一种碳点/碳化钛异质结声敏剂的制备方法及其在声动力癌症治疗中的应用与流程

本发明涉及纳米材料制备和生物医学应用领域，具体涉及一种碳点/碳化钛异质结声敏剂的制备方法及其在声动力癌症治疗中的应用。

背景技术：

癌症是人类死亡的主要原因之一，传统的癌症治疗，包括手术、放疗和化疗，都有一定的副作用。例如，手术对人体是重大的创伤，而且会导致术后并发症，而放疗和化疗可能破坏人体免疫系统，引起严重的副作用。近年来，低毒、非侵袭性癌症治疗的发展受到越来越多的关注，如光热疗法(ptt)，光动力疗法(pdt)以及声动力疗法(sdt)。其中，sdt是基于pdt开发的一种新的癌症治疗模式，类似于pdt的机制，sdt通过超声激发声敏剂产生活性氧(ros)来杀死癌细胞。此外，sdt还具有pdt不具备的机械效应。更重要的是，sdt可以克服光敏疗法的深度限制，因此在临床应用中具有优于光疗法的优点。

一些经典的有机小分子类声敏剂如卟啉衍生物、吖啶类化合物以及酞箐等能起到比较好的声动力治疗的效果，但较差的水溶性、生物相容性以及较短的血液循环时间限制了在sdt中的应用。而无机纳米材料由于其良好的生物相容性以及肿瘤靶向能力，因此被开发出来作为无机声敏剂应用到sdt中。无机纳米声敏剂如tio2，超声条件下形成电子(e-)空穴(h+)对，进一步产生活性氧。然而，钛基纳米材料在水溶液中分散性差、生物降解性差等缺点严重阻碍了其生物医学应用。此外，半导体tio2的电子空穴对复合快(50±30ns)，带隙宽(3.1ev)，导致其在超声刺激下ros产率低，达不到理想的治疗效果。因此，研制高效、安全的声敏剂对增强癌症声动力治疗具有重要意义。

技术实现要素：

本发明提供一种碳点/碳化钛(cd@ti3c2)异质结声敏剂的制备及其在声动力癌症治疗中的应用，通过构建一种碳点/碳化钛异质结来改善电子-空穴对快速复合的缺点，从而增强其在超声(us)条件下产生活性氧(ros)的能力，以达到肿瘤治疗的理想效果。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种碳点/碳化钛(cd@ti3c2)异质结声敏剂的制备方法，包括如下步骤：1)将少层碳化钛分散于去离子水中，得碳化钛溶液；2)随后将近红外二区响应碳点(cds)缓慢加入碳化钛溶液中，混合均匀并于室温下搅拌23-25h；3)用去离子水洗除过量的近红外二区响应碳点，即得碳点/碳化钛(cd@ti3c2)异质结声敏剂，将所制备的碳点/碳化钛异质结声敏剂于冷冻干燥机中冷冻干燥后保存。

本发明制备的cd@ti3c2异质结主要含有碳、氮、氧、钛四种元素，平均粒径91.9nm，能稳定分散在水溶液、pbs(7.4)和dmem(10％fbs)中，具有良好的生物相容性。

本发明的cd@ti3c2异质结声敏剂在近红外激光下有良好的光热转换效率，为验证其效果，可通过如下方法测试：将cd@ti3c2异质结稀释至各种浓度(0-500μg/ml)，将每种不同浓度的溶液加入离心管中，用功率密度为0.6w/cm²的1064nm激光照射5min以测量cd@ti3c2异质结的光热转化特性。使用红外热成像仪记录温度的变化，每20秒拍照一次。结果：cd@ti3c2异质结在500μg/ml浓度以及0.6w/cm²功率密度的条件下照射5分钟后上升了55.6℃，且光热转换效率(η)为64.5％，证明其在近红外激光下有良好的光热转换效率。

本发明所制备的cd@ti3c2异质结在低强度超声下能够产生大量的活性氧(ros)，具有良好的声动力性能。本发明通过使用1，3-二苯基异苯并呋喃(dpbf)作为ros探针，测量cd@ti3c2异质结纳米材料在超声波(us)照射下的ros生成效率，以评估其声动力性能。结果：经测试计算得dpbf降解速率为0.166min^-1，其声动力性能明显强于其他商用的纳米声敏剂(如tio2纳米颗粒)。

