礁膜寡二糖与礁膜寡二糖衍生物在抗结直肠癌中的应用的制作方法

本发明属于生物技术药物技术领域，具体涉及礁膜寡二糖与礁膜寡二糖衍生物在抗结直肠癌中的应用，尤其涉及将礁膜寡二糖应用于靶向cox-2抗结直肠癌药物和功能食品、以及将礁膜寡二糖衍生物应用于靶向cox-2抗结直肠癌药物和功能食品。

背景技术：

近年来，各种恶性肿瘤频发，一直以来，恶性肿瘤都是医学界的难点，其中，以结直肠癌、乳腺癌、肺癌等较多。因此，医学界也是一直致力于各种恶性肿瘤的攻克。

以结直肠癌为例，全球每年约有125万人被诊断为结直肠癌，并有超过60万人死于该疾病。结直肠癌的标准治疗方式包括手术切除、放射治疗和以氟吡嘧啶、奥沙利铂和伊利替康为主的化疗。尽管在癌症治疗方面取得了进步，但其5年生存率仍为60％。因此，仍需其他的辅助途径来控制结直肠癌的发展。近期研究表明，环氧合酶-2(cox-2)过度表达在肿瘤的发生发展中具有关键作用，特别是结直肠癌中更为明显。非选择性和选择性cox-2抑制剂(如塞来昔布等)降低结直肠腺瘤复发风险的功效在多个研究中得到证实。作为cox-2抑制剂，nsaids临床癌症研究的重点最初是化学预防，但随着临床实验数据的不断完善，nsaids药物及特异性cox-2抑制剂(例如阿司匹林，舒林酸，布洛芬，塞来昔布，萘普生和尼美舒利等)在癌症中的潜在治疗用途也逐渐得到了相当多的关注。因此，从天然产物中寻找新型cox-2抑制剂来治疗结直肠癌是近期研究的热点。

不同来源的海藻酸盐及其衍生物有多种生物和药用作用，如神经保护作用、抗炎作用、免疫刺激作用、抗癌作用和抗氧化作用等。海藻酸盐也因其稳定性、生物降解性和低毒性而广泛应用于食品、制药、化妆品和纺织业。目前文献报道最多的是褐藻多糖及寡糖领域的研究，对于绿藻，因其结果更为复杂，研究主要集中于多糖的结构解析和活性探索，其寡糖的研究鲜有报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供礁膜寡二糖在抗结直肠癌中的应用，可以抑制cox-2的酶活力，并杀伤结肠癌细胞，用以治疗结直肠癌。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的一方面提供礁膜寡二糖在抗结直肠癌中的应用，将所述礁膜寡二糖用以治疗结直肠癌。

本发明的又一方面提供礁膜寡二糖衍生物在抗结直肠癌中的应用，将所述礁膜寡二糖衍生物用以治疗结直肠癌。

作为本发明进一步的改进方案，将所述礁膜寡二糖或者所述礁膜寡二糖衍生物应用于抗结直肠癌的药物，或者将所述礁膜寡二糖或者所述礁膜寡二糖衍生物应用于抗结直肠癌的功能食品。

具体的，将所述礁膜寡二糖应用于抗结直肠癌的药物或者抗结直肠癌的功能食品，和/或，将所述礁膜寡二糖衍生物应用于抗结直肠癌的药物或者抗结直肠癌的功能食品。

作为本发明进一步的改进方案，所述礁膜寡二糖通过靶向抑制cox-2的酶活力，并杀伤结肠癌细胞，用以治疗结直肠癌。

作为本发明进一步的改进方案，所述礁膜寡二糖的分子骨架为葡萄糖醛酸(gia)通过β-1，3糖苷键与鼠李糖(rha)键连接形成，所述礁膜寡二糖的分子量为340.28da。

作为本发明进一步的改进方案，所述礁膜寡二糖分子结构通式如下：

作为本发明进一步的改进方案，所述礁膜寡二糖衍生物包括：以包含礁膜寡二糖为母核的硫酸化衍生物、以包含礁膜寡二糖为母核的磷酸化衍生物，以及以包含礁膜寡二糖为母核的乙酰化衍生物。

