一种结构尺寸可调节的水凝胶及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医药材料领域，具体涉及一种结构尺寸可调节的水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术：

水凝胶是以水为分散介质的凝胶，是具有网状交联结构的水溶性高分子中引入一部分疏水基团和亲水残基，亲水残基与水分子结合，将水分子连接在网状内部，而疏水残基遇水膨胀的交联聚合物，是一种高分子网络体系，性质柔软，能保持一定的形状，能吸收大量的水。

生物体内许多组织具有水凝胶结构，生物组织由细胞和细胞外基质组成，而细胞外基质成分蛋白、多糖等构成类水凝胶结构。因此，从仿生学的角度出发，创建多糖、蛋白质或多肽水凝胶具有极其重要的生物学意义。随着研究的深入，水凝胶作为一种有效的多功能生物医学材料，在医学领域发挥出越来越大的作用，但是真正应用于临床的水凝胶并不多。水凝胶作为一种生物医学材料，其成分、结构、以及与种子细胞的相互作用对水凝胶功效的发挥十分重要。

中国专利申请cn101588790a公开了一种超多孔水凝胶，该水凝胶是通过选择疏水/亲水反应活性成分和通过协调发泡和聚合反应进行制备，获得的多孔水凝胶具有均匀的结构和有利的屋里和机械性能，包括溶胀、强度、坚固性和回弹性。虽然该水凝胶具有超多孔结构，但是其结构孔径尺寸无法精确控制且操作复杂。

中国专利cn106009709b公开了一种互穿网络结构丝素蛋白水凝胶及其制备方法，该方法，通过辣根过氧化物酶催化n-乙烯基吡咯烷酮单体发生聚合反应，生成聚乙烯吡咯烷酮并与丝素蛋白大分子发生分子链缠结，形成以无规卷曲结构为主的互穿网络(ipn)水凝胶。该发明提供的丝素蛋白水凝胶具有高强度、弹性和透明度的特性，但是其结构尺寸不可控，无法根据具体实验需求获得相应尺寸的水凝胶。

正是因为水凝胶的三维结构才使得水凝胶受到广泛关注，但是目前现有的水凝胶其结构尺寸一般不可控，作为组织修复材料无法完全适应种子细胞的生长。

技术实现要素：

针对以上问题，本发明提供了一种结构尺寸可调节的水凝胶及其制备方法和应用。本发明提供的一种结构尺寸可调节的水凝胶能够根据实验的需要进行不同尺寸的调节，构建出具有不同结构尺寸的水凝胶体系，并且该水凝胶可以结合各种生长因子及不同药物从而获得特定功能，并能在此基础上结合相应种子细胞，构建出一种适应种子细胞生长的具有组织修复功能的水凝胶材料。

本发明通过以下技术方案实现。

一种结构尺寸可调节的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

s1将明胶溶于水中得明胶溶液，再加入乙酸乙酯，搅拌，得明胶/乙酸乙酯均匀乳液；

s2向步骤s1所得明胶/乙酸乙酯均匀乳液中加入食用橄榄油，搅拌，然后置于冰水浴中搅拌，得油化乳液；

s3将无水乙醇冷冻，得冷冻无水乙醇；

s4将步骤s2所得油化乳液倒入步骤s3所得冷冻无水乙醇中冷却，洗涤，清除橄榄油，得去油乳液；

s5将步骤s4所得去油乳液干燥、过筛，过筛尺寸为60-500微米，得明胶微球；

s6将步骤s5所得明胶微球加入浸泡液中浸泡，得载药明胶微球；

s7将步骤s6所得载药明胶微球和水凝胶溶液混合，即得一种结构尺寸可调节的水凝胶；所述明胶微球与水凝胶溶液的质量体积比为5-25μg/ml。

进一步地，所述步骤s1中所述明胶溶液的浓度为10％，所述明胶溶液与乙酸乙酯的体积比为3-15：2；所述搅拌的转速为300-550r/min，时间为1-5min。

进一步地，所述步骤s2中，所述搅拌的转速为200-1200r/min，时间为1-5min；浸泡在冰水时搅拌的转速为500-850r/min，时间为5-20min；所述食用橄榄油与明胶/乙酸乙酯均匀乳液的体积比为1-3：1。

进一步地，所述步骤s4中所述冷却的时间为5-15分钟，所述油化乳液与冷冻无水乙醇的体积比为3：8-13；所述洗涤是用丙酮、二氧六环、异丙醇的混合溶液洗涤3-6次；所述丙酮、二氧六环、异丙醇的体积比为2-5：1-3：1-3。

