷基、酰基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基，其中的基团定义见下文。
“烷基链炔基”是指基团-RC≡CR’，其中R为低级烷基或取代的低级烷基，R’为氢、低级烷基、取代的低级烷基、酰基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基，其中的基团定义见下文。
“烷氧基”是指进基团OR，其中R为低级烷基、取代的低级烷基、酰基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、杂烷基、杂芳烷基、环烷基、取代的环烷基、环杂烷基或取代的环杂烷基，其中的基团定义见下文。
“烷硫基”是指基团-S(O)n＝1-2-R，其中R为低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、或取代的芳烷基，其中的基团定义见本文。
“酰基”是指基团-C(O)R，其中R为氢、低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基等，其中的基团定义见本文。
“芳氧基”是指基团-Oar，其中Ar为芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基，其中的基团定义见本文。
“氨基”是指基团NRR’，其中R和R’可以独立地为氢、低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基或酰基，其中的基团定义见本文。
“酰氨基”是指-C(O)NRR’，其中R和R’可以独立地为氢、低级烷基、取代的低级烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基，其中的基团定义见本文。
“羧基”是指基团-C(O)OR，其中R为氢、低级烷基、取代的低级烷基、芳基、杂芳基和取代的杂芳基，其中的基团定义见本文。
“芳基”单独地或组合地指未稠合的或由优选含有5-7个，更优选5-6个环成员的环烷基稠合的和/或可任选地由1-3个取代基取代的苯基或萘基，其中所述取代基选自卤素、羟基、烷氧基、烷硫基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、酰氧基、芳氧基、杂芳氧基、可任选地由一个或二个烷基、芳基或杂芳基取代的氨基、脒基、可任选地由烷基、芳基、杂芳基或杂环基取代的脲、可任选地由烷基、芳基或杂芳基N-一取代或N，N-二取代的氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、杂芳基磺酰基氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基等。
“取代的芳基”是指可任选地由一个或多个官能团取代的芳基，其中所述官能团选自卤素、低级烷基、低级烷氧基、烷硫基、双亚乙基、氨基、酰氨基、羧基、羟基、芳基、芳氧基、杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、硝基、氰基、巯基、磺酰胺基等取。
“杂环基”是指具有单环(例如吗啉基、吡啶基或呋喃基)或多个稠合环(例如萘基吡啶基、喹喔啉基、喹啉基、吲嗪基或苯并[b]噻吩基)并且环内至少具有一个杂原子如N、O或S的饱和的、不饱和的或芳族碳环基团，该基团可以是可任选地卤素、低级烷基、低级烷氧基、烷硫基、双亚乙基、氨基、酰氨基、羧基、羟基、芳基、芳氧基、杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、硝基、氰基、巯基、磺酰胺基等取代。
“杂芳基”单独地或组合地指含有一个或多个，优选1-3个，甚至更优选1-2个独立地选自O、S和N杂原子并且是可任选地由1-3个取代基取代的具有5或6个环原子的单环芳族环结构，或具有8-10个环原子的二环芳族基团，所述取代基选自卤素、羟基、烷氧基、烷硫基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、酰氧基、芳氧基、杂芳氧基、可任选地由烷基、芳基或杂芳基一取代或二取代的氨基、脒基、可任选地由烷基、芳基、杂芳基或杂环基取代的脲、可任选地由烷基、芳基或杂芳基N-一取代或N，N-二取代的氨基磺酰基、烷基磺酰基氨基、芳基磺酰基氨基、杂芳基磺酰基氨基、烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基等。杂芳基也包含氧化的S或N，如亚磺酰基、磺酰基和环上叔氮的N-氧化物。碳或氮原子是杂芳环结构的连接点，这样可以保留稳定的芳环。杂芳基的实例为吡啶基、哒嗪基、吡嗪基、喹唑啉基、嘌呤基、吲哚基、喹啉基、嘧啶基、吡咯基、恶唑基、噻唑基、噻吩基、异恶唑基、氧杂噻二唑基、异噻唑基、四唑基、咪唑基、三嗪基、呋喃基、苯并呋喃基、吲哚基等。取代的杂芳基包含在有效的碳或氮上连接以便产生稳定化合物的取代基。
“杂环基”单独地或组合地指具有5-10个原子的，环上的1-3个碳原子被O、S或N取代的，并且是未稠合或与苯稠合的或者与具有5-6个环成员的杂芳基稠合的和/或如环烷基中所述是可任选地的非芳族环烷基。杂芳基也包含氧化的S或N，如亚磺酰基、磺酰基和环上叔氮的N-氧化物。连接点在碳或氮原子上。杂环基的实例为四氢呋喃基、二氢吡啶基、哌啶基、吡咯烷基、哌嗪基、二氢苯并呋喃基、二氢吲哚基等。取代的杂环基包含在有效的碳或氮上连接以便产生稳定化合物的取代基。
“取代的杂芳基”是指可任选地由一个或多个官能团一取代或多取代的杂环，所述官能团如卤素、低级烷基、低级烷氧基、烷硫基、双亚乙基、氨基、酰氨基、羧基、羟基、芳基、芳氧基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、硝基、氰基、巯基、磺酰胺基等。
“芳烷基”是指基团-R-Ar，其中Ar为芳基并且R为低级烷基或取代的低级烷基。芳基可以是可任选地由取代基取代的，所述取代基如卤素、低级烷基、烷氧基、烷硫基、双亚乙基、氨基、酰氨基、羧基、羟基、芳基、芳氧基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、硝基、氰基、巯基、磺酰胺基等。
“杂烷基”是指基团-R-Het，其中Het为杂环基并且R为低级烷基。杂烷基可以是可任选地由取代基取代的，所述取代基如卤素、低级烷基、低级烷氧基、烷硫基、双亚乙基、氨基、酰氨基、羧基、芳基、芳氧基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、硝基、氰基、巯基、磺酰胺基等。
“杂芳基烷基”是指基团-R-HetAr，其中HetAr为杂芳基并且R为低级烷基或取代的低级烷基。杂芳基烷基可以是可任选地由取代基取代的，所述取代基如卤素、低级烷基、取代的低级烷基、烷氧基、烷硫基、双亚乙基、芳基、芳氧基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、硝基、氰基、巯基、磺酰胺基等。
“环烷基”是指含有3-15个碳原子的二价环或多环烷基。
“取代的环烷基”是指包含一个或多个取代基的环烷基，所述取代基如卤素、低级烷基、取代的低级烷基、烷氧基、烷硫基、双亚乙基、芳基、芳氧基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、硝基、氰基、巯基、磺酰胺基等。
“环杂烷基”是指其中一个或多个环上碳原子被杂原子(例如N、O或S)取代的环烷基。
“取代的环杂烷基”是指本文所定义的包含一个或多个取代基的环杂烷基，所述取代基如卤素、低级烷基、低级烷氧基、烷硫基、双亚乙基、氨基、酰氨基、羧基、羟基、芳基、芳氧基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、硝基、氰基、巯基、磺酰胺基等。
“烷基环烷基”是指基团-R-环烷基，其中环烷基为为环烷基并且R为低级烷基或取代的低级烷基。环烷基可以是可任选地由取代基取代的，所述取代基如卤素、低级烷基、低级烷氧基、烷硫基、双亚乙基、氨基、酰氨基、羧基、羟基、芳基、芳氧基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、硝基、氰基、巯基、磺酰胺基等。
“烷基环杂烷基”是指基团-R-环杂烷基，其中R为低级烷基或取代的低级烷基。环杂烷基可以是可任选地由取代基取代的，所述取代基如卤素、低级烷基、低级烷氧基、烷硫基、氨基、酰氨基、羧基、双亚乙基、羟基、芳基、芳氧基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、硝基、氰基、巯基、磺酰胺基等。
