本发明属于干细胞应用技术领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞缓释滴眼液及其制备方法。
背景技术：
近年来，带电子屏幕的产品普及率越来越高，使用场景越来越广，相应地，电子屏幕带来的眼干、眼涩、眼睛酸胀充血甚至头晕恶心等眼疲劳综合征也越来越多，各种眼科疾病，比如近视、远视、白内障、青光眼、角膜溃疡等的发病率也逐渐增高，危害着眼睛的正常功能。
为了缓解眼疲劳综合征的症状，降低各类眼科疾病的发病率，治疗各类眼科疾病，市面上出现了各种各样的滴眼液。目前的眼部保健、治疗类的滴眼液主要有抗生素类滴眼液、人工泪液以及中药类滴眼液。
抗生素类滴眼液主要是针对眼部的细菌性感染，不宜长期使用；人工泪液主要是补充眼睛所需要的水分，需要频繁使用，且只能针对眼睛出现的干涩症状进行表面性的症状缓解；中药类滴眼液主要用于预防眼部疾病，缓解眼疲劳症状，由于其卫生条件限制，其有效成分浓度也不会太高。
脐带间充质干细胞来源于中胚层的多能干细胞，具有高度自我更新能力和多向分化潜能。脐带间充质干细胞还可以分泌干细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、胶原蛋白等多种活性成分。大量的论文、文章指出，脐带间充质干细胞分泌的活性成分对于眼疲劳和角膜上皮损伤等具有良好的预防以及治疗效果。目前已经有文献报道采用脐带间充质干细胞的细胞因子作为滴眼液进行保健和治疗，但都只是初步的配方研究，另外普遍存在滞留时间短、药物利用率低的问题。造成这一问题的原因是，眼睛具有流泪和眨眼反射等保护机制，在这些保护机制的作用下，会将滴入到眼内的药液迅速从角膜前区域清除，使得药液难以发挥作用，另外，在药液被从角膜前区域内清除后，会在短时间内大量经鼻泪管进入消化道，进而被吸收，增加了诱发副作用和毒性风险。
申请号为cn201811127261.4的发明专利公开了一种修复眼部损伤细胞因子的滴眼液及制备方法，其每升滴眼液中，包含10-15g视黄酸、25-30g牛磺酸、12-18g透明质酸、2-5mg苯扎溴铵以及余量的脐带间充质干细胞上清液。在该技术方案要解决的目的是给出一种间充质干细胞滴眼液，通过间充质干细胞等其他有效成分促进眼部损伤组织的修复与再生。申请号为cn201810188801.3的发明专利公开了一种间充质干细胞外泌体滴眼液及其制备方法和应用。该技术方案利用干细胞外泌体只给了一款全新的间充质干细胞外泌体滴眼液，使得滴眼液既具有保健功能，可以缓解视疲劳，还对近视、远视、青光眼、白内障、年龄相关性黄斑病变等眼部疾病具有一定的防治作用。但是，这两篇发明专利仍然没有解决间充质干细胞滴眼液滞留能力弱，以及在药液被从角膜前区域内清除后，短时间内大量经鼻泪管进入消化道，进而被吸收，增加了诱发副作用和毒性风险的技术问题。
申请号为cn201811538991.3的发明专利公开了一种含有外泌体用于干眼治疗的滴眼液及其制备方法。该技术方案公开的滴眼液内包括0.2%的维生素e、0.2%的卡波姆、2%的渗透压调节剂、2.5%的外泌体，余量为水，外泌体从人脐带间充质干细胞中提取，维生素e可以抑制眼睛晶状体内的过氧化脂反应，使末梢血管扩张，改善血液循环，卡波姆使滴眼液达到合适的粘稠度。该发明将外泌体按一定浓度制成滴眼液，为局部给药，减少了全身毒副反应的发生，使在眼部吸收的药物浓度增加，利于安全有效的对干眼进行治疗。但是卡波姆不耐离子，在眼部环境中存在大量离子，会中和卡波姆的电荷，进而使得滴眼液无法维持粘度，从而也不具有优良的滞留性，实际使用时的效果受滞留性限制，并不理想。