本发明的另一方面提供礁膜寡二糖的制备方法，具体包括如下步骤：

将绿藻溶于水，得到绿藻水溶液；

往绿藻水溶液中添加稀硫酸，加热，并搅拌，使所述绿藻进行化学降解，得到降解液；

将所述降解液置于透析袋中透析，并过夜，得到透析液；

将所述透析液浓缩，再经过超滤膜，得到寡糖；

将所述寡糖经浓缩、分离纯化，得到洗脱液；

检测所述洗脱液的糖含量，并绘制洗脱曲线，收集峰尖部分，冻干，得到所述礁膜寡二糖。

作为本发明进一步的改进方案，所述洗脱液采用苯酚-硫酸法检测其糖含量。

作为本发明进一步的改进方案，所述浓缩步骤采用旋转仪进行浓缩；

所述超滤膜采用1000da的超滤膜。

本发明的有益效果在于：

1、本发明提供礁膜寡二糖与礁膜寡二糖衍生物在抗结直肠癌中的应用，将礁膜寡二糖或者礁膜寡二糖衍生物用以治疗结直肠癌。

将礁膜寡二糖或者礁膜寡二糖衍生物应用于抗结直肠癌的药物，或者将礁膜寡二糖或者礁膜寡二糖衍生物应用于抗结直肠癌的功能食品，通过靶向可以抑制cox-2的酶活力，并杀伤结肠癌细胞，用以治疗结直肠癌。

2、本发明实施例采用cox-2体外分子模型和ht-29结肠癌细胞模型，探索礁膜寡二糖在制备靶向cox-2抗结直肠癌药物或者功能食品中的应用。

体外实验结果证明：礁膜寡二糖可显著抑制致炎蛋白酶cox-2的酶活力，且对结肠细胞癌细胞ht-29具有明显的杀伤作用，可通过靶向抑制cox-2并同时杀伤结肠癌细胞，通过多途径达到抑制结直肠癌的作用。因此，礁膜寡二糖具有明显的抗结直肠癌的功效。

3、本发明实施例原料来源采用绿藻，具体可以采用绿藻礁膜藻粉；其原料来源于海洋天然礁膜多糖，具有资源丰富、易于产业化，安全有效等诸多优点，经发明人实验发现，可开发成抗结直肠癌药品及保健品，因此具有较好的市场应用前途。

4、本发明实施例提供礁膜寡二糖在制备靶向cox-2抗结直肠癌药物和功能食品中的应用，其技术方案为临床提供了结直肠癌病人以及亚健康等人群服用的药品或功能食品。

附图说明

图1是本发明实施例中礁膜寡二糖的二级质谱图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

本发明的一实施例提供礁膜寡二糖的应用，应用于治疗结直肠癌。

具体的，将礁膜寡二糖应用于抗结直肠癌的药物，或者将礁膜寡二糖应用于抗结直肠癌的功能食品。具体应用方式为：将礁膜寡二糖直接作为药物或者功能食品进行食用。

具体的用法用量为：每天3次，以礁膜寡二糖的用量计，每次10-500毫克。

礁膜寡二糖可以通过靶向抑制cox-2的酶活力，并杀伤结肠癌细胞，用以治疗结直肠癌。具体的，经体外实验证明，本实施例中，礁膜寡二糖可以显著降低致炎蛋白酶cox-2的酶活力，且对结肠细胞癌细胞ht-29具有明显的杀伤作用，可通过靶向抑制cox-2并同时杀伤结肠癌细胞，通过多途径达到治疗结直肠癌的作用。

本发明另一实施例提供礁膜寡二糖衍生物的应用，应用于治疗结直肠癌。

具体的，将礁膜寡二糖衍生物应用于抗结直肠癌的药物，或者将礁膜寡二糖衍生物应用于抗结直肠癌的功能食品。具体应用方式为：将礁膜寡二糖衍生物直接作为药物或者功能食品进行食用。

具体的用法用量为：每天3次，以礁膜寡二糖的用量计，每次10-500毫克。

进一步的，礁膜寡二糖衍生物包括：以包含礁膜寡二糖为母核的硫酸化衍生物、以包含礁膜寡二糖为母核的磷酸化衍生物，以及以包含礁膜寡二糖为母核的乙酰化衍生物。

在礁膜寡二糖衍生物的应用中，产生治疗结直肠癌效果的机理与礁膜寡二糖相同，都是礁膜寡二糖在起作用，在此不再赘述。具体的，也是通过礁膜寡二糖显著降低致炎蛋白酶cox-2的酶活力，且对结肠细胞癌细胞ht-29具有明显的杀伤作用，可通过靶向抑制cox-2并同时杀伤结肠癌细胞，通过多途径达到治疗结直肠癌的作用。