本发明化合物可按合成方案1-4所述方法来制备。通式IV的化合物可按合成方案1所述方法来制备。Scheme 1. 化合物I可通过在80℃下，在AcOH和MeOH的化合物中将化合物1与适宜取代的1，3二体积反应制备(Holzer等人，J.Heterocycl.Chem.(1993)30，865)。由化合物I与2，2-二甲氧基丙烷在酸存在下反应获得的化合物II可用高锰酸钾或氯铬酸吡啶翁氧化为羧酸III(以结构上类似的化合物为基础)(M.Hudlicky，(1990)Oxidations in Organic Chemistry，ACSMonographs，American Chemical Society，Washington D.C.)。式NHR6R7伯胺或仲胺和化合物III可通过使用DCC(M.Fujino等人，Chem.Pharm.Bull.(1974)，22，1857)，PyBOP(J.Martinez等人，J.Med.Chem.(1988)，28，1874)或PyBrop(J.Caste等人，Tetrahedron，(1991)，32，1967)偶联条件反应，得到化合物IV。化合物V的脱保护可通过与80％乙酸水溶液(T.W.Green andP.G.M.Wuts，(1991)，Protective Group in Organic Synthesis，A，Wiley-Interscience publication)或与无水HCl(4N)一起加热进行，得到通式VI化合物。Scheme 2. 化合物可如合成方案2所述制备。Tri TBDMS衍生物4可通过将化合物2在DMF中用TBDMSCl和咪唑处理，然后用NaOH水解乙酯获得。式NHR6R7伯胺或仲胺和化合物4可通过使用DCC(M.Fujino等人，Chem.Pharm.Bull.(1974)，22，1857)，PyBOP(J.Martinez等人，J.Med.Chem.(1988)，28，1874)或PyBrop(J.Caste等人，Tetrahedron，(1991)，32，1967)偶联条件反应，得到化合物V。Scheme3 合成方案3中说明了化合物11的特异性合成。如先前所述，将通过商业渠道获得的鸟苷5转化为三乙酸盐6(M.J.Robins and B.Uznanski，Can.J.Chem.(1981)，59，2601-2607)。将通过下列文献中Cerster等人方法(J.F.Cerster，A.F.Lewis，and R.K.Robins，Org.Synthesis，242-243)制备的化合物7在先前描述的两步反应(V.Nair等人，J.Org.Chem.，(1988)，53，3051-3057)中转化为化合物9。化合物1可通过在80℃下，将肼水合物与化合物9在乙醇中反应获得。化合物1在80℃下与乙氧基羰基丙二酰二醛在AcOH和MeOH的混合物中缩合制备化合物10，将化合物10在过量甲胺存在下加热得到化合物11。Scheme4 在合成方案4中描述了1，3-二醛VII的合成。将3，3-二乙氧基丙腈或1，1-二乙氧基-2-硝基乙烷VI(R3＝CO2R，CN或NO2)与甲酸乙酯或甲酸甲酯在NaH存在下反应可得到二醛VII(Y.Yamamoto等人，J.Org.Chem.(1989)54，4734)。
本发明化合物与放射性显像剂联合使用使冠脉活动显像。与心房和AV结中的腺苷A1受体和/或外周血管中的A2B受体截然不同，本发明化合物是确信在冠脉血管中特异性激活血管A2A受体的A2A激动剂，因此避免了不需要的副作用。当给予治疗量时，本发明化合物引起冠脉血管扩张，冠脉窃血，其中健康的冠脉血管从非健康的血管窃取血流，导致心脏组织血流不足。较低剂量的A2A激动剂可以在慢性CAD治疗中提供有益的冠脉血管扩张(不太严重)。
与A2A激动剂一样，本发明化合物也用于血管成形术的辅助治疗以引起扩张，抑制血小板聚集和作为一般的抗炎剂。A2A激动剂如本发明化合物可通过阻止中性白细胞激活提供上述治疗效益(实验的治疗学的嘌呤能途径K.A.Jacobson和M.F.Jarvis 1997 Wiley，纽约)。本发明化合物对血小板和中性白细胞聚集并阻塞血管的无回流状况也是有效的。与A2A激动剂一样，本发明化合物通过阻止嗜中性白细胞和血小板激活有效地治疗无回流状况(例如，确信所述化合物可阻止中嗜性白细胞释放过氧化物)。与A2A激动剂一样，本发明化合物通过它们对中性白细胞的抗炎作用也可以用作心脏保护剂。因此，当心脏将经受局部缺血状态如移植时，它们是有用的。
本发明也包括上述A2A激动剂的前药。前药是一种经过化学修饰并且在其作用部位可能是无生物活性的，但可通过一种或多种酶过程或体内过程降解或修饰成生物活性形式的药物。本发明前药应该具有与母化合物不同的药动学特征，因为它能够改善跨粘膜上皮的吸收、是更好的盐制剂和/具有更好的溶解性并且能够改善系统的稳定性。优选地，上述化合物可在一个或多个羟基上进行修饰。所述修饰可以是(1)例如，可以由酯酶或脂肪酶裂开的酯或氨基甲酸酯衍生物；(2)可由特异性或非特异性蛋白酶识别的肽；或(3)通过膜选择作用在作用部位蓄积的衍生物或前药形式或修饰的前药形式，或者上述(1)-(3)的任一组合。
所述组合物可通过口服、静脉内、表皮或本领域已知的给予治疗剂的任何其他方法给予。治疗方法包括给予优选分散在药用载体中的有效量所选择化合物。活性组分的剂量单位通常为0.01-100mg/kg，而且本领域技术人员很容易根据给药途径、病人的年龄和疾病状况确定。典型地，在冠脉显像前大约5分钟至大约1小时或更长时间，给予该剂量的化合物溶液。当给予治疗量本发明化合物时，预期没有任何无法接受的毒理学作用。
如果本发明最终化合物包含碱性基团，可制备酸加成盐。化合物的酸加成盐可按照标准方法，在适宜的溶剂中，由母化合物和过量的酸如盐酸、氢溴酸、流速、磷酸、乙酸、马来酸、琥珀酸或甲磺酸制备。盐酸是特别有用的。如果最终化合物包含酸性基团，可制备阳离子盐。典型地，将母化合物用过量的碱性试剂如包含适宜阳离子的氢氧化物、碳酸盐或醇化物处理。阳离子如Na+、K+、Ca+2和NH4+是可药用盐中存在的阳离子的实例。某些化合物形成内盐或两性离子，它们也可能是适宜的。
包含本发明化合物的药物组合物，和/或其衍生物可以配制成用于非肠道给药的溶液剂或冻干粉剂。粉剂可以在使用前通过加入适宜的稀释剂或其它可药用载体重新配制。如果以液体形式使用，本发明组合物优选地配制成缓冲、等渗的水溶液。适宜的稀释剂的实例为标准的等渗盐溶液、标准的5％葡萄糖水溶液和缓冲的醋酸钠或醋酸铵溶液。所述液体制剂适用于非肠道给药，但也可以用于口服给药。包含本发明化合物的药物组合物中可能需要加入赋形剂如聚乙烯吡咯烷酮、明胶、羟基纤维素、阿拉伯胶、聚乙二醇、甘露糖醇、氯化钠、枸橼酸钠或本领域技术人员已知的任何其他赋形剂。或者，所述药物组合物可以制备成用于口服给药的胶囊剂、片剂或乳剂或糖浆剂。可以加入可药用固体或液体载体来增强或稳定所述组合物，或便于所述组合物的制备。液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、甘油、盐水、醇或水。固体载体包括淀粉、乳糖、硫酸钙、二水合物、teffaalba、硬脂酸镁或硬脂酸、滑石粉、果胶、阿拉伯胶、琼脂或明胶。所述载体也可以包括持续释放材料如单一的或与蜡混合的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。固体载体的量可以改变，但优选地，每剂量单位含大约20mg至大约1g。药用配料可使用常规技术配制，如通过碾磨、混合、制粒和压片(如果需要)来制备片剂；或者通过碾磨、混合和填充来制备硬明胶胶囊。当使用液体载体时，所述制剂可以是糖浆剂、酏剂、乳剂或含水或不含水的悬浮液形式。所述液体制剂可以直接给予或填充到软明胶胶囊中。优选地，本发明组合物以溶液剂形式通过口服给予或者通过连续输注或以浓缩药团形式静脉内给予。
下列实施例用于说明本发明。所述实施例并不以任何方式限制本发明范围，而是为了显示如何制备和使用本发明化合物。在实施例中，所有温度为摄氏度。
实施例1 {9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)oxolan-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-羧酸乙酯(12)向2-肼腺苷(0.025g，0.08mmol)在MeOH/AcOH 1∶1混合物中形成的悬浮液中加入(乙氧基羰基)丙二酰二醛(0.019g，0.12mmol)并将该混合物在80℃下加热3小时。通过过滤收集所形成的沉淀并用EtOH和乙醚洗涤得到12。1HNMR(DMSO-d6)δ1.25(t，3H)，3.5(m，1H)，3.6(m，1H)，3.8(d，1H)，4.15(d，1H)，4.55(m，1H)，5.0(t，1H)，5.2(d，1H)，5.5(d，1H)，5.9(d，1H)，7.15-7.3(m，5H)，7.8(br s，2H)，8.1(s，1H)，8.4(s，1H)，8.9(s，1H)。
实施例2 (4S，2R，3R，5R)-2-{6-氨基-2-[4-(4-氯苯基)吡唑基]嘌呤-9-基}-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇(13)
向2-肼腺苷(0.025g，0.08mmol)在MeOH/AcOH 1∶1混合物中形成的悬浮液中加入2-(4-氯)苯基丙二酰二醛(0.022g，0.12mmol)并将该混合物在80℃下加热3小时。通过过滤收集所形成的沉淀并用EtOH和乙醚洗涤得到13。1HNMR(DMSO-d6)δ3.5(m，1H)，3.6(m，1H)，3.8(d，1H)，4.15(d，1H)，4.2(q，2H)，4.55(m，1H)，5.9(d，1H)，7.45(d，2H)，7.75(d，2H)，8.25(s，1H)，8.35(s，1H)，8.9 (s，1H)。 (4S，2R，3R，5R)-2-{6-氨基-2-[4-(4-甲氧基苯基)吡唑基]嘌呤-9-基}-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇(14)向2-肼腺苷(0.025g，0.08mmol)在MeOH/AcOH 1∶1混合物中形成的悬浮液中加入2-(4-甲氧基)苯基丙二酰二醛(0.022g，0.12mmol)并将该混合物在80℃下加热3小时。通过过滤收集所形成的沉淀并用EtOH和乙醚洗涤得到14。1HNMR(DMSO-d6)δ3.55(m，1H)，3.65(m，1H)，3.75(s，3H)，3.9(d，1H)，4.15(d，1H)，4.6(m，1H)，5.9(d，1H)，6.75(d，2H)，7.6(d，2H)，8.15(s，1H)，8.35(s，1H)，8.8(s，1H).
