专利名称：动物胸腺生长因子口服液的制作方法
技术领域：
本发明涉及从健康幼龄动物新鲜胸腺中提取的胸腺生长因子的无菌水溶液制剂领域。
胸腺是机体的中枢免疫器官，是T细胞发育分化的场所。已有实践表明，胸腺中有免疫增强作用的多种激素和免疫抑制作用的因子，这两类功能相对的因子，共同担负着机体细胞免疫功能的调节作用。
动物胸腺，特别是从健康幼龄动物(乳猪、乳牛或其它幼龄动物)的新鲜胸腺中提取的具有生物活性的中小分子量的胸腺生长因子能明显促进成纤维细胞，内皮细胞的增殖，对胃溃疡有明显的促愈合作用，在治疗消化性溃疡及创伤愈合方面可取得疗程短，愈合率高，复发率低的良好效果，其临床应用、开发前景可观。
本申请人已经就此技术向中国专利局提出了题为《幼龄动物胸腺生长因子及其提取分离方法》的发明专利申请。
本发明的目的是，为了满足上述治疗消化性溃疡及创伤愈合临床应用的急需，而提供的动物胸腺生长因子口服液，该口服液能明显促进成纤维细胞，内皮细胞增殖；刺激消化性溃疡受损组织局部表皮细胞再生、修复，本品适用于胃、十二指肠溃疡患者的治疗。
本发明特征如下1、本发明提供的动物胸腺生长因子口服液系以健康幼龄动物(乳猪、乳牛或其它幼龄动物)新鲜胸腺中提取的具有生物活性的中小分子量的蛋白类无菌水溶液，分子量小于60KD，每瓶蛋白含量为标示量的90.0-110.0％，标示量为5mg/ml。活性单位大于1200单位，活力比值为2.0以上。
上述制品原材料为新鲜幼龄动物胸腺，特别是离体6小时之内的乳猪，乳牛胸腺。在选材过程中，发现胸腺有包囊或结节，质地粗糙，色泽不正常或有异常气味及离体超过6小时者均不符合选材的质量标准。
2、本发明提供的动物胸腺口服液为淡黄色澄清透明液体。
3、本口服液用水稀释成30-50ug/ml的溶液，照分光光度法(按中国药典1990年版二部附录24页)测定，在257±2nm波长处有最大特征吸收峰，在236±2nm波长处有最小特征吸收峰，最大吸收度与最小吸收度的比值为1.45以上。
本品中加双缩脲试剂，混匀，即呈紫瑾色。
4、pH值为5.5-6.5。
5、核酸含量＜0.7mg/ml游离氨基酸含量＜5mg/ml6、本品的电泳分子量(用SDS-PAGE电泳法)，应不少于5条蛋白电泳带，分子量在12-55KD之间，其效果最佳。
本品通过凝胶过滤柱作组分分离，HPLC组份测定应出现3个特征吸收峰，三个特征吸收峰相对百分面积总和在70-90％之间。
本口服液的作用与用途能明显促进内皮细胞及成纤维细胞增殖；刺激消化性溃疡受损组织局部表皮细胞再生、修复；本品适用于胃、十二指肠溃疡患者的治疗。
本口服液的用法与用量
胃、十二指肠溃疡患者口服，每日2次(早晚各一次)每次一瓶(30mg/6ml)。15天为一疗程。
规格每6ml含30mg，5mg/每瓶，活性单位≥1200单位。
储藏严封，在室温阴凉处保存。
有效期室温条件下保存1年。
下面介绍本口服液中有效成份的测定方法及结果1、蛋白含量的测定对照品溶液的制备精密称取牛血清白蛋白标准品100mg，置100.0ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10.0ml，置100.0ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀即得。
标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8及1.0ml，分别置具塞试管中，并加水使成1.0ml，每管各加碱性铜试液5.0ml，摇匀，室温放置10分钟，再依次快速加入酚试剂0.5ml，立即摇匀，置水浴(30℃)中保温30分钟，取出，放冷至室温，以对照品溶液0.0ml管作空白，照分光光度法(中国药典1990年版二部附录24页)，在680nm波长处测定吸收度。以吸收度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