进一步的，步骤1)中所述少层碳化钛与去离子水的质量之比为1∶1。

进一步的，步骤2)中所述近红外二区响应碳点与碳化钛溶液的质量之比为2∶1。

进一步的，步骤3)中所述去离子水的用量为步骤2)所得溶液的2-3倍。

进一步的，所述近红外二区响应碳点(cds)的制备方法包括如下步骤：

a)将芘加入到浓硝酸中，在80-90℃下通过冷凝回流反应45-48h，冷却至室温后，用去离子水稀释得到的混合物溶液，然后用滤膜过滤烘干得到三硝基芘；滤膜主要用来除去酸，将浓硝酸反应后剩余的酸除去。

b)将步骤a)所得的三硝基芘加入到去离子水中，再向溶液中加入聚乙烯亚胺，搅拌溶液8-12min，然后将溶液转入到聚四氟乙烯高压反应釜中，在180-220℃下反应2-16h；

c)待自然冷却后，取出步骤b)得到的碳点，用滤膜过滤，将过滤后的溶液转移到透析袋内透析2天，再将溶液旋转蒸发烘干，得到近红外二区响应碳点(cds)粉末。

本发明的近红外二区响应碳点主要含有碳、氮、氧三种元素，用三硝基芘和聚乙烯亚胺制备得到的碳点中碳、氮、氧的含量分别达到70.2％、15.6％、14.2％。近红外二区响应碳点在边位上含有吡咯氮和羟基，面内含有石墨氮。

本发明的近红外二区响应碳点的平均粒径为4.3±0.7nm，碳点在水溶液中的荧光发射峰为450nm，最佳激发峰位于360nm，量子产率为18％。

进一步的，步骤a)中所述芘与浓硝酸的质量之比为1∶80，所述浓硝酸的质量分数为65％-68％。

进一步的，步骤a)中所述去离子水的质量为浓硝酸的2-20倍。

进一步的，步骤b)中所述三硝基芘与去离子水的质量之比为1∶400，所述聚乙烯亚胺与去离子水的质量之比为1∶50，所述聚乙烯亚胺的分子量为70000da。

进一步的，所述步骤a)和步骤c)中的滤膜为孔径220nm的滤膜。

本发明还提供一种碳点/碳化钛异质结声敏剂在声动力癌症治疗中的应用，所述碳点/碳化钛异质结声敏剂为上述碳点/碳化钛异质结声敏剂的制备方法所制备得的碳点/碳化钛异质结声敏剂。

本发明一种碳点/碳化钛异质结声敏剂的制备及其在声动力癌症治疗中的应用，相对于现有技术具有如下有益效果：

本发明通过构建一种碳点/碳化钛异质结来改善电子-空穴对快速复合的缺点，从而增强其在超声条件下产生ros的能力，以达到肿瘤治疗的理想效果。此外，本发明研制的异质结声敏剂在近红外激光下有良好的光热转换效率，通过温和的激光辐射治疗可以改善肿瘤微环境，进一步提高异质结声敏剂在癌症声动力治疗中的效果。

附图说明

图1中a-b)分别为ti3c2和cd@ti3c2异质结纳米材料的tem图像；c)cd@ti3c2异质结纳米材料的hrtem图像；

图2为ti3c2、cds、cd@ti3c2异质结纳米材料的xrd图谱；

图3为ti3c2和cd@ti3c2异质结纳米材料的xps谱；

图4为cd@ti3c2异质结纳米材料体外声动力性能图；

图5为在相同浓度(0.5mg/ml)下，用nir-ii激光器(1064nm，0.6w/cm²)照射cds、ti3c2和cd@ti3c2异质结水溶液5分钟后的升温效应；

图6为不同处理后4t1细胞的相对存活率，(1)对照组-生理盐水，(2)nir-ii，(3)us，(4)cd@ti3c2，(5)ti3c2+us，(6)cd@ti3c2+nir-ii，(7)cd@ti3c2+us，(8)cd@ti3c2+nir-ii+us；

图7为不同处理后dcfh-da和dapi染色的4t1细胞共聚焦图像；

图8为不同处理后4t1肿瘤生长曲线，(1)对照组-生理盐水，(2)nir-ii，(3)us，(4)cd@ti3c2，(5)ti3c2+us，(6)cd@ti3c2+nir-ii，(7)cd@ti3c2+us，(8)cd@ti3c2+nir-ii+us。