实施例4 (4S，2R，3R，5R)-2-{6-氨基-2-[4-(4-甲基苯基)吡唑基]嘌呤-9-基}-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇(15)向2-肼腺苷(0.025g，0.08mmol)在MeOH/AcOH 1∶1混合物中形成的悬浮液中加入2-(4-甲基)苯基丙二酰二醛(0.019g，0.12mmol)并将该混合物在80℃下加热3小时。通过过滤收集所形成的沉淀并用EtOH和乙醚洗涤得到15。1HNMR(DMSO-d6)δ3.55(m，1H\)，3.65(m，1H)，3.75(s，3H)，3.9(d，1H)，4.15(d，1H)，4.6(m，1H)，5.9(d，1H)，6.75(d，2H)，7.6(d，2 H)， 8.15(s，1H)，8.35(s，1H)，8.8(s，1H)。
实施例5 (1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)oxolan-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基甲酰胺(16)将化合物12(0.05mg，0.12mmol)加到4mL甲胺(40％水溶液)中。将该混合物在65℃下加热24小时。真空浓缩后，残渣用制备TCL(10％MeOHDCM)纯化。1HNMR(CD3OD)δ2.90(s，3H)，3.78(m，1H)，3.91(m，1H)，4.13(d，1H)，4.34(d，1H)，4.64(m，1H)，6.06(d，1H)，8.11(s，1H)，8.38(s，1H)，9.05(s，1H)。
实施例6
1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)oxolan-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-羧酸(17)将化合物12(0.05mg，0.12mmol)溶解在1N NaOH中。将所得到的溶液在室温下放置2小时，然后酸化至pH4。过滤所得到的沉淀并用水和乙醚洗涤。1HNMR(CD3OD)A3.75(m，1H)，3.90(m，1H)，4.13(d，1H)，4.43(d，1H)，4.64(m，1H)，6.05(d，1H)，8.10(s，1H)，8.35(s，1H)，9.05(s，1H)。
实施例7 (1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)oxolan-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N，N-二甲基甲酰胺(18)化合物18可按照制备化合物16类似的方法，通过用二甲胺代替甲胺来制备，MS405.12(M+1)。
实施例8 (1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)oxolan-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-乙基甲酰胺(19)化合物19可按照制备化合物16类似的方法，通过用乙胺代替甲胺来制备，MS 405.35(M+1)。
实施例9 1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)oxolan-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-甲酰胺(20)化合物20可按照制备化合物16类似的方法，通过用氨代替甲胺来制备，MS377.25(M+1)。
实施例10 (1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)oxolan-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-(环戊基甲基)甲酰胺(21)将化合物12(0.5g，1.2mmol)溶解在无水DMF，TBDMSCl(1.5g，10mmol)中并加入咪唑(0.68g，10mmol)，将该混合物在80℃下加热24小时。将溶剂蒸发并将残渣通过闪式柱纯化，得到三甲硅烷基保护形式的化合物12。然后将三甲硅烷基衍生物(0.8g)悬浮在1mL水中并用2mL 1N KOH/MeOH处理。将该混合物在室温下搅拌72。减压除掉溶剂并将残渣悬浮在5mL水中，用1N HCl酸化至pH5.5。将所得到的沉淀过滤并用水和乙醚洗涤，得到三甲硅烷基形式的酸20。
然后，将三甲硅烷基衍生物酸20(0.14g，0.2mmol)溶解在5mL二氯甲烷中。向该溶液中加入HBTU(0.19g，0.4mmol)、HOBt(.076g，4mmol)、N-甲基吗啉(0.04g，0.4mmol)和cat.DMAP。将该混合物在室温下放置24小时。然后用10％枸橼酸、饱和NaHCO3、盐水洗涤并用MgSO4干燥。除掉溶剂，残渣用5mL 0.5N NH4F/MeOH处理。将溶液加热回流24小时。将溶剂蒸发并将残渣通过制备TCL纯化，得到化合物21，MS445.26(M+1)。
实施例11 (1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)oxolan-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-[(4-氯苯基)甲基]甲酰胺(22)化合物22可按照制备化合物21类似的方法，通过用4-氯苯甲胺代替环戊胺来制备，MS501.19(M+1)。
实施例13 2-[(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)oxolan-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)羰基氨基]乙酸乙酯(23)化合物23可按照制备化合物21类似的方法，通过用甘氨酸甲酯代替环戊胺来制备，MS445.26(M+1)。
实施例14分析本发明化合物以确定其在猪纹状体膜制剂上对A2A受体的亲和力。简而言之，0.2mg的猪纹状体膜用腺苷脱氨基酶(2U/ml)和50mMTris缓冲液(pH＝7.4)处理然后混合。在猪纹状体膜中加入2μL浓度范围在100nM到10μM浓度的本发明化合物连续稀释的DMSO储备溶液或加入2μL只含有DMSO的对照，然后加入拮抗剂ZM241385的Tris缓冲液(50mM，pH7.4)，得到2nM的最终浓度。在23℃温度下保温2小时后，用膜收集器和多次洗涤的膜(3×)过滤溶液。在闪烁混合液中将滤器皿计数以确定由本发明化合物取代的氚标记ZM的量。使用超过5点的曲线得到Ki值并在下表列出的栏中显示实验序号。
表1
+++＝10-1,000nM++＝1,000-10,000nM+＝大于10,000nM-＝大于100,000nM实施例15本实验的目的是确定本发明化合物与A1、A2A、A2B和A3腺苷受体的亲和力和受体结合的选择性。分子克隆法已经确定并证实存在4个亚型的腺苷受体(AdoRs)，指定为A1、A2A、A2B和A3AdoRs(Linden，1994)。这些AdoRs亚型具有不同的解剖学分布、药理特性和生理功能(Shryock和Belardinelli，1997)。A1和A3AdoRs偶合来抑制G蛋白(Gi/o)并且减少腺苷酰环化酶的活性，而A2A和A2BadoRs通过偶合来刺激G蛋白质(Gs)而增加细胞内cAMP含量。
对不同的腺苷受体亚型具有高效力和组织/器官选择性的配体具有治疗和诊断各种疾病(如心律不齐、局部缺血心脏病、哮喘和帕金森氏病)的能力并且是学术界和工业上努力进行研究的焦点。这里我们报告使用表达内皮AdoRs或重组人AdoRs的哺乳动物细胞系确定的本发明一系列新的腺苷类似物的药理和功能特性。
材料腺苷脱氨酶购自Boehringer Manheim Biochemicals Indianapolis，IN，U.S.A)。[3H]ZM241385(LotNo.1)购自Tocris CooksonLtd(Langford，Bristol，UK)。[3H]CPX(Lot No.3329207)购自New England Nuclear(Boston，MA，USA)。CGS2l680(Lot No.SW-3R-84和89H4607)、NECA(LotNo.OXV-295E)、R-PIA(Lot No.WY-V-23)、Rolipram和HEK-hA2AAR膜从Sigma-RBI(Natick，MA)处获得。WRC-0470按文献(K.Niiya等人，J.Med.Chem.354557-4561(1992))中所述方法来制备。合成本发明化合物16并制备成DMSO的储备溶液(10mmol/L)。
细胞培养和膜制剂-PC12细胞从美国典型物培养中心获得并在具有5％胎牛血清、10％马血清、0.5mmol/L L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素和2.5μg/mL两性霉素的DMEM中生长。稳定表达重组人A2BadoRs(HEK-hA2BAdoR)的HEK-293细胞在补充有10％胎牛血清和0.5mg/mL G-418的DMEM中生长。稳定表达重组人A1adoRs(CHO-hA1AdoR)和A3adoRs(CHO-hA3AdoR)的CHOK1细胞在补充有10％胎牛血清并存在0.5mg/mL G-418的Ham’s F-12介质的150-mm塑料培养板上单层生长。细胞在保持37℃的5％CO2/95％空气环境中培养。