进一步地，所述步骤s6中所述浸泡液为表皮生长因子溶液、成纤细胞生长因子溶液、血小板类生长因子溶液、骨肉瘤来源生长因子溶液、转化生长因子溶液、成纤维细胞生长因子溶液、类胰岛素生长因子溶液、神经生长因子溶液、白细胞介素类生长因子溶液、红细胞生长素溶液、集落刺激因子溶液、紫杉醇溶液和大蒜素溶液中的一种或几种；所述明胶微球与浸泡液的质量体积比为1：20-40，所述浸泡的时间为30-180分钟。

进一步地，所述步骤s7中所述水凝胶溶液为基质胶、胶原、岩藻聚糖、海藻酸钠和透明质酸溶液中的一种。

本发明的另一目的在于利用一种结构尺寸可调节的水凝胶的制备方法制得一种结构尺寸可调节的水凝胶。

本发明的再一目的在于一种结构尺寸可调节的水凝胶在构建复合凝胶材料中的应用，其特征在于，所述水凝胶结合种子细胞构建得到所述复合凝胶材料。

进一步地，所述种子细胞为内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞、软骨细胞、脂肪干细胞、间充质干细胞和胚胎干细胞中的一种或几种。

进一步地，所述复合凝胶材料用于组织工程修复材料。

本发明中通过制备不同尺寸的明胶微球，然后将明胶微球混合到水凝胶中，当明胶微球降解后就会在原来的位置形成相应尺寸的孔洞，因此，只要调节明胶微球的尺寸后加到水凝胶中就可以对水凝胶的结构尺寸实现有效的控制。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明提供的水凝胶结构尺寸可调，能根据不同的试验需要设计成不同的结构尺寸，能很好的解决传统材料构建的水凝胶三维结构不可控的不足。

2、本发明提供的水凝胶能有效结合生长因子从而使凝胶的性能更贴近细胞基质，使相应功能的细胞能更好的在凝胶内部生长，从而更加有利于受损组织的修复。

3、本发明提供的水凝胶能有效结合各种药物，从而使凝胶起到增强药效的作用。

附图说明

图1为实施例1制得的水凝胶的扫描电镜图；

图2为实施例2制得的水凝胶的扫描电镜图；

图3为实施例3制得的水凝胶的扫描电镜图；

图4为实施例4制得的水凝胶的扫描电镜图。

具体实施方式

为了更好理解本发明的实质，以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

实施例1一种结构尺寸可调节的水凝胶的制备

一种结构尺寸可调节的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

s1将0.9g明胶溶于9ml去离子水中，加热至70℃使明胶溶解得质量体积百分比(g/ml)为10％的明胶溶液，将所述明胶溶液倒入装有乙酸乙酯的烧杯中，设定转速为300r/min，搅拌5min，得明胶/乙酸乙酯均匀乳液，其中明胶溶液与乙酸乙酯的体积比为3：2；

s2将步骤s1所得明胶/乙酸乙酯均匀乳液倒入装有食用橄榄油的烧杯中，设定转速为200r/min，搅拌5min，然后将整个烧杯浸泡在冰水中，设定转速为500r/min，搅拌20min后，得油化乳液，其中食用橄榄油与明胶/乙酸乙酯均匀乳液的体积比为1：1；

s3将无水乙醇倒入烧杯中，于-20℃冷冻，得冷冻无水乙醇；

s4将步骤s2所得油化乳液倒入步骤s3所得冷冻无水乙醇中冷却5分钟，所述油化乳液与冷冻无水乙醇的体积比为3：8，用丙酮、二氧六环、异丙醇的混合溶液洗涤3次，清除橄榄油，得去油乳液，其中丙酮、二氧六环、异丙醇的体积比为2：3：1；

s5将步骤s4所得去油乳液于60℃下真空干燥4小时后，将干燥后的明胶颗粒过筛、收集，得明胶微球，其中过筛尺寸为500微米；

s6将步骤s5所得明胶微球加入用pbs稀释的浓度为100ng/ml的表皮生长因子溶液中浸泡30分钟，明胶微球与表皮生长因子溶液的质量体积比(g/ml)为1：40，得载药明胶微球；

s7取步骤s6所得载药明胶微球和10ml以去离子水为溶剂的质量体积百分比(g/ml)为3％的海藻酸钠溶液混合，即得一种结构尺寸可调节的水凝胶，其中载药明胶微球与海藻酸钠溶液的质量体积比为5μg/ml。

