本发明涉及组织工程
技术领域：
，具体涉及一种负载细胞生长因子的电纺纤维支架及其制备方法。
背景技术：
：组织工程概念的出现，为解决组织、器官的修复与功能重建问题提供了新的思路。组织工程通常将细胞种植在由生物材料制备的组织工程支架上，通过体外培养制备活性的组织替代物，之后植入体内进行受损、病变组织或器官的修复。组织工程支架的传统制备方法有相分离法、冷冻干燥法、溶剂浇筑/致孔剂法、乳化/冻干法和纤维电纺技术等。然而，采用组织工程方法对体内进行受损、病变组织或器官的修复过程中，各种生长因子对局部组织、细胞的调控起到至关重要的作用；生长因子的作用是传输信号，刺激或抑制细胞增殖分化；目前，运输生长因子的方法，在很多情况下效果不甚理想，因为它们会迅速地从目标位置扩散并且容易被酶消化或失活。此外，生长因子通常是浓度依赖性而起作用，并且其分子量较大，会导致全身系统的潜在毒性。如果直接将生物活性物质分散在高分子溶液中电纺，可以将生物活性物质纺入纤维中，但这种方法会导致严重的突释并降低有效寿命。技术实现要素：本发明实施例的第一目的在于提供一种负载细胞生长因子的电纺纤维支架，用以解决现有生长因子扩散过快易被酶消化或失活的问题，以及由于细胞生长因子突释导致组织工程支架有效寿命降低的问题。本发明实施例的第二目的在于提供一种负载细胞生长因子的电纺纤维支架的制备方法，该制备方法操作简单、方便快捷。为实现上述目的，本发明实施例提供一种负载细胞生长因子的电纺纤维支架的制备方法，该制备方法包括如下步骤：(a)将电纺纤维支架依次分别置入聚烯丙基氯化铵溶液和肝素钠溶液中进行浸泡处理；(b)再将电纺纤维支架依次置入聚赖氨酸溶液和肝素钠溶液中分别进行浸泡处理；(c)重复步骤(b)操作，随后，将电纺纤维支架置入细胞生长因子溶液中负载细胞生长因子，得到负载细胞生长因子的电纺纤维支架。本发明通过对电纺纤维支架置入聚烯丙基氯化铵溶液中进行浸泡处理，能够提高电纺纤维的表面亲水性，并使之带正电荷，能够与肝素钠溶液中的阴离子进行结合，进而与聚赖氨酸溶液中的阳离子进行结合，再在聚赖氨酸表面组装一层肝素钠后，通过细胞生长因子与肝素钠的结合将细胞生长因子负载在电纺纤维支架表面，同时能够实现对细胞生长因子的持续释放，进而提高组织工程支架的有效寿命，此外，本发明通过对电纺纤维支架表面沉积肝素钠，提高了电纺纤维支架表面的抗凝血性能，进而促进组织的修复。进一步地，所述步骤(c)中，重复步骤(b)操作的次数为0-5次。进一步地，本发明中对电纺纤维支架的制备方法不做严格限制，例如可以通过本领域常规方法制备得到。进一步地，本发明中对细胞生长因子的种类不做严格限制，优选地，所述细胞生长因子选自碱性纤维生长因子、重组人骨成型蛋白、血管内皮生长因子和转化生长因子β中的任意一种或多种。进一步地，所述步骤(b)中还包括：在浸泡处理前，将电纺纤维支架置入聚赖氨酸溶液中进行浸泡，然后，在电纺纤维支架表面沉积一层碳纳米材料；优选地，所述碳纳米材料的沉积方法可以为静电作用下的自动沉积，更优选地，所述碳纳米材料为石墨烯或碳纳米管，并且尺寸为5-10nm。通过碳纳米材料的沉积能够提高电纺纤维支架表面薄膜的弹性模量和硬度，薄膜机械强度的提高有助于匹配目标组织的强度，更有利于组织的再生和修复。进一步地，本发明所述制备方法还包括：重复步骤(b)和(c)操作，得到负载多层细胞生长因子的电纺纤维支架；优选地，重复次数为至少1次。通过上述步骤的添加，能够使电纺纤维支架负载多种细胞生长因子，并且能够根据细胞生长因子的负载顺序实现对不同细胞生长因子释放量的控制，能够更好地促进细胞因子之间的协同作用，达到更快的组织修复效果。进一步地，所述步骤(a)中，聚烯丙基氯化铵溶液浓度为2.5-3.5mg/ml；肝素钠溶液浓度为3-4mg/ml；浸泡处理时间3-6h。进一步地，所述步骤(b)中，聚赖氨酸溶液和肝素钠溶液浓度分别为3-4mg/ml；浸泡处理时间为1-2h；通过选定的溶液浓度和浸泡时间的限定能够更大限度地固定聚赖氨酸和肝素钠。进一步地，所述步骤(c)中，细胞生长因子浓度为90-110ng/ml；负载时间为6-7h。本发明通过对各步骤中参数的设置能够保证各物质沉积的均匀性，利于提高细胞生长因子的释放稳定性。