另外，现有技术中出现的间充质干细胞滴眼液多为液体状态，普遍存在保存时间短、浓度低、有效成分少、效果不理想等问题，往往需要大量添加一些化学保护物质如抗坏血酸、葡聚糖等来缓解细胞生长因子的降解并保持其生物活性；此外，现有间充质干细胞滴眼液常常需要添加千分之二的山梨酸钾、羟苯甲酯等抑菌剂达到抑菌的效果，尽管有相关标准进行安全量的限定，但是这些化学保护物质或抑菌剂在含量较高时，长期使用依然会刺激眼睛，对眼部健康不利。
技术实现要素：
为了解决背景技术中提出的问题，达到“给出一种滞留性好、作用时间长、避免大量加入防腐剂和化学保护物质的同时不易变质、提高干细胞因子含量的脐带间充质干细胞缓释滴眼液”的目的，本发明给出了一种脐带间充质干细胞缓释滴眼液及其制备方法。
一种脐带间充质干细胞缓释滴眼液，包括单独包装的粉剂a、单独包装的b；粉剂a为脐带间充质干细胞培养上清液制备的干燥粉剂；按重量份计，溶媒b包括0.2-0.6份透明质酸钠、0.15-0.5份牛磺酸、0.1-0.3份海藻酸钠和98.6-99.55份无菌水。
进一步地，脐带间充质干细胞培养上清液为p3-p7代脐带间充质干细胞的培养上清液。
进一步地，溶媒b中，还包含有0.01-0.05重量份的山梨酸钾。
一种脐带间充质干细胞缓释滴眼液的制备方法，包括如下步骤：a.采集经产妇同意且乙型肝炎病毒表面抗原检查呈阴性、丙型肝炎抗体检查阴性、梅毒螺旋体抗体检查呈阴性、hiv病毒抗体检查呈阴性、巨细胞病毒抗体igm检查呈阴性的脐带组织；b.将脐带组织剪成段状物，依次剔除两条动脉、一条静脉，再将段状脐带组织剪成块状，将脐带组织的华通胶面向下平铺于培养容器底面，静置后，向培养容器内加入α-mem培养基，随后将培养容器置于培养箱中培养；c.当细胞融合度达到60%-70%时，弃去并收集培养容器中的α-mem培养基，向培养容器内加入生理盐水清洗组织，将组织块移除。随后加入胰酶消化细胞，当90%以上的细胞变圆并开始脱落，再向培养容器中加入弃去的α-mem培养基终止消化；d.将步骤c中得到的细胞吹散后，离心处理，收集上清液，用新鲜的α-mem培养基重悬细胞，并接种于培养容器中，进行传代；e.分别收集p3代至p7代脐带间充质干细胞上清液，并混合均匀得到混合液，用孔径为0.22μm的滤膜过滤，并将过滤后的混合液进行浓缩，收集浓缩液到无菌收集流管中；f.将无菌收集管在-80℃冷冻后，进行真空冷冻干燥，得到粉剂a，在-20℃的状态下保存；g.在常温下，将0.2-0.6重量份的透明质酸钠、0.15-0.5份牛磺酸、0.1-0.3份海藻酸钠和98.6-99.55份无菌水混合均匀，将混合液使用孔径为0.22μm的滤膜过滤，得到溶媒b；h.使用时，将0.1-0.5mg的粉剂a与10g的溶媒b混合均匀，得到一份脐带间充质干细胞缓释滴眼液。
进一步地，在步骤g中，还将0.01-0.05重量份的山梨酸钾加入到0.2-0.6重量份的透明质酸钠、0.15-0.5份牛磺酸、0.1-0.3份海藻酸钠中，并加入98.6-99.55份无菌水混合均匀。
进一步地，在步骤b中，将脐带组织将成2.5cm的段状物，依次剔除两条动脉、一条静脉后，再将脐带组织建成表面积15mm2的组织块，脐带组织的华通胶面向下平铺于75cm2的培养瓶底面，再静置15分钟，沿75cm2培养瓶的侧壁加入5mlα-mem培养基，随后将培养瓶置于37℃、5%co2的培养箱中培养。
进一步地，步骤c中，加入0.9%的生理盐水，之后，再加入2ml胰酶消化细胞，当90%以上的细胞变圆并开始脱落，向培养瓶中加入4ml弃去的α-mem培养基中止消化。
进一步地，步骤d中，将步骤c得到的细胞吹散后，装入离心管，1000r/min离心处理5min，收集上清液，用15ml的新鲜α-mem培养基重悬细胞后，将细胞重悬液平均分到3个培养瓶中培养，传至p7代脐带间充质干细胞。