测定法精密量取样品溶液5.0ml置100.0ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。精密量取10.00ml，置50.0ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。精密量取稀释液1.0置具塞试管中，照标准曲线制备项下自“加碱性铜试液”起至测定吸收度，从标准曲线上读出供试品中蛋白质的含量，计算。
应用LOWRY法检测样品8批，其蛋白含量范围为标示量(5mg/ml)的98-106％之间，结果见表1。所以本品规定蛋白含量为标示量的90.0-110.0％。
表1为本口服液8批样品蛋白含量测定结果样品批号 蛋白含量(mg/ml)为标示量％920620 5.1102.0920821 4.9 98.0921222 5.2104.0930301 5.1102.0930602 5.3106.0950301 5.1102.0950701 5.3106.0950702 4.9 98.02、用紫外吸收法测定本口服液的核酸含量(1)取2支离心管，每管各加入2.0ml待测的样品溶液，再向甲管内加2.0ml蒸馏水，向乙管内加2.0ml沉淀剂。混匀，在冰浴(或冰箱)中放置30分钟，3000r/min，离心10分钟。将甲、乙两管的上清液分别稀释至光密度值在0.1-1.0之间。选用光程为1厘米的石英比色杯，在260nm波长下测其光密度。
(2)计算 沉淀剂钼酸铵一过氯酸试剂2.15mol/L(0.25％)钼酸铵溶于0.24mol/L(2.5％)过氯酸中。如配200ml，即在193ml蒸镏水中加入7ml6.97mol/L(70％)过氯酸和0.5克钼酸铵。
因本品系从胸腺中经超滤提取的中小分子蛋白类口服液，其中肯定含有少量的核酸类物质，根据生产工艺的实际情况和该物质的存在又不影响本品药效及引发副反应的特点，故不必专门弃除。但应作为常规含量测定项目之一控制和规定其限量，利于保证本品质量。根据8批样品测定结果(见表2)，限量规定小于0.7mg/ml。
表2为8批本口服液含核酸总量测定结果。
表2如下批 号 核量含量(mg/ml) 平均值920620 0.400 0.430 0.6110.480920821 0.630 0.590 0.6200.613921222 0.540 0.570 0.5800.563930301 0.640 0.620 0.6100.623930602 0.510 0.500 0.5200.510950301 0.540 0.560 0.5700.556950701 0.640 0.610 0.6000.616950702 0.590 0.600 0.6100.6003、游离氨基酸的测定因本品是用超滤工艺提取的中小分子混合物，故增加检查游离氨基酸作为本品质量控制的另一项指标是必要的，根据8批样品测定结果(见表7)其含量均在4-5mg/ml之间，故应将游离氨基酸含量规定小于5mg/ml为宜。
表7.游离氨基酸含量测定结果批 号游离氨基酸含量(mg/ml)920620 4.72920821 4.32921222 4.58930301 4.51930602 4.55950301 4.56950701 4.18950702 4.01
4、活力的测定本品治疗消化性溃疡是通过营养局部受损粘膜并促进表皮细胞、成纤维细胞再生而达到治疗目的，因此，测定本品促细胞增殖效应是考核和鉴测其药效学的一个重要指标。
本标准选用Balb/c或Swiss小鼠3T3成纤维细胞进行体外培养，以不同浓度的本品加入培养孔内，加入[3H]-胸腺嘧啶苷核(3H-TRD)进行体外细胞DNA合成掺入。经一段时间后，溶解细胞，提取DNA，在液体闪烁仪上计数[3H]-TdR掺入的cpm值)，与对照组相比较，以此反映本品活性。
供试品溶液的配制精密量取样品溶液适量，用培养基稀释成10-1、10-2及10-3溶液，混匀，即得。
细胞培养取Balb/C或Swiss小鼠3T3成纤维细胞，接种于方瓶内，用培养基常规培养及传代。