具体实施方式

为便于本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现结合具体实施方式对本发明作进一步说明。

实施例1

一种碳点/碳化钛(cd@ti3c2)异质结声敏剂的制备方法，包括如下步骤：

a、近红外二区响应碳点的制备：

a)将4g芘加入到320ml浓硝酸中，所述浓硝酸的质量分数为68％，在85℃下通过冷凝回流反应48h，冷却至室温后，用去离子水稀释得到的混合物溶液，所述去离子水的质量为浓硝酸的10倍，然后用220nm滤膜过滤烘干得到三硝基芘；

b)将步骤a)所得的三硝基芘0.1g加入到40ml去离子水中，再向溶液中加入0.8g聚乙烯亚胺，所述聚乙烯亚胺的分子量为70000da，搅拌溶液8min，然后将溶液转入到100ml容量的聚四氟乙烯高压反应釜中，在200℃下反应12h；

c)待自然冷却后，取出步骤b)得到的碳点，用220nm滤膜过滤，将过滤后的溶液转移到透析袋内透析2天，再将溶液旋转蒸发烘干，得到近红外二区响应碳点(cds)粉末；

b、碳点/碳化钛(cd@ti3c2)异质结声敏剂的制备：

1)将10mg少层碳化钛ti3c2分散于10ml去离子水中，得碳化钛溶液；2)随后将近红外二区响应碳点cds(2mg/ml)缓慢加入碳化钛溶液中，混合均匀并于室温下搅拌24h；3)用去离子水洗除过量的近红外二区响应碳点cds，所述去离子水的用量为步骤2)所得溶液的2倍，并于冷冻干燥机中冷冻干燥即得碳点/碳化钛(cd@ti3c2)异质结声敏剂。

实施例2

一种碳点/碳化钛(cd@ti3c2)异质结声敏剂的制备方法，包括如下步骤：

a、近红外二区响应碳点的制备：

a)将8g芘加入到640ml浓硝酸中，所述浓硝酸的质量分数为65％，在90℃下通过冷凝回流反应45h，冷却至室温后，用去离子水稀释得到的混合物溶液，所述去离子水的质量为浓硝酸的20倍，然后用220nm滤膜过滤烘干得到三硝基芘；

b)将步骤a)所得的三硝基芘0.3g加入到120ml去离子水中，再向溶液中加入2.4g聚乙烯亚胺，所述聚乙烯亚胺的分子量为70000da，搅拌溶液10min，然后将溶液转入到100ml容量的聚四氟乙烯高压反应釜中，在220℃下反应2h；

c)待自然冷却后，取出步骤b)得到的碳点，用220nm滤膜过滤，将过滤后的溶液转移到透析袋内透析2天，再将溶液旋转蒸发烘干，得到近红外二区响应碳点(cds)粉末；

b、碳点/碳化钛(cd@ti3c2)异质结声敏剂的制备：

1)将20mg少层碳化钛ti3c2分散于20ml去离子水中，得碳化钛溶液；2)随后将近红外二区响应碳点cds(2mg/ml)缓慢加入碳化钛溶液中，混合均匀并于室温下搅拌25h；3)用去离子水洗除过量的近红外二区响应碳点cds，所述去离子水的用量为步骤2)所得溶液的3倍，并于冷冻干燥机中冷冻干燥即得碳点/碳化钛(cd@ti3c2)异质结声敏剂。

实施例3

一种碳点/碳化钛(cd@ti3c2)异质结声敏剂的制备方法，包括如下步骤：

a、近红外二区响应碳点的制备：

a)将2g芘加入到160ml浓硝酸中，所述浓硝酸的质量分数为67％，在80℃下通过冷凝回流反应48h，冷却至室温后，用去离子水稀释得到的混合物溶液，所述去离子水的质量为浓硝酸的2倍，然后用220nm滤膜过滤烘干得到三硝基芘；

b)将步骤a)所得的三硝基芘0.5g加入到200ml去离子水中，再向溶液中加入4g聚乙烯亚胺，所述聚乙烯亚胺的分子量为70000da，搅拌溶液12min，然后将溶液转入到100ml容量的聚四氟乙烯高压反应釜中，在180℃下反应16h；

c)待自然冷却后，取出步骤b)得到的碳点，用220nm滤膜过滤，将过滤后的溶液转移到透析袋内透析2天，再将溶液旋转蒸发烘干，得到近红外二区响应碳点(cds)粉末；

b、碳点/碳化钛(cd@ti3c2)异质结声敏剂的制备：

1)将15mg少层碳化钛ti3c2分散于15ml去离子水中，得碳化钛溶液；2)随后将近红外二区响应碳点cds(2mg/ml)缓慢加入碳化钛溶液中，混合均匀并于室温下搅拌23h；3)用去离子水洗除过量的近红外二区响应碳点cds，所述去离子水的用量为步骤2)所得溶液的2倍，并于冷冻干燥机中冷冻干燥即得碳点/碳化钛(cd@ti3c2)异质结声敏剂。