进一步地，步骤e中，分别收集p3代至p7代的脐带间充质干细胞上清液，混合均匀得到混合液，用孔径为0.22μm的滤膜过滤，并将过滤后的混合液进行浓缩，收集浓缩液到无菌收集管中。
进一步地，步骤e中，使用slice200切向器对混合液进行浓缩。
使用时，将粉剂a与溶媒b按比例混合摇匀，滴于眼球表面，早晚各一次，每次150-300μl，七天一个疗程，连续滴加三个疗程后，停用两天，再继续滴加，可以如此长期滴加使用。
与现有技术相比，本发明公开的技术方案具有以下有益效果：将脐带间充质干细胞培养上清液加入到含有海藻酸钠等的混合液内，配成缓释滴眼液，具有改善眼部微环境、缓解眼疲劳、促进角膜上皮组织修复的作用；在将溶液型的滴眼液滴入眼内时，随着眼睑眨动，将滴眼液均匀分布后，海藻酸钠可以与眼内分泌的泪液中大量的ca2+、na+、k+等阳离子络合，随后，将滴眼液转变为凝胶状态，涂布在眼球表面，增加了药物在眼内的滞留率与滞留时间，延长了作用时间，提高了药物的利用率。并且，整个凝胶的耐离子性强，形成的凝胶较为稳定；此外，本发明的有效成分为脐带间充质干细胞培养上清液中的各种干细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、胶原蛋白等多种活性成分，一方面可以避免使用复杂的刺激性的化合物，另一方面，避免了短时间内大量药物进入消化道诱发的副作用以及毒副作用。另外，通过粉剂a与溶媒b的单独制备，在使用时才将真空冷冻干燥得到的粉剂a与溶媒b混合，一方面延长了缓释滴眼液的保质期，本发明制备的滴眼液-20℃能够存放3年，现有添加化学保护成分的间充质干细胞滴眼液保质期一般也只有1年左右，另一方面，能够避免加入化学保护物质和大量抑菌剂，避免刺激眼部。
具体实施方式
下面说明本发明的具体实施方式，公开实施方式的目的在于对本发明进行说明解释，而非是对本发明的限制，一切在本发明的基础上进行简单替换、组合和发展得到的技术方案，都应落入本发明保护范围。
实施例一
一种脐带间充质干细胞缓释滴眼液，包括单独包装的粉剂a、单独包装的溶媒b，每份脐带间充质干细胞缓释滴眼液包括0.5mg粉剂a、10g溶媒b；粉剂a为脐带间充质干细胞培养上清液制备的干燥粉剂；按重量份计，溶媒b包括0.2份透明质酸钠、0.15份牛磺酸、0.1份海藻酸钠和99.55份无菌水。
脐带间充质干细胞培养上清液为p3-p7代脐带间充质干细胞的培养上清液。
一种脐带间充质干细胞缓释滴眼液的制备方法，包括如下步骤：a.采集经产妇同意且乙型肝炎病毒表面抗原检查呈阴性、丙型肝炎抗体检查阴性、梅毒螺旋体抗体检查呈阴性、hiv病毒抗体检查呈阴性、巨细胞病毒抗体检查呈阴性的后，采集脐带组织；b.将脐带组织剪成段状物，依次剔除两条动脉、一条静脉，再将段状脐带组织剪成块状，将脐带组织的华通胶面向下平铺于培养容器底面，静置后，向培养容器内加入α-mem培养基，随后将培养容器置于培养箱中培养；c.当细胞融合度达到60%时，弃去培养容器中的α-mem培养基，向培养容器内加入生理盐水清洗组织，随后将组织移除，加入胰酶消化细胞，当90%以上的细胞变圆并开始脱落，再向培养容器中加入弃去的旧α-mem培养基终止消化；d.将步骤c中得到的细胞吹散后，离心处理，收集上清液，用新鲜的α-mem培养基重悬细胞，并接种于培养容器中，进行传代；e.分别收集p3代至p7代脐带间充质干细胞上清液，并混合均匀得到混合液，用孔径为0.22μm的滤膜过滤，并将过滤后的混合液进行浓缩，收集浓缩液到无菌收集管中；f.将无菌收集管在-80℃冷冻后，进行真空冷冻干燥，得到粉剂a，在-20℃的状态下保存；g.在常温下，将0.2份透明质酸钠、0.15份牛磺酸、0.1份海藻酸钠和99.55份无菌水混合均匀，将混合液使用孔径为0.22μm的滤膜过滤，得到溶媒b；h.使用时，将0.5mg的粉剂a与10g的溶媒b混合均匀，得到一份脐带间充质干细胞缓释滴眼液。