进一步地，所述电纺纤维支架材质为聚乳酸。本发明另一实施例提供一种负载细胞生长因子的电纺纤维支架，该负载细胞生长因子的电纺纤维支架由上述制备方法制备得到。该负载细胞生长因子的电放纤维支架能够促进细胞向特定细胞系分化，并且能够负载多种不同细胞生长因子，而且能够根据细胞生长因子的负载顺序实现对不同细胞生长因子释放量的控制。本发明实施例具有如下优点：(1)本发明负载细胞生长因子的电放纤维支架能够促进细胞向特定细胞系分化，并且能够负载多种不同细胞生长因子，而且能够根据细胞生长因子的负载顺序实现对不同细胞生长因子释放量的控制。(2)本发明负载细胞生长因子的电放纤维支架的制备方法操作简单，方便快捷，通过对各步骤中参数的设置能够保证各物质沉积的均匀性，提高细胞生长因子的释放稳定性。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。以下各实施例中采用的电纺纤维支架材质为聚乳酸。实施例1本实施例为一种负载细胞生长因子的电纺纤维支架的制备方法，该制备方法包括如下步骤：(a)将电纺纤维支架依次分别置入浓度为3mg/ml聚烯丙基氯化铵溶液和浓度为3.5mg/ml肝素钠溶液中进行浸泡5h；(b)将电纺纤维支架依次置入浓度为3.5mg/ml的聚赖氨酸溶液和浓度为3.5mg/ml的肝素钠溶液中分别浸泡处理1h；(c)将电纺纤维支架置入浓度为100ng/ml的bmp-2溶液中浸泡6h，得到负载bmp-2的电纺纤维支架。实施例2本实施例为一种负载细胞生长因子的电纺纤维支架的制备方法，该制备方法包括如下步骤：(a)将电纺纤维支架依次分别置入浓度为3mg/ml聚烯丙基氯化铵溶液和浓度为3.5mg/ml肝素钠溶液中进行浸泡5h；(b)将电纺纤维支架置入浓度为3.5mg/ml的聚赖氨酸溶液中浸泡1h，然后在电纺纤维支架表面采用自沉积方法沉积一层粒径为5-10nm的石墨烯，再将电纺纤维支架依次置入浓度为3.5mg/ml的聚赖氨酸溶液和浓度为3.5mg/ml的肝素钠溶液中分别浸泡处理1h；(c)重复步骤(b)操作3次，随后，将电纺纤维支架置入浓度为100ng/ml的bmp-2溶液中浸泡6h，得到负载bmp-2的电纺纤维支架。实施例3本实施例为一种负载细胞生长因子的电纺纤维支架的制备方法，该制备方法包括如下步骤：(a)将电纺纤维支架依次分别置入浓度为3mg/ml聚烯丙基氯化铵溶液和浓度为3.5mg/ml肝素钠溶液中进行浸泡5h；(b)将电纺纤维支架置入浓度为3.5mg/ml的聚赖氨酸溶液中浸泡1h，然后在电纺纤维支架表面采用自沉积方法沉积一层粒径为5-10nm的碳纳米管，再将电纺纤维支架依次置入浓度为3.5mg/ml的聚赖氨酸溶液和浓度为3.5mg/ml的肝素钠溶液中分别浸泡处理1h；(c)重复步骤(b)操作3次，随后，将电纺纤维支架置入浓度为100ng/ml的bmp-2溶液中浸泡6h；(d)将电纺纤维支架置入浓度为3.5mg/ml的聚赖氨酸溶液中浸泡1h，然后在电纺纤维支架表面采用自沉积方法沉积一层粒径为5-10nm的碳纳米管，再将电纺纤维支架依次置入浓度为3.5mg/ml的聚赖氨酸溶液和浓度为3.5mg/ml的肝素钠溶液中分别浸泡处理1h；(e)重复步骤(b)操作3次，随后，将电纺纤维支架置入浓度为100ng/ml的bfgf溶液中浸泡6h，得到负载bmp-2和bfgf的电纺纤维支架。实施例4本实施例为一种负载细胞生长因子的电纺纤维支架的制备方法，该制备方法包括如下步骤：(a)将电纺纤维支架依次分别置入浓度为2.5mg/ml聚烯丙基氯化铵溶液和浓度为3mg/ml肝素钠溶液中进行浸泡6h；(b)将电纺纤维支架置入浓度为3mg/ml的聚赖氨酸溶液中浸泡2h，然后在电纺纤维支架表面采用自沉积方法沉积一层粒径为5-10nm的石墨烯，再将电纺纤维支架依次置入浓度为3mg/ml的聚赖氨酸溶液和浓度为3mg/ml的肝素钠溶液中分别浸泡处理2h；(c)重复步骤(b)操作5次，随后，将电纺纤维支架置入浓度为110ng/ml的bmp-2溶液中浸泡6h；(d)将电纺纤维支架置入浓度为3mg/ml的聚赖氨酸溶液中浸泡2h，然后在电纺纤维支架表面采用自沉积方法沉积一层粒径为5-10nm的石墨烯，再将电纺纤维支架依次置入浓度为3mg/ml的聚赖氨酸溶液和浓度为3mg/ml的肝素钠溶液中分别浸泡处理2h；(e)重复步骤(b)操作5次，随后，将电纺纤维支架置入浓度为110ng/ml的bfgf溶液中浸泡6h，得到负载bmp-2和bfgf的电纺纤维支架。