将实施例1中所制得的碳点/碳化钛(cd@ti3c2)异质结声敏剂经仪器检测进行表征、mtt法测定其细胞毒性以及在体内通过静脉注射方式治疗肿瘤等相关实验，对cd@ti3c2异质结的体外和体内温和的光热治疗增强的声动力治疗性能评估：

本发明通过mtt法对经过cd@ti3c2异质结处理后的细胞进行细胞活度的检测。将小鼠乳腺癌细胞(4t1)接种到96孔板中，每孔的密度为5000个，培养24小时。随后用不同方式处理细胞，共分为八个组：(1)对照组，(2)nir-ii，(3)us，(4)cd@ti3c2，(5)ti3c2+us，(6)cd@ti3c2+nir-ii，(7)cd@ti3c2+us，(8)cd@ti3c2+nir-ii+us。nir-ii激光的功率密度为0.6w/cm²，照射时间为5min。us的照射条件为3.0w/cm²，5min。处理结束后细胞继续在37℃下继续孵育24小时，随后加入mtt试剂孵育4h，最后将每孔中的培养液吸出，加入150μl的二甲基亚砜进行溶解，用酶标仪测定在490nm处的吸收。

在3-5周的雌性裸鼠腋窝处皮下接种100μl(100万)的4t1细胞，待肿瘤体积长到100mm³时，将裸鼠分为8组(每组5只)：(1)对照组，(2)nir-ii，(3)us，(4)cd@ti3c2，(5)ti3c2+us，(6)cd@ti3c2+nir-ii，(7)cd@ti3c2+us，(8)cd@ti3c2+nir-ii+us。nir-ii激光的功率密度为0.6w/cm²，照射时间为5min。us的照射条件为3.0w/cm²，5min。每隔一天测量肿瘤的体积大小并且每天记录裸鼠的体重以评估碳点/碳化钛异质结的体内温和的光热治疗增强的声动力治疗性能。

测试结果如附图1-8所示，结论如下：

由图1可知，ti3c2纳米片平均粒径为85.2nm，而cd@ti3c2异质结的平均粒径为91.9nm，在高倍电镜下观察cds，其有明显的晶格条纹，晶格间距均为0.21nm。

由图2可知，得到的cd@ti3c2异质结的2θ≈26°处有一个明显的衍射峰，对应于cds的晶面间距。

由图3可知，得到的cd@ti3c2异质结在399ev左右有一个明显的n1s信号峰，证实了ti3c2纳米片表面碳点的有效负载。

由图4可知，随着超声时间的增加，可以观察到dpbf在421nm处的特征吸收峰逐渐降低。表明制备的cd@ti3c2异质结在超声条件下能够产生大量的活性氧，具有良好的体外声动力性能。

由图5可知，得到的cd@ti3c2异质结拥有良好的体外光热性能，在0.6w/cm²的功率1064nm激光照射下，5分钟内上升了55.6℃。

由图6可知，生理盐水、单独nir-ii照射、单独us、单独cd@ti3c2异质结均没表现出明显的细胞毒性。超声条件下的ti3c2纳米片、nir-ii照射下的cd@ti3c2异质结以及超声条件下的cd@ti3c2异质结均表现出一定的细胞毒性。超声和nir-ii共同照射下的cd@ti3c2异质结表现出了明显的细胞毒性。

由图7可知，得到的cd@ti3c2异质结在温和的激光照射以及低强度的超声条件下可以产生大量的活性氧。

由图8可知，cd@ti3c2异质结在温和的激光照射以及低强度的超声条件下可以将4t1肿瘤完全消融。

综上，本发明制备的碳点/碳化钛异质结声敏剂能够解决改善电子-空穴对快速复合的缺点，从而增强其在超声条件下产生ros的能力，以达到肿瘤治疗的理想效果。此外，本发明制备的碳点/碳化钛异质结声敏剂在近红外激光下有良好的光热转换效率，通过温和的激光辐射治疗可以改善肿瘤微环境，进一步提高异质结声敏剂在癌症声动力治疗中的效果。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制；凡本行业的普通技术人员均可按以上所述顺畅地实施本发明；但是，凡熟悉本专业的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，利用以上所揭示的技术内容而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变等，均仍属于本发明的技术方案的保护范围之内。