为了制备膜，将细胞从培养板中分离到冰冷的50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中。细胞悬浮液用设定在4的Polytron匀化30秒并以48000g的转速旋转15分钟。所得团状物通过重新悬浮在冰冷的Tris-HCl缓冲液中并离心来洗涤3次。最终团状物重新悬浮在小体积的Tris-HCl中、等量分装并在-80℃冷冻以备受体结合测定使用。以牛血清作为标准，用Bradford方法(Bio-Rad)确定膜悬浮液的蛋白质浓度。
竞争性结合测定-进行竞争性测定来确定下列未标记化合物(竞争剂)对A1AdoRs(CHO-hA1AdoR细胞膜上的[3H]DPCPX结合部位)、A2AAdoRs(PC12和HEK-hA2AAR细胞膜上的[3H]ZM241385结合部位)、A2BAdoRs(HEK-hA2BAdoR细胞膜上的[3H]DPCPX结合部位)和A3AdoR(CHO-hA3AdoR细胞膜上的[125I]ABMECA结合部位)的亲和力(Ki)化合物WRC-0470、本发明化合物16、NECA、CGS21680和R-PIA。
膜悬浮液在室温下、在50mmol/L含有ADA(1U/mL)、Gpp(NH)p(100μM)、放射配体{或者[3H]ZM241385(-1.5-5nmol/L)、[3H]DPCPX(对A1为～2.5-3.0nmol/L并且对A2B为30nM)或[125I]ABMECA(1nM)}和浓度逐渐增高竞争剂的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中培养2小时。培养结束时，使用Brandel组织收获器(Gaithersburg，MD)经Whatman GF/C玻璃纤维滤器过滤来分离结合和游离的放射配体。对每个浓度的竞争剂重复测定3次。
研究设计(实验方法)各种CVT化合物对A1和A2A腺苷受体的亲和力(Ki)通过其竞争由CHO-hA1AdoR、PC12或HEK-HA2AAdoR细胞衍生的膜上[3H]CPX(A1)或[3H]ZM241385(A2A)结合部位的能力来测定。R-PIA和CGS21680(分别是A1和A2A的选择性激动剂)和NECA(非选择性AdoR激动剂)用作对照。为了便于比较和避免因受体与G-蛋白质偶合而并发多亲和状态，在Gpp(NH)p(100μM)存在下研究未与G-蛋白质偶合的受体的竞争结合。所选化合物对A2B和A3受体的亲和性通过其分别竞争由HEK-HA2BAdoR和CHO-hA3AdoR细胞衍生的膜上[3H]CPX(A2B)或[125I]ABMECA(A3)结合部位的能力来评价。
结果通过竞争结合研究测定的WRC-0470、化合物16对人A1、鼠和人A2AAdoRs的亲和力(Ki)概括在下表2中。所有化合物都对人A2A与A1受体显示中度的选择性。此外，化合物16在10μM浓度下与[3H]CPX(HEK-hA2BAdoR)或[125I]IBMECA(CHO-hA3AdoR)的特异性结合分别降低20％和22％。
表2腺苷受体激动剂对A2AAdoRs和A1AdoRs的结合亲和力Ki/hmol/L(pKi±SEM)表2Ki/nmol/L(pKi±SEM)
该实验结果显示化合物16是低亲和力的A2A激动剂。
实施例16本实施例的目的是确定本发明化合物16对冠状动脉传导力作用的药理性特性。具体来说，设计该实验来确定1)化合物16的能力并将其能力与腺苷和其它被选择的A2AAdoR激动剂进行比较和2)腺苷受体A1或A2AAdoR亚型介导由本发明化合物16引起的冠脉血管扩张。
在心脏中，A2A腺苷受体介导由腺苷引起的冠状血管扩张，而A1受体介导腺苷的心抑制作用，如负性变时性作用和变传导(AV阻滞)作用。
已经合成了一些强效的和选择性的A1和A2AAdoRs配体(包括激动剂和拮抗剂)。已经提出，A1AdoRs激动剂可在心脏用作抗心律失常药物，而A2AAdoRs激动剂正开发为选择性冠状血管扩张剂。
为了开发冠状血管扩张剂而合成了一系列以选择性激活A2A腺苷受体(A2AAdoR)为靶向的腺苷衍生物。更具体来说，在该研究中我们报告了一系列新的A2AAdoRs激动剂在大鼠和豚鼠离体的灌注心脏中对冠状动脉传导力的影响(血管扩张作用)。
材料大鼠(Sprague Dawley)和豚鼠(Hartley)分别购自simonsen和CharlesRivers。WRC-0470按文献(K.Niiya等人，J.Med.Chem.354557-4561(1992))中所述方法来制备。本发明的化合物16如上所述制备。CGS21680和腺苷购自Sigma。按Standard Methods制备Krebs-Henseleit溶液，并且0.9％盐水购自McGraw，Inc。
方法在本研究中使用体重分别为230到260克和300到350克的任一性别的成年Sprague Dawley大鼠和Hartley豚鼠。通过腹膜注射含有氯胺酮和甲苯噻嗪(氯胺酮100mg，甲苯噻嗪20mg/ml)的混合液来麻醉动物。打开胸腔并快速取出心脏。在冰冷却的Krebs-Henseleit溶液中简单地漂洗心脏(参见下文)，并在主动脉中插入套管。然后以10ml/分钟的流速用含有NaCl117.9、KCl4.5、CaCl22.5、MgSO41.18、KH2PO41-18、丙酮酸盐2.0mmol/L的改良Krebs-Henseleit(K-H)溶液灌注心脏。K-H溶液(pH7.4)连续用95％O2和5％CO2通气并且温热到35±0.50℃。使用放置在左心房上的双极电极使心脏在340ms(250次/分钟)的固定周期作电搏动。电刺激是由Grass刺激器(Model S48，W.Warwick，RI)产生的并且通过Stimuli IsolationUnit(Model SIU5，Astro-Med，Inc.，NY)以3毫秒周期的方形波脉冲和扩大至少两倍阈值强度来传递。
压力转换器通过位于心脏上约3cm的T-连接器与主动脉插管连接，用来测量冠脉灌注压(CPP)。在整个实验中监测冠脉灌注压并在图表记录器(Gould Recorder 2200S)或计算机记录系统(PowerLab/4S，AdinstrumentsPty Ltd，澳大利亚)上记录。在研究中仅仅使用CPP在60-85mmHg范围(不存在药物)的心脏。以冠脉灌注速度(10ml/分钟)和冠脉灌注压之比来计算冠脉传导性(ml/分钟/mmHg)。
在实验中，测量了A1腺苷受体介导的负性变传导作用，记录了动脉恒定搏动期间心房和心室表面的电描记图。按以前Jenkins和BelardinelliCirc.Res.6397-116(1988)所描述的方法测定各种腺苷受体激动剂对房室传导时间的影响。
在购自Aldrich，PS04253MS的二甲基亚砜(DMSO)中制备本发明化合物16(5mM)和CGS21680(5mM)的储备液。在盐水中制备腺苷的储备溶液(1mg/ml)。通过盐水稀释储备溶液产生2×10-4或2×10-5M浓度的各溶液。这些溶液以20μl浓缩药团形式注射到装置的灌注管线中。在某些实验中，将溶液放置在30ml玻璃注射器中并以获得所需灌注液浓度(如，10、100nM等)必需速度输入药物。
A2A腺苷受体激动剂的冠脉血管扩张作用获得了本发明化合物16(0.1-400nM)和CGS21680(0.1-10nM)增加冠脉传导性作用的量效关系。记录了对照的冠脉灌注压测定值后，给予浓度逐渐增加的腺苷受体激动剂直到观察到最大冠脉血管扩张作用。记录各个浓度腺苷受体激动剂的稳态反应。在该组(每个激动剂需要4-6个心脏)的各个心脏中，仅获得一个激动剂和一个量效关系。
化合物16在腺苷激动剂不存在或存在下的冠脉血管扩张作用为了测定腺苷受体亚型(A1或A2A)介导由化合物12引起冠脉血管扩张作用，分别使用A1或A2A腺苷受体拮抗剂CPX和ZM241385。将心脏暴露到待测化合物(10nM)中，并在该拮抗剂的作用达到稳态后，首先将CPX(60nM)，然后将ZM241385加到灌注液中并记录CPP的变化。
在动脉恒定搏动期为340毫秒的离体灌注心脏(n＝36只大鼠和18只豚鼠)中，腺苷、CGS21680、WRC0470和本发明化合物16引起浓度依赖性冠脉传导增加。CGS21680和WRC是最强的受试激动剂。化合物16在增加冠脉传导方面大约为腺苷的10倍。值得注意的是所有激动剂在大鼠中的冠脉血管扩张作用比在豚鼠心脏中强数倍。
表3腺苷和A2A腺苷受体激动剂在大鼠和豚鼠离体灌注心脏中增加冠脉传导的能力
为了测定在化合物16存在下观察到的对冠脉血管扩张起作用的AdoR亚型(A1与A2A)，研究该激动剂(10nM)在选择性A1AdoR拮抗剂(Belardineli等人，1998)CPX和选择性A2AAdoR拮抗剂(Poucher等人，1995)ZM241385不存在或以60nM浓度存在下对冠脉传导的影响。如图1所示，化合物16使冠脉传导从基线值0.16+0.02mlmmHg-1min-1明显增加至0.22+0.01mlmmHg-1min-1。化合物16引起的冠脉传导增加不受CPX影响，但被ZM241385(0.17±0.02mlmmHg-1min-1)完全逆转。