测定法取生长良好的3T3细胞，用0.25％胰酶消化，并用培养基配成4×104个/ml细胞悬液。
取48孔培养板1块，每孔接种细胞悬液0.5ml。置5％CO2培养箱，37℃培养10小时后，换0.2％小牛血清的DMEM培养基，每孔0.5ml。继续培养36小时，加供试品溶液(10-1、10-2、10-3)50ul，每个浓度设3个孔。对照组设3个孔，每孔加培养基50ul。培养12小时后加入[3H]-TRD，每孔ZuCi(20ul)，再培养24小时后，去掉培养基，用生理盐水洗2次，加甲醇固定2次，每次5分钟；加水洗二次后，加5％三氯乙酸二次，每次固定15分钟，再用水洗二次；用0.5mol/LNaOH 20ul溶解细胞，30分钟后溶解液加到滤膜上，红外灯下烤干，置含3ml闪烁液(0.01％POPO，0.4％PPO二甲苯溶液)的测定瓶中，于LKB2215液闪仪上测定每分钟脉冲数(cpm)，按下式计算样品组cpm值与对照组cpm组的比值，即得。 根据生物制品活性单位的制定原则，我们将每瓶蛋白含量(W)与该样品活力比值(X)＞2.0时最大稀释度的检测含量(m)的比值定为每瓶样品的活力定量单位(U)，即 下列表3为8批本口服液促3T3细胞增殖的cpm值检测结果。
表3如下批 号样品检测 CPM值 活力比值**P浓度(mg/ml) X±SD(n＝3)9206025×10-38031.1±781 2.7 ＜0.059206205×10-31413.7±788 2.5 ＜0.059212225×10-36158.4±270 2.2 ＜0.05*Ctr. 2635.1±1369405285×10-37954.0±765 2.2 ＜0.059407205×10-38052.1±785 2.2 ＜0.059408265×10-37504.3±562 2.1 ＜0.05Ctr. 3618.0±1869507025×10-3348.7±33.2 3.1 ＜0.059505075×10-3326.1±132.0 1.9 ＜0.05Ctr. 101.3±32.7注*Ctr.为每次试验时所设阴性对照样，即含0.2％小牛血清的DMEM培养液，试验均在每批样品分装后12个月内进行；**P值所示大小表示每次试验样品CPM值与对照样比较差异的显著性。
表3结果显示，8批本口服液在同一稀释度的检测浓度时，经三次试验测定，各批样品的CPM值与对照样比较均具有显著性差异(P＜0.05)，表明本口服液有较强的促细胞增殖活性。各批样品的活力比值均在1.9以上，950507批样品在X＝1.9时，其CPM值与对照组比较，经统计处理已具有显著性差异，即t＝2.857＞t0.05(2.78)，P＜0.05。因此，我们将检测样品活力比值(X)为2.0以上定为活力呈阳性的标准。
表4为8批本口服液(30mg/瓶)活力比值及活力单位检测结果。
表4批 号 活力比值(X)活力单位/瓶*5×10-15×10-25×10-35×10-49206022.7 11.4 2.7 1.31.2×1049206203.8 10.4 2.5 1.11.2×1049212224.6 9.4 2.2 1.01.2×1049405281.8 3.6 2.2 1.51.2×1049407202.0 4.3 2.8 1.41.2×1049408261.9 4.3 3.6 1.21.2×1049507011.6 9.7 3.2 3.11.2×1059507021.8 10.6 3.1 1.91.2×104注*5×10-1为检测样品稀释终浓度(mg/ml)。
表4.所示活力比值及活力单位均为各批样品在成品分装后12个月内的试验结果。尽管样品在不同条件、储存不同时间后，活力单位有一定程度的衰减，但根据动物药效学试验研究结果提示，活力比值X≥2.0时的样品最大稀释度不应低于1∶100(5×10-2mg/ml)即活力单位≥1200u/瓶时，本品均具有显著的促实验性胃溃疡愈合的药效学作用。因此，在质量控制上，我们将活单位为1200u/瓶定为本口服液活力检测值的最低限度。规定每瓶样品活力检测的质量标准应为1200u/瓶以上。