在步骤b中，将脐带组织将成2.5cm的段状物，依次剔除两条动脉、一条静脉后，再将脐带组织建成表面积15mm2的组织块，脐带组织的华通胶面向下平铺于75cm2的培养瓶底面，再静置15分钟，沿75cm2培养瓶的侧壁加入5mlα-mem培养基，随后将培养瓶置于37℃、5%co2的培养箱中培养。
步骤c中，加入0.9%的生理盐水洗涤细胞，将组织块移除之后，再加入2ml胰酶消化细胞，当90%以上的细胞变圆并开始脱落，向培养瓶中加入4mlα-mem培养基中止消化。
步骤d中，将步骤c得到的细胞吹散后，装入离心管，1000r/min离心处理5min，收集上清液，用15ml的新鲜α-mem培养基重悬细胞后，将细胞重悬液平均分到3个培养瓶中培养，传至p7代脐带间充质干细胞。
步骤e中，分别收集p3代至p7代的脐带间充质干细胞上清液，混合均匀得到混合液，用孔径为0.22μm的滤膜过滤，并将过滤后的混合液进行浓缩，收集浓缩液到无菌收集管中。
步骤e中，使用slice200切向流器对混合液进行浓缩。
实施例二
一种脐带间充质干细胞缓释滴眼液，包括单独包装的粉剂a、单独包装的溶媒b，每份脐带间充质干细胞缓释滴眼液包括0.1mg粉剂a、10g溶媒b；粉剂a为脐带间充质干细胞培养上清液制备的干燥粉剂；按重量份计，溶媒b包括0.6份透明质酸钠、0.5份牛磺酸、0.3份海藻酸钠、0.01重量份的山梨酸钾和98.6份无菌水。
脐带间充质干细胞培养上清液为p3-p7代脐带间充质干细胞的培养上清液。
一种脐带间充质干细胞缓释滴眼液的制备方法，包括如下步骤：a.经乙型肝炎病毒表面抗原检查呈阴性、丙型肝炎抗体检查阴性、梅毒螺旋体抗体检查呈阴性、hiv病毒抗体检查呈阴性、巨细胞病毒抗体检查呈阴性的产妇同意后，采集脐带组织；b.将脐带组织剪成段状物，依次剔除两条动脉、一条静脉，再将段状脐带组织剪成块状，将脐带组织的华通胶面向下平铺于培养容器底面，静置后，向培养容器内加入α-mem培养基，随后将培养容器置于培养箱中培养；c.当细胞融合度达到70%时，弃去培养容器中的α-mem培养基，向培养容器内加入生理盐水清洗组织，随后将组织移除，加入胰酶消化细胞，当90%以上的细胞变圆并开始脱落，再向培养容器中加入α-mem培养基中止消化；d.将步骤c中得到的细胞吹散后，离心处理，收集上清液，用新鲜的α-mem培养基重悬细胞，并接种于培养容器中，进行传代；e.分别收集p3代至p7代脐带间充质干细胞上清液，并混合均匀得到混合液，用孔径为0.22μm的滤膜过滤，并将过滤后的混合液进行浓缩，收集浓缩液到无菌收集管中；f.将无菌收集管在-80℃冷冻后，进行真空冷冻干燥，得到粉剂a，在-20℃的状态下保存；g.在常温下，将0.6份透明质酸钠、0.15份牛磺酸、0.3份海藻酸钠、0.01重量份的山梨酸钾和98.6份无菌水混合均匀，将混合液使用孔径为0.22μm的滤膜过滤，得到溶媒b；h.使用时，将0.1-0.5mg的粉剂a与10g的溶媒b混合均匀，得到一份脐带间充质干细胞缓释滴眼液。
在步骤b中，将脐带组织将成2.5cm的段状物，依次剔除两条动脉、一条静脉后，再将脐带组织建成表面积15mm2的组织块，脐带组织的华通胶面向下平铺于75cm2的培养瓶底面，再静置15分钟，沿75cm2培养瓶的侧壁加入5mlα-mem培养基，随后将培养瓶置于37℃、5%co2的培养箱中培养。