实施例17本实施例的目的是确定化合物16引起冠脉血管扩张的功能选择性。具体来说，在大鼠和豚鼠心脏中确定了化合物16引起冠脉血管扩张(A2AAdoR反应)和延长A-V结传导时间(A1AdoR反应)的能力。
材料Sprague Dawley大鼠购自simonsen。Hartley豚鼠购自Charles Rivers。化合物16如上所述来制备。按美国专利579416(该文献引入本文供参考)所公开的合成方法来制备CVT-510(2-{6-[((3R)oxolan-3-基)氨基]嘌呤-9-基}(4S，3R，5R)-5-(羟基甲基)oxolane-3，4-二醇)。氯胺酮购自Fort DodgeAnimal Health(Lot No.440444)并且甲苯噻嗪购自Bayer(Lot No.26051A)。按标准方式制备Krebs-Henseleit溶液，并且0.9％氯化钠购自McGraw，Inc(Lot No.J8B246)。
离体灌注心脏样本在本研究中使用体重分别为230到260克和300到350克的任一性别的大鼠和豚鼠。通过腹膜注射含有氯胺酮和甲苯噻嗪(氯胺酮100mg，甲苯噻嗪20mg/ml)的混合液来麻醉动物。打开胸腔并快速取出心脏。在冰冷却的Krebs-Henseleit溶液中简单地漂洗心脏(参见下文)，并在主动脉中插入套管。然后以10ml/分钟的流速用含有NaCl117.9、KCl4.5、CaCl22.5、MgSO41.18、KH2PO41.18、丙酮酸盐2.0mmol/L的改良的Krebs-Henseleit(K-H)溶液灌注心脏。K-H溶液(pH7.4)连续用95％O2和5％CO2通气并且温热到35±0.50℃。使用放置在左心房上的双极电极使心脏以340毫秒(250次/分钟)的固定周期作电搏动。电刺激是由Grass刺激器(Model S48，W.Warwick，RI)产生的并且通过Stimuli IsolationUnit(Model SIU5，Astro-Med，Inc.，NY)以3毫秒周期的方形波脉冲和扩大至少两倍阈值强度来传递。
压力转换器通过位于心脏上约3cm的T-连接器与主动脉插管连接，用来测量冠脉灌注压(CPP)。在整个实验中监测冠脉灌注压并在图表记录器(Gould Recorder 2200S)或计算机记录系统(PowerLab/4S，ADInstrumentsPty Ltd，澳大利亚)上记录。在研究中仅仅使用CPP在60-85mmHg范围(不存在药物)的心脏。以冠脉灌注速度(10ml/分钟)和冠脉灌注压之比来计算冠脉传导性(ml/分钟/mmHg)。
测量A1腺苷受体介导的对A-V结传导时间的抑制作用(负性变传导作用)。记录了动脉恒定搏动期间心房和心室表面的电描记图。按以前Jenkins和Belardinelli(1988)所描述的方法测定化合物16对房室传导时间和对His-束(S-H间隙)刺激的影响。
然后测定化合物16对冠脉传导性(A2A作用)和房室传导时间或对His-束(S-H)间隙刺激(A1作用)的作用。心脏用仪器连续记录冠脉灌注压(A2A反应)和房室(A-V)传导时间或S-H间隙(A1反应)。在各实验中，测定化合物16对增加冠脉传导性和延长A-V传导时间或S-H间隙的量效关系(n＝6只大鼠，4只豚鼠)。测量对照CPP和A-V传导时间或S-H间隙后，给予浓度逐渐增加的化合物16直到产生最大的冠脉血管扩张作用和A-V结传导时间或S-H间隙延长作用。在离体大鼠心脏(n＝4)中，测定各种浓度(100-400nM)的CVT510，即A1腺苷激动剂(Snowdy等人1999)对A-V结传导时间的作用并与化合物16(0.1-30μM)进行比较。
化合物16增加冠状动脉传导和延长A-V结传导时间或S-H间隙的量效曲线显示与附图1和2中。在大鼠和豚鼠中，化合物16以浓度依赖性方式增加冠脉传导性。化合物16增加大鼠和豚鼠心脏冠脉传导性的能力(EC50值)分别是6.4±0.6nM和18.6±6.0nM。相反地，该激动剂对S-H间隙的作用在大鼠和豚鼠心脏之间有某些改变。在大鼠心脏中，化合物16不延长A-V结传导时间(附图1)，而A1AdoR激动剂CVT510明显延长A-V结传导时间(附图3)。与在大鼠中不同，在豚鼠心脏中，化合物16引起浓度依赖性S-H间隙延长(A1反应)，其EC50值(效力)为4.0±2.3μM(附图4)。该值大约为引起冠脉血管扩张(A2A反应-附图3)的EC50值(18.6±6.0nM)的215倍。
结果表明化合物16在大鼠心脏中是一种无负性变传导作用(A1AdoR介导的作用)的冠脉血管扩张剂(A2AAdoR介导的作用)。在豚鼠心脏中，化合物16引起某些负性变传导作用。然而，化合物16选择性引起冠脉血管扩张的作用至少是负性变传导作用的215倍。由化合物16引起的在A1AdoR介导的反应中存在物种差异的原因是未知的。在两种动物(大鼠和豚鼠)中，化合物16在不引起A-V结传导时间延长，即没有负性变传导作用的浓度下产生最大的冠脉血管扩张作用。也观察到化合物16对A2A的亲和力大于A1AdoR(即，＞2-/＞-13-倍)并且对A2AAdoR介导的冠脉血管扩张作用的受体保留明显大于对A1AdoR介导的负性变传导作用的受体保留。
实施例18设计本研究来测试A2A腺苷受体(AdoR)的亲和力(Ki或pKi)和作用持续时间之间有相反关系的假设。具体来说，研究的目的是确定大鼠离体心脏和麻醉猪中由选择的一系列高和低亲和力的A2AAdoR激动剂引起的冠脉血管扩张作用持续时间和这些激动剂在猪纹状体中对A2AAdoR的亲和力之间的关系。
材料大鼠(Sprague Dawley)购自simonsen。农场猪从Division ofLaboratory Animal Resources，University of Kentucky处获得。本发明化合物12、化合物13、化合物6如上所述制备。按美国专利4956345(该文献引入本文供参考)所述方法来制备YT-0146。WRC-0470按文献(K.Niiya等人，J.Med.Chem.354557-4561(1992))中所述方法来制备。CGS21680购自Research Biochemicals，Inc.和Sigma并且R-PLA(Lot No.WY-V-23)购自Research Biochemicals，Inc.。HENECA由Camerino(Italy)大学的GloriaCristalli教授馈赠。
麻醉剂氯胺酮购自Fort Dodge Animal Health。甲苯噻嗪购自Bayer。戊巴比妥钠购自ButlerCo.处。苯福林购自Sigma。DMSO购自Sigma和美国典型物保藏中心。按常规方法制备Krebs-Henseleit溶液，并且0.9％盐水购自McGraw，Inc。
大鼠离体灌注心脏样本在本研究中使用体重为230到260克的任一性别的成年SpragueDawley大鼠。通过腹膜注射含有氯胺酮和甲苯噻嗪(氯胺酮100mg，甲苯噻嗪20mg/ml)的混合液来麻醉动物。打开胸腔并快速取出心脏。在冰冷却的Krebs-Henseleit溶液中简单地漂洗心脏(参见下文)，并在主动脉中插入套管。然后以10ml/分钟的流速用含有NaCl117.9、KCl4.5、CaCl22.5、MgSO41.18、KH2PO41.18、丙酮酸盐2.0mmol/L的改良的Krebs-Henseleit(K-H)溶液灌注心脏。K-H溶液(pH7.4)连续用95％O2和5％CO2通气并且温热到35±0.50℃。使用放置在左心房上的双极电极使心脏以340毫秒(250次/分钟)的固定周期作电搏动。电刺激是由Grass刺激器(Model S48，W.Warwick，RI)产生的并且通过Stimuli IsolationUnit(Model SIU5，Astro-Med，Inc.，NY)以3毫秒周期的方形波脉冲和扩大至少两倍阈值强度来传递。
压力转换器通过位于心脏上约3cm的T-连接器与主动脉插管连接，用来测量冠脉灌注压(CPP)。在整个实验中监测冠脉灌注压并在图表记录器(Gould Recorder 2200S)或计算机记录系统(PowerLab/4S，ADInstrumentsPty Ltd，澳大利亚)上记录。在研究中仅仅使用CPP在60-85mmHg范围(不存在药物)的心脏。以冠脉灌注速度(10ml/分钟)和冠脉灌注压之比来计算冠脉传导性(ml/分钟/mmHg)。
麻醉下开胸的猪样本在本研究中使用体重为22-27kg的农场猪。所有动物都按“ThePrinciples of Laboratory Animal Care”(由National Society for Medicalresearch制定)和“Guide for the Care an33d Use of Laboratory Anomals”(由Institute of Laboratory Animal Resources编著并由National Institutes ofHealth(NIH公开号为86-23，1996年修订))所述的方法接受人道的饲养。另外，按University of Kentucky Institutional Animal Car and Use Protocol的指导原则使用动物。