实施例2一种结构尺寸可调节的水凝胶的制备

一种结构尺寸可调节的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

s1将3g明胶溶于30ml去离子水中，加热至70℃使明胶溶解得质量体积百分比(g/ml)为10％的明胶溶液，将所述明胶溶液倒入装有乙酸乙酯的烧杯中，设定转速为400r/min，搅拌1min，得明胶/乙酸乙酯均匀乳液，其中明胶溶液与乙酸乙酯的体积比为15：2；

s2将步骤s1所得明胶/乙酸乙酯均匀乳液倒入装有食用橄榄油的烧杯中，设定转速为1200r/min，搅拌1min，然后将整个烧杯浸泡在冰水中，设定转速为600r/min，搅拌5min后，得油化乳液，其中食用橄榄油与明胶/乙酸乙酯均匀乳液的体积比为3：1；

s3将无水乙醇倒入烧杯中，于-20℃冷冻，得冷冻无水乙醇；

s4将步骤s2所得油化乳液倒入s3所得冷冻无水乙醇中冷却15分钟，所述油化乳液与冷冻无水乙醇的体积比为3：13，用丙酮、二氧六环、异丙醇的混合溶液洗涤6次，清除橄榄油，得去油乳液，其中丙酮、二氧六环、异丙醇的体积比为5：1：1；

s5将步骤s4所得去油乳液于60℃下真空干燥28小时后将干燥后的明胶颗粒过筛、收集，得明胶微球，其中过筛尺寸为20微米；

s6将步骤s5所得明胶微球加入用pbs稀释的浓度为100ng/ml的成纤细胞生长因子溶液中浸泡180分钟，明胶微球与成纤细胞生长因子溶液的质量体积比(g/ml)为1：20，得载药明胶微球；

s7取步骤s6所得载药明胶微球和10ml以去离子水为溶剂的质量体积百分比(g/ml)为3％的透明质酸溶液混合，即得一种结构尺寸可调节的水凝胶，其中明胶微球与透明质酸溶液的质量体积比为25μg/ml。

实施例3一种结构尺寸可调节的水凝胶的制备

一种结构尺寸可调节的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

s1将1.2g明胶溶于12ml去离子水中，加热至70℃使明胶溶解得质量体积百分比(g/ml)为10％的明胶溶液，将所述明胶溶液倒入装有乙酸乙酯的烧杯中，设定转速为500r/min，搅拌3min，得明胶/乙酸乙酯均匀乳液，其中明胶溶液与乙酸乙酯的体积比为12：2；

s2将步骤s1所得明胶/乙酸乙酯均匀乳液倒入装有食用橄榄油的烧杯中，设定转速为900r/min，搅拌3min，然后将整个烧杯浸泡在冰水中，设定转速为700r/min，搅拌15min后，得油化乳液，其中食用橄榄油与明胶/乙酸乙酯均匀乳液的体积比为2：1；

s3将无水乙醇倒入烧杯中，于-20℃冷冻，得冷冻无水乙醇；

s4将步骤s2所得油化乳液倒入s3所得冷冻无水乙醇中冷却10分钟，所述所述油化乳液与冷冻无水乙醇的体积比为3：10，用丙酮、二氧六环、异丙醇的混合溶液洗涤5次，清除橄榄油，得去油乳液，其中丙酮、二氧六环、异丙醇的体积比为5：2：2；

s5将步骤s4所得去油乳液于60℃下真空干燥8小时后将干燥后的明胶颗粒过筛、收集，得明胶微球，其中过筛尺寸为70微米；

s6将步骤s5所得明胶微球加入用pbs稀释的浓度为100ng/ml的基质细胞衍生因子-1溶液中浸泡90分钟，所述明胶微球与基质细胞衍生因子-1的质量体积比(g/ml)为1：25，得载药明胶微球；

s7取步骤s6所得载药明胶微球和10ml以去离子水为溶剂的质量体积百分比(g/ml)为3％的基质胶溶液混合，即得一种结构尺寸可调节的水凝胶，其中明胶微球与基质胶溶液的质量体积比为15μg/ml。