5、分子量范围的测定本口服液为中小分子量蛋白质，经离子交换柱分离纯化，我们获得9个组份峰，其中峰1至峰5有明显促细胞增殖活性，经电泳证实，各活性峰分子量均在12-55KD范围之内。为控制工艺的稳定性，我们将本品进行SDS-PAGE检测，确定本品的分子量范围，以作为本品的工艺流程控制指标，经电泳，5批样品结果均显示在分子量12-55KD范围内，分子量分别为55KD、40KD、33KD、31KD、23KD、16KD、1.2KD，因此我们规定本品的电泳分子量应在12-55KD之间，且不少于5条带。
表5为5批本口服液样品的SDS-PAGE电泳测定分子量结果。
表5样品批号 分子量范围 电泳带数930301 12KD，16KD，31KD，33KD，55KD 5930602 12KD，16KD，31KD，33KD，40KD，55KD 6950301 12KD，16KD，23KD，31KD，55KD 5950701 12KD，16KD，23KD，31KD，33KD，55KD 6950701 12KD，16KD，31KD，33KD，55KD 56、HPLC组份测定
本口服液是一组中小分子量的蛋白质，国内外尚无相同的标准可寻，且本品属蛋白质类物质，故不宜按常规的C18反相柱检测，经过反复实验筛选，选择出蛋白凝胶过滤柱进行检测为好，按本法实验，本品在规定色谱条件下有5个组份吸收峰，其中峰1、2、3有显著促进细胞增殖活性，峰4、峰5促细胞增殖效应不稳定。因此我们将本口服液原液通过凝胶过滤柱作组份分离，收集活性峰1、2、3作为对照品，用于控制本口服液成品中的活性组份含量。经用HPLC对6批样品检测，峰1，峰2，峰3的相对百分面积总和均在百分之七十至九十之间。见表6，而且以后生产的每批样品均应与提供的对照品作对照，符合者为合格。
表6为6批本口服液HPLC图谱数据检查表6样品批号 峰号 占总面积(％)930301 1，2，3 79.35930601 1，2，3 75.51950301 1，2，3 74.86950401 1，2，3 80.60950701 1，2，3 74.43950702 1，2，3 80.38标准品 1，2，3 100本口服液能明显促进内皮细胞、上皮细胞及成纤维细胞增殖，刺激消化性溃疡受损组织表面粘膜及创伤表面上皮细胞再生、修复。适用于胃、十二指肠、结肠、口腔溃疡及烧伤、皮肤糜烂患者的治疗。
根据初步稳定性试验结果，本口服液在4℃条件下储藏，其生物学活性及药效指标在24个月时仍稳定，室温阴凉条件下储藏，稳定期为12个月以上。而在较高温度条件下，其活性及药效在短期内(60天)仍可保存，故本品暂规定，室温阴凉条件下储藏有效期12个月。
下面介绍本口服的鉴别1、照分光光度法，本口服液在257±2nm及236±2nm波长处分别有最大及最小特征吸收峰，最大吸收度与最小吸收度的比值为1.45以上，见表8。因此，以此特征吸收峰来鉴别本品真伪。
表8为8批本口服液分光光度法鉴别测定结果。
表8吸收值样品批号(257±2nm) (236±2nm) 比值920620 0.2794 0.1817 1.512920821 0.8552 0.5621 1.521921222 0.7709 0.5057 1.524930301 0.6217 0.3177 1.510930602 0.9194 0.6192 1.480950301 0.5070 0.3316 1.520950701 0.9052 0.5120 1.460950702 1.0333 0.6881 1.5002、蛋白定性本口服液以乳牛、乳猪等新鲜胸腺为原料，超滤提取制得的物质主要是中小分子量蛋白类物质，故经蛋白质定性检查应为阳性。蛋白质检查方法很多，如沉淀法、显色法、电泳法、蛋白试纸法等。双缩脲法灵敏、简便，便于判断结果。故本品采用双缩脲法检查蛋白质，以作为质量定性的初步鉴别。本口服液样品8批，经蛋白质定性检查均呈阳性反应(见表9)。