用氯胺酮(20mg/kg，肌注)和戊巴比妥钠(15-18mg/kg，静注)来进行麻醉。另外每15-20分钟用戊巴比妥钠(1.5-2mg/kg，静注)保持麻醉。使用室内空气和100％O2的混合物并通过气管切开术来保持气流通畅。调节潮流气量、呼吸速率和吸入空气的O2分数来保持正常的动脉血气(ABG)和pH值。用食管温度探针监测体内温度并通过在37.0-37.5℃下加热衬垫来保持。在开始给予300-400ml浓缩药团后，通过耳或股静脉以5-7ml/kg/分钟的量给予乳酸盐林格溶液。将插管插入股动脉以监测动脉血压并获得ABG样。
通过正中胸骨切开术暴露心脏并悬浮在心包支架中。用尖端放置在左心房腔中并用金线(purse string)缝合固定的5F高保真度压力敏感的末端传感器(Millar Instruments，Houston，TX)测量左心房压力(LVP)。从周围组织中剥离一段左前下行冠状动脉(LAD)(邻近最早斜线分支的起端)。将转变时间的血管周流动探针(Transonic Systems Inc.，Ithaca，NY)放置在该段血管周围来测量冠脉血流(CBF)。在邻近流动探针处，插入24g改性的血管插管用于冠脉内输注。所有血液动力学数据被连续显示在计算机检测器中并通过32位模拟数字转化器输入具有定制软件的在线数据获得计算机(Augury，Coyote Bay Instruments，Manchester，NH)中。将A2AAdoR激动剂溶解在DMSO中以产生1-5mM的储备浓度，在0.9％盐水中稀释并以1-1.5ml/分钟的速度输入。冠脉内给予A2AAdoR激动剂。为了保持血压的恒定，静脉内给予苯福林。在蒸馏水中制备苯福林储备溶液(30mM)。
离体灌注心脏为了测定由腺苷和腺苷受体激动剂引起的A2A腺苷受体介导的冠脉血管扩张的持续时间，通过浓缩药团注射液静脉内给予所述激动剂。试验方案A浓缩药团注射液。将腺苷(20μl，2×10-4M)、本发明化合物(20-40μl，2×10-5M)和其他腺苷受体激动剂的浓缩药团注射到该组(每个激动剂需要3-11个心脏)每个心脏的灌注管线中。测定CPP降低逆转50％(t0.5)和90％(t0.9)的时间。给予每个心脏最大量的三个血管扩张剂。
试验方案B连续输注。在各个系列的试验(n＝4)，将化合物16和腺苷以恒定速度在6分钟的时间中输入灌注管线中。化合物16和腺苷的灌注液浓度分别是20nM和200nM，大约是预先建立的使大鼠离体灌注心脏冠脉传导最大增加值50％(EC50)时各自浓度的4倍。测量停止激动剂输入到CPP降低逆转50％(t0.5)和90％(t0.9)的时间。
注射化合物16的浓缩药团产生的最大血管扩张作用的剂量依赖性持续时间为了确定最大冠状血管扩张作用的持续时间对化合物16剂量的依赖性，将化合物16的2×10-5M储备液浓缩药团注射到灌注管线中。另外，根据浓缩药团的体积改变注射持续的时间，如100、200和300μl浓缩药团分别为10、20和30秒。测量从CPP降低到开始逆转的最低点到最大作用时的持续时间。
各种A2A腺苷受体激动剂的亲和力与其增加冠脉传导作用逆转时间的关系进行这些实验以便研究各种A2A腺苷受体激动剂的亲和力与其对冠脉传导作用持续时间的关系。将各种激动剂的浓缩药团注射到大鼠离体灌注心脏(对于各激动剂来说，n＝4-6)的灌注管线中并测定CPP降低逆转90％(t0.9)的时间。如上所述，在猪纹状体膜中测定各种A2A腺苷受体激动剂的亲和力。将CPP降低逆转时间(t0.9)与其A2A腺苷受体亲和力(pKi)绘图。
开胸的猪在实验开始前，当所有的设备测试完成后稳定30分钟。获得基线血液动力学数据后，开始第一次冠脉内输注A2AADOR激动剂。输注持续4-5分钟以便使LAD CBF达到稳态，然后结束输注。记录基线CBF逆转50％(t0.5)和90％(t0.9)的时间。CBF恢复到给药前数值后10-15分钟，开始第二次输注不同的激动剂。在预试研究中发现，冠脉内输注腺苷激动剂引起不同程度的系统性低血压，因此在后来的所有实验中，静脉内给予苯福林。在开始以1μg/kg/min的剂量输注苯福林之前和输注后进行血液动力学测定。在输注腺苷激动剂期间和输注后调节苯福林的输注速度以把动脉压保持在输注前的5mmHg内。在各实验中测定三种不同激动剂作用的最大值。
结果将腺苷、本发明化合物和其他腺苷衍生物的浓缩药团以引起冠脉传导增加相同或接近相同的浓度注入灌注管线中。尽管腺苷和所述激动剂引起最大的冠脉传导增加相同，但其作用时间是明显不同的。腺苷作用的持续时间是最短的，接下来是化合物16，而CGS21680和WRC0470是最长的。以冠脉传导增加逆转50％和90％(分别为t0.5和t0.9)的时间表示的由腺苷、本发明化合物和其他激动剂引起的冠脉血管扩张的持续时间概括于表4中。
表4腺苷和腺苷受体激动剂在大鼠离体灌注心脏中冠状血管扩张作用的逆转时间
由腺苷和腺苷受体激动剂引起的冠脉传导增加逆转50％和90％(分别为t0.5和t0.9)的时间(分钟)。该值是各标本(n)单独测定的平均值±SEM。
冠状血管扩张作用的逆转时间依赖于腺苷衍生物与脑纹状体A2A受体的亲和力(图2)。激动剂与A2AAdoR的亲和力(PKi)和由该激动剂引起的冠状血管扩张作用的逆转时间(t0.9)之间具有明显(P＜0.05)的反比关系(r＝0.87)。
不管化合物16是以浓缩药团注射或是连续输注，灌注血管扩张作用的逆转都是比较快速的。事实上，对6分钟输注引起冠脉灌注压(CPP)相同降低的剂量的腺苷和化合物16进行比较揭示腺苷和化合物16具有类似的血管扩张和逆转时间的时间过程。t0.5和t0.9几乎相同。化合物16的冠状血管扩张作用的持续时间是剂量依赖性的。化合物16浓缩药团(2×10-5的储备液)体积增加使CPP降低的持续时间延长。冠状血管扩张作用的最大持续时间(CPP保持在最低点的时间)随浓缩药团体积由100μl增加到200和300μ1而延长但不影响CPP的最大减小值。
开胸猪标本中的冠状血管扩张作用在开胸并麻醉的猪标本原位心脏中，本发明的化合物16以及CGS21680和其他A2AAdoR激动剂(即，WRC-0470和YT-146)使冠脉血流(CBF)明显增加。如下表3所述，连续(4-5分钟)冠脉内输注所选剂量的这些化合物使CBF增加3.1-3.8倍。所有激动剂使CBF产生几乎相同的增大(即，“成倍增加”)并使心率和平均动脉血压产生类似改变一旦被建立，就测定其各自冠状血管扩张作用的逆转时间。
表5各种腺苷受体激动剂在开胸并麻醉的猪中使冠脉血流增加的大小
各种腺苷受体激动剂引起的基线上冠脉血流(CBF)的最大“成倍增加”。数据表示各个猪(n)一次或两次测量的平均值±SEM。
如表6所述，由各种A2AAdoR激动剂和“CVT-化合物”产生的冠状血管扩张作用的t0.5和t0.9是可变的。本发明化合物16产生的CBF增加的逆转时间比CGS21680、WRC-0470或YT-146短。更重要的是，在大鼠离体灌注心脏中，A2AAdoR激动剂与猪脑纹状体A2A受体的亲和力(PKi)和冠状血管扩张作用的逆转时间(t0.9)之间成明显(P＜0.05)的反比关系(r＝0.93)。所选的激动剂在大鼠离体灌注心脏和麻醉并开胸的猪标本中产生的冠状血管扩张作用的逆转时间之间有极好的一致性。
表6各种腺苷受体激动剂在开胸并麻醉的猪中产生的冠状血管扩张作用的逆转时间
由腺苷受体激动剂引起的冠脉血流增加逆转50％和90％(分别为t0.5和t0.9)的时间(分钟)。该值是各动物(n)一次或两次测定的平均值±SEM。
化合物16是低亲和力的A2AAdoR激动剂并且强度(-10倍)低于原型激动剂CGS21680。然而，化合物16对冠状血管扩张作用来说是一种完全的激动剂。但是，如本研究所示，其作用时间比高亲和力的激动剂CGS21680和WRC-0470的作用时间短数倍。因此，化合物16是一种作用时间短的A2AAdoR激动剂冠状血管扩张剂。由于其具有比高亲和力A2AAdoR激动剂(如，WRC-0470、CGS21680)短的作用时间，可证明这种低亲和力但仍是完全的激动剂冠状血管扩张剂是心肌放射性核素造影中理想的药理学“应激反应剂”。
权利要求