实施例4一种结构尺寸可调节的水凝胶的制备

一种结构尺寸可调节的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

s1将1.6g明胶溶于16ml去离子水中，加热至70℃使明胶溶解得质量体积百分比(g/ml)为10％的明胶溶液，将所述明胶溶液倒入装有乙酸乙酯的烧杯中，设定转速为550r/min，搅拌3min，得明胶/乙酸乙酯均匀乳液，其中明胶溶液与乙酸乙酯的体积比为8：2；

s2将步骤s1所得明胶/乙酸乙酯均匀乳液倒入装有食用橄榄油的烧杯中，设定转速为600r/min，搅拌3min，然后将整个烧杯浸泡在冰水中，设定转速为850r/min，搅拌10min后，得油化乳液，其中食用橄榄油与明胶/乙酸乙酯均匀乳液的体积比为1.5：1；

s3将无水乙醇倒入烧杯中，于-20℃冷冻，得冷冻无水乙醇；

s4将步骤s2所得油化乳液倒入s3所得冷冻无水乙醇中冷却8分钟，所述油化乳液与冷冻无水乙醇的体积比为3：10，用丙酮、二氧六环、异丙醇的混合溶液洗涤4次，清除橄榄油，得去油乳液，其中丙酮、二氧六环、异丙醇的体积比为2：1：2；

s5将步骤s4所得去油乳液于60℃下真空干燥12小时后将干燥后的明胶颗粒过筛、收集，得明胶微球，其中过筛尺寸为250微米；

s6将步骤s5所得明胶微球加入用pbs稀释的浓度为100ng/ml的紫杉醇溶液中浸泡60分钟，所述明胶微球与紫杉醇溶液的质量体积比(g/ml)为1：25，得载药明胶微球；

s7取步骤s6所得载药明胶微球和10ml以去离子水为溶剂的质量体积百分比(g/ml)为3％的海藻酸钠溶液混合，即得一种结构尺寸可调节的水凝胶，其中明胶微球与海藻酸钠溶液的质量体积比为15μg/ml。

实施例5结构尺寸可调节的水凝胶的结构分析

将实施例1、实施例2、实施例3和实施例4制备的水凝胶冷冻干燥后进行电镜扫描，其结果如图1-4所示。

从图1-4中可以看出实施例1-4所制备的结构尺寸可调节的水凝胶的尺寸各不相同，说明加入不同的明胶微球后可以是水凝胶形成不同的尺寸孔径。

试验例一复合凝胶材料细胞增殖性能检测

1、实验材料：实施例1、实施例2、实施例3和实施例4制备的水凝胶以及实施例1、实施例2、实施例3和实施例4中的水凝胶溶液。

2、实验方法：将实施例1、实施例2和实施例3制备的水凝胶以及实施例1、实施例2、实施例3和实施例4中的水凝胶溶液分别滴加到48孔板内，并接种内皮细胞，实验分组设为实施例1组、对照1组、实施例2组、对照2组、实施例3组和对照3组空白孔板设为空白对照组，置于37℃恒温细胞培养箱中培1、3天，mtt实验检测其细胞活性。

3、试验结果：内皮细胞mtt检测结果如表1所示。

表1

从表1结果可以看出，将内皮细胞接种在各实施例中所得的单一水凝胶溶液中时，与对应实施例相比细胞的增殖非常缓慢，由此可以看出实施例制得的水凝胶能促进细胞的增殖。传统的水凝胶是三维环境，所以细胞在凝胶中的增殖会相对缓慢，与空白对照组相比，各实施例组细胞增殖活性高于空白组，可以说明本发明制得的水凝胶能显著地促进细胞增殖的功效，且实施例3组内皮细胞增殖效果最明显。

试验例二复合凝胶材料药物应用性能检测

1、实验材料：实施例4中的水凝胶溶液。

2、实验方法：将实施例4制备的水凝胶和实施例4中的水凝胶溶液、和紫杉醇溶液和生理盐水分别滴加到48孔板中并接种hela细胞，实验设为实施例4组、对比例4组、紫杉醇组和空白组。置于37℃恒温细胞培养箱中培养1、3天，mtt实验检测其细胞活性。

3、实验结果：hela细胞mtt检测结果如表2所示。

表2

从表2的结果可以看出，将hela细胞接种在实施例4制得的水凝胶中时在第3天细胞增殖活性与其他3组相比明显下降，在实施例4组与紫杉醇组相比时可以看到，将紫杉醇加到节构尺寸可以调节的水凝胶中时其对hela细胞的抑制效果明显增加，实施例4组能有效抑制hela细胞的增殖，因此说明复合凝胶材料能提高药物的应用效果。

以上两组实验充分说明该发明制备的水凝胶能够根据特定实验需要来发挥其功效。