本发明还一实施例提供礁膜寡二糖的制备方法，具体包括如下步骤s1-s6：

s1、将绿藻溶于水，得到5-15wt％的绿藻水溶液；

在本实施例中，该绿藻采用为绿藻礁膜藻粉，将绿藻礁膜藻粉溶于水后，配置成5-15wt％的绿藻礁膜藻水溶液。

s2、往绿藻水溶液中添加1.0wt％的稀硫酸，加热至50-85℃，并搅拌，使绿藻进行化学降解6-8小时，得到降解液；

在本实施例中，在步骤s1中得到的绿藻礁膜藻水溶液中添加1.0wt％的稀硫酸，加热至50-85℃，并搅拌，使绿藻礁膜藻进行化学降解6-8小时，得到降解液。

s3、将步骤s2中得到的降解液置于透析袋中透析，并过夜，得到透析液；

s4、将步骤s3中得到的透析液采用旋转仪进行浓缩，得到一次浓缩液，将得到的一次浓缩液经过1000da的超滤膜，得到小于1000da的寡糖；

s5、将步骤s4中得到的寡糖采用旋转仪进行浓缩，得到二次浓缩液，将该二次浓缩液经过bio-gelp4色谱柱分离纯化，得到洗脱液；

s6、采用苯酚-硫酸法检测步骤s5中得到的洗脱液的糖含量，并绘制洗脱曲线，收集洗脱曲线中峰尖部分对应的洗脱液，将收集的该洗脱液进行冻干，得到所述礁膜寡二糖。

需要说明的是，本发明实施例中，礁膜寡二糖的分子骨架为葡萄糖醛酸(gia)通过β-1，3糖苷键与鼠李糖(rha)键连接形成，所述礁膜寡二糖的分子量为340.28da。并且，礁膜寡二糖分子结构通式如下：

以下为具体实施例。

实施例1

本发明的实施例1提供礁膜寡二糖的制备方法，具体包括如下步骤s1-s6：

s1、将绿藻礁膜藻粉溶于水后，配置成5wt％的绿藻礁膜藻水溶液。

s2、在步骤s1中得到的绿藻礁膜藻水溶液中添加1.0wt％的稀硫酸，加热至50℃，并搅拌，使绿藻礁膜藻进行化学降解6小时，得到降解液。

s3、将步骤s2中得到的降解液置于透析袋中透析，并过夜，得到透析液；

s4、将步骤s3中得到的透析液采用旋转仪进行浓缩，得到一次浓缩液，将得到的一次浓缩液经过1000da的超滤膜，得到小于1000da的寡糖；

s5、将步骤s4中得到的寡糖采用旋转仪进行浓缩，得到二次浓缩液，将该二次浓缩液经过bio-gelp4色谱柱分离纯化，得到洗脱液；

s6、采用苯酚-硫酸法检测步骤s5中得到的洗脱液的糖含量，并绘制洗脱曲线，收集洗脱曲线中峰尖部分对应的洗脱液，将收集的该洗脱液进行冻干，得到所述礁膜寡二糖。

实施例2

本发明的实施例2提供礁膜寡二糖的制备方法，具体包括如下步骤s1-s6：

s1、将绿藻礁膜藻粉溶于水后，配置成15wt％的绿藻礁膜藻水溶液。

s2、在步骤s1中得到的绿藻礁膜藻水溶液中添加1.0wt％的稀硫酸，加热至85℃，并搅拌，使绿藻礁膜藻进行化学降解8小时，得到降解液。

s3、将步骤s2中得到的降解液置于透析袋中透析，并过夜，得到透析液；

s4、将步骤s3中得到的透析液采用旋转仪进行浓缩，得到一次浓缩液，将得到的一次浓缩液经过1000da的超滤膜，得到小于1000da的寡糖；

s5、将步骤s4中得到的寡糖采用旋转仪进行浓缩，得到二次浓缩液，将该二次浓缩液经过bio-gelp4色谱柱分离纯化，得到洗脱液；

s6、采用苯酚-硫酸法检测步骤s5中得到的洗脱液的糖含量，并绘制洗脱曲线，收集洗脱曲线中峰尖部分对应的洗脱液，将收集的该洗脱液进行冻干，得到所述礁膜寡二糖。

实施例3

本发明的实施例3提供礁膜寡二糖的制备方法，具体包括如下步骤s1-s6：

s1、将绿藻礁膜藻粉溶于水后，配置成10wt％的绿藻礁膜藻水溶液。

s2、在步骤s1中得到的绿藻礁膜藻水溶液中添加1.0wt％的稀硫酸，加热至85℃，并搅拌，使绿藻礁膜藻进行化学降解7小时，得到降解液。

s3、将步骤s2中得到的降解液置于透析袋中透析，并过夜，得到透析液；

s4、将步骤s3中得到的透析液采用旋转仪进行浓缩，得到一次浓缩液，将得到的一次浓缩液经过1000da的超滤膜，得到小于1000da的寡糖；

s5、将步骤s4中得到的寡糖采用旋转仪进行浓缩，得到二次浓缩液，将该二次浓缩液经过bio-gelp4色谱柱分离纯化，得到洗脱液；

s6、采用苯酚-硫酸法检测步骤s5中得到的洗脱液的糖含量，并绘制洗脱曲线，收集洗脱曲线中峰尖部分对应的洗脱液，将收集的该洗脱液进行冻干，得到所述礁膜寡二糖。

以下针对实施例3所制得的产物进行分析：

采用负离子模式的电喷雾质谱法对其寡糖进行分析。取少量实施例3中寡糖组分，采用乙腈∶水＝1∶1(v/v)溶液溶解该寡糖，以氮气为载气，流速为250l/h。在二级质谱中，需要锥孔电压80ev，氩气作为碰撞气体。同时，保持碰撞能量保持在20-50ev交换时，得到最佳序列信息。流动相为乙腈∶水＝1∶1(v/v)且离子源和溶剂挥发峰温度分别为80℃和150℃。