1.一种具有下列通式的化合物 其中R1＝CH2OH，-C(＝O)NR5R6；R3选自下列组C1-15烷基、卤素、NO2、CF3、CN、OR20、SR20、N(R20)2、S(O)R22、SO2R22、SO2N(R20)2、SO2NR20COR22、SO2NR20CO2R22、SO2NR20CON(R20)2、N(R20)2NR20COR22、NR20CO2R22、NR20CON(R20)2、NR20C(NR20)NHR23、COR20、CO2R20、CON(R20)2、CONR20SO2R22、NR20SO2R22、SO2NR20CO2R22、OCONR20SO2R22、OC(O)R20、C(O)OCH2OC(O)NR20和OCON(R20)2、-CONR7R8、C2-15烯基、C2-15炔基、杂环基、芳基和杂芳基，其中烷基、烯基、炔基、芳基、杂环基和杂芳基取代基可任选地由1-3个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、烷基、NO2、杂环基、芳基、杂芳基、CF3、CN、OR20、SR20、N(R20)2、S(O)R22、SO2R22、SO2N(R20)2、SO2NR20COR22、SO2NR20CO2R22、SO2NR20CON(R20)2、N(R20)2NR20COR22、NR20CO2R22、NR20CON(R20)2、NR20C(NR20)NHR23、COR20、CO2R20、CON(R20)2、CONR20SO2R22、NR20SO2R22、SO2NR20CO2R22、OCONR20SO2R22、OC(O)R20、C(O)OCH2OC(O)R20和OCON(R20)2，并且其中任选的杂芳基、芳基和杂环基取代基可任选地被取代基取代的，所述取代基选自卤素、NO2、烷基、CF3、氨基、一或二烷基氨基、烷基或芳基或杂芳基酰胺、NCOR22、NR20SO2R22、COR20、CO2R20、CON(R20)2、NR20CON(R20)2、OC(O)R20、OC(O)N(R20)2、SR20、S(O)R22、SO2R22、SO2N(R20)2、CN和OR20；R5和R6各自独立地选自氢和可任选地由1-2个取代基取代的C1-15烷基，所述取代基独立地选自卤素、NO2、杂环基、芳基、杂芳基、CF3、CN、OR20、SR20、N(R20)2、S(O)R22、SO2R22、SO2N(R20)2、SO2NR20COR22、SO2NR20CO2R22、SO2NR20CON(R20)2、N(R20)2NR20COR22、NR20CO2R22、NR20CON(R20)2、NR20C(NR20)NHR23、COR20、CO2R20、CON(R20)2、CONR20SO2R22、NR20SO2R22、SO2NR20CO2R22、OCONR20SO2R22、OC(O)R20、C(O)OCH2OC(O)R20和OCON(R20)2，并且其中可选的杂芳基、芳基和杂环基可任选地由卤素、NO2、烷基、CF3、氨基、一或二烷基氨基、烷基或芳基或杂芳基酰胺、NCOR22、NR20SO2R22、COR20、CO2R20、CON(R20)2、NR20CON(R20)2、OC(O)R20、OC(O)N(R20)2、SR20、S(O)22、SO2R22、SO2N(R20)2、CN和OR20取代；R7选自氢、C1-15烷基、C2-15烯基、C2-15炔基、杂环基、芳基和杂芳基，其中烷基、烯基、炔基、芳基、杂环基和杂芳基取代基可任选地由1-3个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、NO2、杂环基、芳基、杂芳基、CF3、CN、OR20、SR20、N(R20)2、S(O)R22、SO2R22、SO2N(R20)2、SO2NR20COR22、SO2NR20CO2R22、SO2NR20CON(R20)2、N(R20)2NR20COR22、NR20CO2R22、NR20CON(R20)2、NR20C(NR20)NHR23、COR20、CO2R20、CON(R20)2、CONR20SO2R22、NR20SO2R22、SO2NR20CO2R22、OCONR20SO2R22、OC(O)R20、C(O)OCH2OC(O)NR20和OCON(R20)2并且其中可选的杂芳基、芳基和杂环基取代基可任选地由卤素、NO2、烷基、CF3、氨基、一或二烷基氨基、烷基或芳基或杂芳基酰胺、NCOR22、NR20SO2R22、COR20、CO2R20、CON(R20)2、NR20CON(R20)2、OC(O)R20、OC(O)N(R20)2、SR20、S(O)22、SO2R22、SO2N(R20)2、CN和OR20取代；R8选自氢、C1-15烷基、C2-15烯基、C2-15炔基、杂环基、芳基和杂芳基，其中烷基、烯基、炔基、芳基、杂环基和杂芳基可任选地由1-3个取代基取代的，所述取代基独立地选自下列组卤素、NO2、杂环基、芳基、杂芳基、CF3、CN、OR20、SR20、N(R20)2、S(O)R22、SO2R22、SO2N(R20)2、SO2NR20COR22、SO2NR20CO20R22、SO2NR20CON(R20)2、N(R20)2NR20COR22、NR20CO2R22、NR20CON(R20)2、NR20C(NR20)NHR23、COR20、CO2R20、CON(R20)2、CONR20SO2R22、NR20SO2R22、SO2NR20CO2R22、OCONR20SO2R22、OC(O)R20、C(O)OCH2OC(O)NR20和OCON(R20)2并且其中各杂芳基、芳基和杂环基可任选地由取代基取代，所述取代基选自下列组卤素、NO2、烷基、CF3、氨基、一或二烷基氨基、烷基或芳基或杂芳基酰胺、NCOR22、NR20SO2R22、COR20、CO2R20、CON(R20)2、NR20CON(R20)2、OC(O)R20、OC(O)N(R20)2、SR20、S(O)22、SO2R22、SO2N(R20)2、CN和OR20；R20选自下列组H、C1-15烷基、C2-15烯基、C2-15炔基、杂环基、芳基和杂芳基，其中烷基、烯基、炔基、杂环基、芳基和杂芳基可任选地由1-3个取代基取代，所述取代基独立地选自下列组卤素、烷基、一或二烷基氨基、烷基或芳基或杂芳基酰胺、CN、O-C1-6烷基、CF3、芳基和杂芳基；R22选自下列组C1-15烷基、C2-15烯基、C2-15炔基、杂环基、芳基和杂芳基，其中烷基、烯基、炔基、杂环基、芳基和杂芳基取代基可任选地由1-3个取代基取代的，所述取代基独立地选自下列组卤素、烷基、一或二烷基氨基、烷基或芳基或杂芳基酰胺、CN、O-C1-6烷基、CF3、芳基和杂芳基；并且，其中R2和R4选自下列组H、C1-6烷基和芳基，其中烷基和芳基可任选地有卤素、CN、CF3、OR20和N(R20)2取代，前提条件是当R2不为氢时，R4为氢，并且当R4不为氢时，R2为H。
2.权利要求1的化合物，其中R3选自下列组C1-15烷基、卤素、CF3、CN、OR20、SR20、S(O)2R22、SO2R22、SO2N(R20)2、COR20、CO2R20、-CONR7R8、芳基和杂芳基，其中烷基、芳基和杂芳基取代基可任选地由1-3个取代基取代的，所述取代基独立地选自下列组卤素、芳基、杂芳基、CF3、CN、OR20、SR20、S(O)R22、SO2R22、SO2N(R20)2、COR20、CO2R20或CON(R20)2，并且其中各可选的杂芳基和芳基取代基可任选地由卤素、烷基、CF3、CN和OR20取代；R5和R6各自独立地选自下列组氢和可任选地由一个芳基取代基取代的C1-15烷基，其中所述芳基取代基可任选地由卤素或CF3取代；R7选自下列组C1-15烷基、C2-15炔基、芳基和杂芳基，其中烷基、炔基、芳基和杂芳基取代基可任选地由1-3个取代基取代的，所述取代基独立地选自下列组卤素、芳基、杂芳基、CF3、CN、OR20，并且各可选的杂芳基和芳基可任选地由卤素、烷基、CF3、CN或OR20取代的；R8选自下列组氢和C1-15烷基；R20选自下列组H、C1-4烷基和芳基，其中烷基和芳基取代基可任选地由一个烷基取代基取代的；并且R22选自下列组C1-4烷基和芳基，其中烷基和芳基取代基可任选地由1-3个烷基取代。
3.权利要求1的化合物，其中R3选自下列组C1-15烷基、卤素、CF3、CN、OR20、CO2R20、-CONR7R8、芳基和杂芳基，其中烷基、芳基和杂芳基取代基可任选地由1-3个取代基取代的，所述取代基独立地选自下列组卤素、烷基、芳基、杂芳基、CF3、CN、OR20、CO2R20或CON(R20)2，并且其中各可选的杂芳基和芳基取代基可任选地由卤素、烷基、CF3、CN和OR20取代；R5和R6各自独立地选自氢和C1-6烷基；R7选自下列组C1-10烷基、芳基和杂芳基，其中烷基、炔基、芳基和杂芳基取代基可任选地由1-2个取代基取代的，所述取代基独立地选自下列组卤素、芳基、杂芳基、CF3、CN和OR20，并且各个可选的杂芳基和芳基取代基可任选地由卤素、烷基、CF3、CN和OR20取代；R8选自下列组氢和C1-15烷基；并且R20选自下列组氢和C1-4烷基。
4.权利要求1的化合物，其中R3选自下列组C1-10烷基、卤素、CF3、CN、CO2R20、-CONR7R8、芳基和杂芳基，其中烷基、芳基和杂芳基取代基可任选地由1-3个取代基取代，所述取代基独立地选自下列组卤素、烷基、CF3、CN、OR20和CON(R20)2；R5和R6各独立地选自氢和C1-6烷基；R7选自下列组C1-10烷基、芳基和杂芳基，其中烷基、炔基、芳基和杂芳基取代基可任选地由1-2个取代基取代的，所述取代基独立地选自下列组卤素、芳基、杂芳基、CF3、CN、OR20，并且各可选的杂芳基和芳基取代基可任选地由卤素、烷基、CF3、CN和OR20取代的；R8选自氢和C1-15烷基；并且R20选自氢和C1-4烷基。
5.权利要求1的化合物，其中R3选自下列组C1-10烷基、卤素、CF3、CN、OR20、CO2R20、-CONR7R8和芳基；其中烷基和芳基取代基可任选地由1-3个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、烷基、CF3、CN、OR20和CON(R20)2；R5和R6各自独立地选自氢和C1-6；R7选自下列组C1-10烷基、芳基和杂芳基，其中烷基、炔基、芳基和杂芳基取代基可任选地由1-2个取代基取代的，所述取代基独立地选自卤素、芳基、杂芳基、CF3、CN、OR20，并且各可选的杂芳基和芳基取代基可任选地由卤素、烷基、CF3、CN和OR20取代；R8选自下列组氢和C1-15烷基；并且R20选自氢和C1-4烷基。