实验例1选取实施例1-4分别制备得到的负载细胞生长因子的电纺纤维支架，并将聚乳酸纤维支架作为对照组；通过纳米压痕技术，分别对实施例1-4制备得到的负载细胞生长因子的电纺纤维支架、聚乳酸纤维支架表面进行力学性能检测，得到检测结果如表1所示；采用活化部分凝血活酶时间测试aptt方法，分别对实施例1-4制备得到的负载细胞生长因子的电纺纤维支架、聚乳酸纤维支架表面进行抗凝血时间检测，检测结果如表1所示；表1组别弹性模量(gpa)硬度(mpa)aptt值(s)实施例10.53977实施例27.15073实施例311.99375实施例412.19178聚乳酸纤维支架3.47325由表1可知：经过掺杂纳米材料在聚合物薄膜中，体系的机械强度明显提高，并且，通过肝素钠的复合，薄膜的抗凝血性能得到改善。实验例2选取实施例1-4分别制备得到的负载细胞生长因子的电纺纤维支架；将选取的电纺纤维支架采用pbs溶液进行清洗，然后将各电纺纤维支架分别置于相同的正常细胞培养基中，选用免疫分析试剂盒和荧光免疫分析仪测定不同培养时间各细胞培养基中的细胞生长因子的释放量，实验重复5次，并计算平均值；检测结果如表2所示：表2组别12h2d5d10d20d实施例171.9％72.9％73.9％73.7％74.5％实施例274.1％74.9％75.7％76.1％76.7％实施例355.3％56.4％54.7％55.8％55.4％实施例453.1％53.9％51.9％54.2％54.9％注：实例3和4中含两种生长因子，上述测定方法只能检测生长因子浓度，不能区分两种生长因子，所得的结果为两者之和。由表2可知：实施例1、2体系中生长因子在12小时内都已经释放达到平衡，最大释放率均在75％左右，彼此间并未有很大差别，然而实施例3、4体系中生长因子在12h内已经释放达到平衡，但由于内层中的生长因子释放量减少，导致整体生长因子释放量的降低，此外，说明了本申请通过设置生长因子在表层或内层的位置能够实现不同生长因子释放量的控制。实验例3选取实施例1-4分别制备得到的负载细胞生长因子的电纺纤维支架，以及聚乳酸电纺纤维支架；将大鼠骨髓间质干细胞(购买于天津卫凯生物工程有限公司)以5000cells/cm2接种，细胞密度达到70-80％时传代，以第四代细胞进行试验；一、将大鼠骨髓间质干细胞(20,000cells/well，24孔板)接种于实施例1-4分别制备得到的负载细胞生长因子的电纺纤维支架以及聚乳酸电纺纤维支架上，其中以聚乳酸电纺纤维支架作为阴性对照，在相同条件下，在不同的时间采用细胞计数试剂盒对细胞活性进行检测；检测结果如表3所示；表3组别1天5天10天15天实施例1113％117％108％121％实施例2110％102％120％117％实施例3103％119％123％114％实施例4109％122％120％123％阴性对照100％100％100％100％由表3可知：各体系中细胞活性良好，说明体系对细胞没有毒性，能够促进细胞生长和增殖。二、将大鼠骨髓间质干细胞(20,000cells/well，24孔板)接种于实施例1-4分别制备得到的负载细胞生长因子的电纺纤维支架以及聚乳酸电纺纤维支架上，其中以聚乳酸电纺纤维支架作为阴性对照，在相同条件下，24h后，将正常培养基替换为常规的成骨培养基，并且每三天更换一次；采用bcip/nbt碱性磷酸酯酶显色试剂盒对在培养1、3、7、10天时以及不同表面上mscs所表达的碱性磷酸酶alp分别进行染色，并用alp分析试剂盒(abcam,hongkong)对其进行了定量检测；检测结果如表4所示：表4由表4可知：相对于对照体系，含生长因子的体系中都明显表达了alp，而含两种生长因子(实例3和4)的薄膜对细胞分化的作用更明显，表明两种生长因子能够协同诱导促进了细胞分化。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。当前第1页12