图1为葡萄糖醛酸鼠李二糖m/z339的二级质谱图，参见图1可知，葡萄糖醛酸位于非还原端。m/z339的结构为β-d-glca-(1→3)-α-l-rhap，此二糖分子骨架为葡萄糖醛酸(gia)通过β-1，3糖苷键与鼠李糖(rha)键连接形成。

以下分析礁膜寡二糖对ht-29结肠癌细胞存活率的影响

本次分析采用实施例3所制备的礁膜寡二糖。具体分析过程如下：

(1)细胞培养：将ht-29细胞接种于mem完全培养液中(该mem完全培养液含有100u/ml青霉素、100u/ml链霉素和10％fbs(胎牛血清))，置于37℃、5％co2培养箱中培养。

(2)将每孔8000个细胞种植于96孔板中，放入恒温细胞培养箱孵育12h后，加入不同浓度的礁膜寡二糖放入恒温细胞培养箱继续孵育48h。孵育结束后更换培养基，每孔加入20μl(5mg/ml)mtt(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)溶液，培养箱继续孵育4h。结束后，除去液体，每孔加入150μldmso(二甲基亚砜)溶液，混匀放入37℃培养箱孵育20min。最后，采用酶标仪a540nm处测量吸光值。每次取三个平行样，实验重复三次。

计算公式：细胞存活率(cellviability)＝实验组吸光值/对照组吸光值

实验结果如表1所示，礁膜寡二糖的给药浓度为100μmol/l、200μmol/l、400μmol/l、500μmol/l时，细胞存活率与对照组存在显著性差异，实验结果表明：礁膜寡二糖可对结肠癌细胞具有很好的抑制生长的作用，并呈现明显的剂量依赖效应。

表1礁膜寡二糖对ht-29结肠癌细胞存活率影响实验结果

注：n＝9，x±sd，与模型组相比，*p＜0.05，***p＜0.001

以下分析礁膜寡二糖对细胞内cox-2酶活力的影响

本次分析采用实施例3所制备的礁膜寡二糖。具体分析过程如下：

(1)细胞培养：将ht-29细胞接种于mem完全培养液中(含有100u/ml青霉素、100u/ml链霉素和10％fbs(胎牛血清))，置于37℃、5％co2培养箱中培养。

(2)将每孔8000个细胞种植于96孔板中，放入恒温细胞培养箱孵育24h，然后加入200μg/ml礁膜寡二糖，放入恒温细胞培养箱继续孵育48h。孵育结束后，每孔加入200μlpbs溶液(磷酸盐缓冲溶液)，清洗两次。每孔加入350μl细胞裂解液，置于冰上裂解20min后，收集裂解液。13000rpm，4℃离心5min，收集上清。最后，取20μl所提取的蛋白，加入底物和辅助因子(请参考商业化cox-2测定试剂盒步骤，产品号s0168，碧云天生物科技公司)在37℃孵育10min后，采用酶标仪检测荧光值，检测波长(565/590)。实验重复三次。

计算公式：cox-2酶活力＝实验组荧光值/100％酶活组荧光值

实验结果如表2所示，药物组cox-2酶活力与对照组存在显著性差异，礁膜寡二糖(100μmol/l-400μmol/l)可使ht-29细胞内的cox-2酶活力显著降低。

实验表明：礁膜寡二糖不但可以直接杀伤结肠癌细胞，还能够显著抑制细胞内的cox-2酶的酶活力，可从多个途径发挥抗结肠癌的作用。

表2礁膜寡二糖对ht-29细胞内cox-2酶活力影响实验结果

注：n＝9，x±sd，与模型组相比，*p＜0.05

经上述实验证明，礁膜寡二糖可对结肠癌细胞具有很好的抑制生长的作用，并呈现明显的剂量依赖效应。

并且，礁膜寡二糖不但可以直接杀伤结肠癌细胞，还能够显著抑制细胞内的cox-2酶的酶活力，可从多个途径发挥抗结肠癌的作用。

需要说明的是，在整个申请文件中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，由于文字表达的有限性，而客观上存在无限的试试方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进、润饰或变化，也可以将上述技术特征以适当的方式进行组合；这些改进润饰、变化或组合，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均应视为本发明的保护范围。