步骤c中，加入的生理盐水为0.9%的生理盐水，之后，再加入2ml胰酶消化细胞，当90%以上的细胞变圆并开始脱落，向培养瓶中加入4mlα-mem培养基中止消化。
步骤d中，将步骤c得到的细胞吹散后，装入离心管，1000r/min离心处理5min，收集上清液，用15ml的新鲜α-mem培养基重悬细胞后，将细胞重悬液平均分到3个培养瓶中培养，传至p7代脐带间充质干细胞。
步骤e中，分别收集p3代至p7代的脐带间充质干细胞上清液，混合均匀得到混合液，用孔径为0.22μm的滤膜过滤，并将过滤后的混合液进行浓缩，收集浓缩液到无菌收集管中。
步骤e中，使用slice200切向流器对混合液进行浓缩。
实施例三
一种脐带间充质干细胞缓释滴眼液，包括单独包装的粉剂a、单独包装的溶媒b，每份脐带间充质干细胞缓释滴眼液包括0.3mg粉剂a、10g溶媒b；粉剂a为脐带间充质干细胞培养上清液制备的干燥粉剂；按重量份计，溶媒b包括0.4份透明质酸钠、0.35份牛磺酸、0.2份海藻酸钠、0.05重量份的山梨酸钾和99.05份无菌水。
脐带间充质干细胞培养上清液为p3-p7代脐带间充质干细胞的培养上清液。
一种脐带间充质干细胞缓释滴眼液的制备方法，包括如下步骤：a.经乙型肝炎病毒表面抗原检查呈阴性、丙型肝炎抗体检查阴性、梅毒螺旋体抗体检查呈阴性、hiv病毒抗体检查呈阴性、巨细胞病毒抗体检查呈阴性的产妇同意后，采集脐带组织；b.将脐带组织剪成段状物，依次剔除两条动脉、一条静脉，再将段状脐带组织剪成块状，将脐带组织的华通胶面向下平铺于培养容器底面，静置后，向培养容器内加入α-mem培养基，随后将培养容器置于培养箱中培养；c.当细胞融合度达到65%时，弃去培养容器中的α-mem培养基，向培养容器内加入生理盐水清洗组织，随后加入胰酶消化细胞，当90%以上的细胞变圆并开始脱落，再向培养容器中加入α-mem培养基中止消化；d.将步骤c中得到的细胞吹散后，离心处理，收集上清液，用新鲜的α-mem培养基重悬细胞，并接种于培养容器中，进行传代；e.分别收集p3代至p7代脐带间充质干细胞上清液，并混合均匀得到混合液，用孔径为0.22μm的滤膜过滤，并将过滤后的混合液进行浓缩，收集浓缩液到无菌收集管中；f.将无菌收集管在-80℃冷冻后，进行真空冷冻干燥，得到粉剂a，在-20℃的状态下保存；g.在常温下，将0.4份透明质酸钠、0.35份牛磺酸、0.2份海藻酸钠、0.05重量份的山梨酸钾和99.1份无菌水混合均匀，将混合液使用孔径为0.22μm的滤膜过滤，得到溶媒b；h.使用时，将0.1-0.5mg的粉剂a与10ml的溶媒b混合均匀，得到一份脐带间充质干细胞缓释滴眼液。
在步骤b中，将脐带组织将成2.5cm的段状物，依次剔除两条动脉、一条静脉后，再将脐带组织建成表面积15mm2的组织块，脐带组织的华通胶面向下平铺于75cm2的培养瓶底面，再静置15分钟，沿75cm2培养瓶的侧壁加入5mlα-mem培养基，随后将培养瓶置于37℃、5%co2的培养箱中培养。
步骤c中，加入0.9%的生理盐水，之后，再加入2ml胰酶消化细胞，当90%以上的细胞变圆并开始脱落，向培养瓶中加入4mlα-mem培养基中止消化。
步骤d中，将步骤c得到的细胞吹散后，装入离心管，1000r/min离心处理5min，收集上清液，用15ml的新鲜α-mem培养基重悬细胞后，将细胞重悬液平均分到3个培养瓶中培养，传至p7代脐带间充质干细胞。
步骤e中，分别收集p3代至p7代的脐带间充质干细胞上清液，混合均匀得到混合液，用孔径为0.22μm的滤膜过滤，并将过滤后的混合液进行浓缩，收集浓缩液到无菌收集管中。
步骤e中，使用slice200切向流器对混合液进行浓缩。