6.权利要求1的化合物，其中R1＝CH2OH；R3选自下列组CO2R20、-CONR7R8和芳基，其中芳基取代基可任选地由1-3个取代基取代，所述取代基独立地选自下列组卤素、C1-6烷基、CF3、CN、OR20和CON(R20)2；R7选自下列组氢、C1-10烷基和芳基，其中烷基和芳基取代基可任选地由1-2个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、芳基、CF3、CN、OR20，并且各可选的芳基取代基可任选地由卤素、烷基、CF3、CN和OR20取代；R8选自下列组氢和C1-15烷基；并且R20选自氢和C1-4烷基。
7.权利要求1的化合物，其中R1＝CH2OH；R3选自下列组CO2R20、-CONR7R8和芳基，其中芳基取代基可任选地由1-2个取代基取代的，所述取代基独立地选自卤素、C1-6烷基、CF3和OR20R7选自下列组氢和C1-10烷基，其中烷基取代基可任选地由一个选自芳基、CF3、CN和OR20的取代基取代，并且其中各可选的芳基取代基可任选地由卤素、烷基、CF3、CN或OR20取代；R8选自氢和C1-8烷基；并且R20选自氢和C1-4烷基。
8.权利要求1的化合物，其中R1＝CH2OH；R3选自CO2R20、-CONR7R8和可任选地由1-2个取代基取代的芳基，所述取代基选自卤素、C1-3烷基、CF3和OR20；R7选自氢和C1-5烷基，其中烷基取代基可任选地芳基取代的，并且其中各可选的芳基取代基可任选地由卤素、烷基、CF3取代；R8选自氢和C1-3烷基；并且R20选自氢和C1-4烷基。
9.权利要求1的化合物，其中R1＝CH2OH；R3选自CO2R20、-CONR7R8和可任选地或由一个选自卤素、C1-3烷基和OR20的取代基取代的芳基；R7选自氢和C1-5烷基，其中烷基取代基可任选地由芳基取代，并且其中各可选的芳基取代基可任选地由卤素取代；R8为氢；并且R20选自氢和C1-4烷基。
10.权利要求1的化合物，其中R1＝CH2OH；R3选自CO2R20、-CONR7R8和可任选地由一个选自卤素、C1-3烷基和OR20的取代基取代的芳基；R7选自氢和C1-5烷基，其中烷基取代基可任选地由芳基取代的，并且其中各可选的芳基取代基可任选地由卤素取代的；R8为氢；并且R20选自氢和C1-4烷基。
11.权利要求10的化合物，其中R7为甲基。
12.权利要求10的化合物，其中R3为-CO2Et。
13.权利要求1的化合物，其中R1＝-CONHEt；R3选自CO2R20、-CONR7R8和芳基，其中芳基取代基可任选地由1-3个取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、C1-6烷基、CF3、CN、OR20和CON(R20)2；R7选自氢、C1-10烷基和芳基，其中烷基和芳基取代基可任选地由1-2个独立地选自卤素、芳基、CF3、CN和OR20的取代基取代的，并且其中各可选的芳基取代基可任选地由卤素、烷基、CF3、CN和OR20取代的；R8选自氢和C1-15烷基；并且R20选自氢和C1-4烷基。
14.权利要求1的化合物，其中R1＝-CONHEt；R3选自CO2R20、-CONR7R8和可任选地由1-2个独立地选自卤素、C1-6烷基、CF3和OR20的取代基取代的芳基；R7选自氢、C1-8烷基和芳基，其中烷基和芳基取代基可任选地由一个独立地选自卤素、芳基、CF3、CN、OR20的取代基取代的，并且其中各可选的芳基取代基可任选地由卤素、烷基、CF3、CN和OR20取代的；R8选自氢和C1-8烷基；并且R20选自氢和C1-4烷基。
15.权利要求1的化合物，其中R1＝-CONHEt；R3选自CO2R20、-CONR7R8和可任选地由1-2个独立地选自卤素、C1-3烷基、CF3和OR20取代的芳基；R7选自氢和C1-15烷基，其中烷基取代基可任选地由芳基取代的，并且其中各可选的芳基取代基可任选地由卤素、烷基、CF3取代的；R8选自氢和C1-3烷基；并且R20选自氢和C1-4烷基。
16.权利要求1的化合物，其中R1＝-CONHEt；R3选自CO2R20、-CONR7R8和可任选地由一个选自卤素、C1-3烷基和OR20取代的芳基；R7选自氢和C1-15烷基，其中烷基取代基可任选地由芳基取代，并且其中各可选的芳基取代基可任选地由卤素取代；R8为氢；并且R20选自氢和C1-4烷基。
17.权利要求1的化合物，其中R1＝-CONHEt；R3选自CO2R20、-CONR7R8和可任选地由一个选自卤素、C1-3烷基和OR20取代的芳基；R7选自氢和C1-3烷基；R8为氢；并且R20选自氢和C1-4烷基。
18.权利要求10的化合物，其中R1为-CONHEt。
19.权利要求1的化合物，其中所述化合物选自1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)oxolan-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-羧酸乙酯，(4S，2R，3R，5R)-2-{6-氨基-2-[4-(4-氯苯基)吡唑基]嘌呤-9-基}-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇，(4S，2R，3R，5R)-2-{6-氨基-2-[4-(4-甲氧基苯基)吡唑基]嘌呤-9-基}-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇，(4S，2R，3R，5R)-2-{6-氨基-2-[4-(4-甲基苯基)吡唑基]嘌呤-9-基}-5-(羟甲基)oxolane-3，4-二醇，(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)oxolan-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-甲基甲酰胺，1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)oxolan-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-羧酸，(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)oxolan-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N，N-二甲基甲酰胺，(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)oxolan-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-乙基甲酰胺，1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)oxolan-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基吡唑-4-甲酰胺，1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)oxolan-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基}-N-(环戊基甲基)甲酰胺，(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)oxolan-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)-N-[(4-氯苯基)甲基]甲酰胺，2-[(1-{9-[(4S，2R，3R，5R)-3，4-二羟基-5-(羟甲基)oxolan-2-基]-6-氨基嘌呤-2-基}吡唑-4-基)羰基氨基]乙酸乙酯及其混合物。
20.一种通过给予哺乳动物治疗有效量权利要求1化合物来刺激哺乳动物冠脉血管扩张以便于心脏显像的方法，其中所述剂量足以使心脏处于紧张状态并引起冠脉窃血现象。
21.权利要求20的方法，其中所述治疗有效量的范围大约为0.01-100mg/kg哺乳动物体重。
22.权利要求20的方法，其中所述哺乳动物为人。
23.一种包含权利要求1化合物和一种或多种药用赋形剂的药物组合物。
24.权利要求23的药物组合物，其中所述药物组合物是以溶液剂形式存在的。
25.权利要求23的药物组合物，其中所述组合物在血管成形术辅助治疗中用作抗炎剂、血小板聚集抑制剂以及血小板和嗜中性白细胞激活抑制剂。
全文摘要
具有通式(1)结构的2－腺苷N－吡唑化合物,及用于治疗和心脏显像为目的的,利用本发明化合物作为A
文档编号A61P43/00GK1358191SQ00809459
公开日2002年7月10日 申请日期2000年6月21日 优先权日1999年6月22日
发明者杰夫·A·扎布沃茨基, 埃费提·O·埃尔策英, 文卡塔·P·帕列 申请人:Cv治疗公司