表9为9批本口服液蛋白定性检查结果。
表9样品批号 双缩脲反应920620 阳性920821 阳性921222 阳性930301 阳性930602 阳性950301 阳性950701 阳性950702 阳性3、酸碱度检查酸碱度是保持物质活力稳定的内环境，8批样品加溶液稀释后，测得pH在5.5-6.5之间(见表10)。根据临床用药安全要求及生产实际，故将本品酸碱度规定为pH5.5-6.5之间。
表10为8批赛姆斯pH值测定结果。
表10样品批号 pH值(三次测定)平均值9206205.8，5.9，5.9 5.879208216.0，6.1，5.9 6.009212225.8，6.1，6.0 5.979303016.1，6.2，5.9 6.079306026.1，6.2，6.3 6.209503016.2，6.1，6.1 6.139507016.3，6.1，6.2 6.209507025.8，6.0，6.1 5.97
4、卫生学检查本口服液为高营养的蛋白质类口服液制剂，为防止在超滤除菌及其它工序中被污染，以便室温条件下储存，故应做卫生学检查。8批样品经检查发现均符合口服液标准，见表11。
表11为8批本口服液卫生学检测结果。
表11样品批号 大肠菌群 细菌总数致病菌(个/100ml) (个/ml)920620 ＜3 0未检出920821 ＜3 0未检出921222 ＜3 0未检出930301 ＜3 0未检出930602 ＜3 0未检出950301 ＜3 0未检出950701 ＜3 0未检出950702 ＜3 0未检出
权利要求
1.动物胸腺生长因子口服液，其特征在于本口服液为从健康幼龄动物(乳猪、乳牛或其它幼龄动物)新鲜胸腺中提取的具有生物活性的中小分子量的蛋白质无菌水溶液，分子量小于60KD，每瓶蛋白质含量为标示量的90.0-110.00％，其标示量为5mg/ml，活性单位大于1200单位，活力比值为2.0以上。
2.按权利要求1所述的动物胸腺生长因子口服液，其特征在于口服液的原材料即新鲜幼龄动物胸腺离开动物原体时间不得超过6小时，在选材过程中，发现胸腺有包囊或结节、质地粗糙、色泽不正常或有异常气味及离体时间超过6小时者均不符合本口服液选材的质量标准。
3.按权利要求1所述的动物胸腺生长因子口服液，其特征在于口服液为淡黄色澄清透明液体。
4.按权利要求1所述的幼龄动物胸腺口服液，其特征在于本口服液用水稀释成30-50ug/ml的溶液，照分光光度法测定，在2 57±2nm波长处有最大特征吸收峰，在236±2nm波长处有最小特征叹收峰，最大吸收度与最小叹收度的比值为1.45以上。本品中加双缩脲试剂，混匀，即呈紫瑾色。
5.按权利要求1所述的动物胸腺生长因子口服液，其特征在于本口服液中核酸含量＜0.7mg/ml，游离氨基酸含量＜5mg/ml。
6.按权利要求1所述的动物胸腺生长因子口服液，其特征在于本口服液的电泳分子量在12-55KD之间，应不少于5条蛋白电泳带。
7.按权利要求1所述的动物胸腺生长因子口服液，其特征在于本口服液通过凝胶过滤 作组分分离HPLC组份测定应出现3个特征吸收峰，三个特征吸收峰相对百分面积总和在70-90％之间。
全文摘要
本动物胸腺生长因子口服液是一种从健康幼龄动物(乳猪、乳牛或其它幼龄动物)新鲜胸腺中提取的具有生物活性的中子分子量的蛋白质无菌水溶液，分子量小于60KD，每瓶蛋白含量为标示量的90.0-11.0％，活性单位大于1200单位，活性比值为2.0以上，能明显促进成纤维细胞，内皮细胞的增殖，对溃疡及创伤愈合有明显促愈合作用，在治疗消化性溃疡及创伤愈合方面可取得疗程短、愈合率高、复发率低的良好效果，临床应用、开发前景可观。
文档编号A61K35/26GK1148959SQ9511765
公开日1997年5月7日 申请日期1995年10月20日 优先权日1995年10月20日
发明者陈光明, 杨富强, 王东晓 申请人:中国人民解放军第四五八医院