专利名称：Hhv8的mip同源物在防治艾滋病的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及HHV8的MIP同源物的用途，尤其涉及在防治艾滋病的药物中的应用。
自从美国疾病控制中心流行病学专家于1981年在美国首先发现艾滋病，1983-1984年分离到HIV以后，人类抗艾滋病研究已经历了近二十年，由于无有效控制措施，HIV在全球讯速播散，据世界卫生组织98年调查报告，现今每天约有16000人感染HIV，而且艾滋病的严重威胁在青少年。因在治疗上没有特效药物，艾滋病死亡率仍为100％。我国艾滋病流行之快更令人担忧，由于人口密集，HIV携带者正逐年成倍增加，遍布全国各省市，而且社会不能有效监管这些HIV带毒者，使他们在社会上继续传播。我国带毒者的迅速增加已构成了日后艾滋病爆发的根源。因此，发明预防和治疗艾滋病的药物是医学界迫切解决的课题。
目前艾滋病防治方面主要用针对HIV的有关疫苗。由于HIV基因变异问题，特别是编码外膜蛋白的env基因的高度变异，使得HIV能逃避免疫系统的临视，这是HIV疫苗研制的主要障碍。应用各类基因工程抗原或无活病毒免疫动物和人体，产生的体液或细胞免疫都是型(Type)特异性的，似乎不能得到具有广泛保护性的疫苗抗原。尽管已证明各类疫苗抗原可以刺激其特异性体液或细胞免疫，但究竟哪一种具有保护作用还不很清楚。除了HIV基因的高度变异不断导致“新抗原”的出现外，也由于HIV长期的潜伏感染，不表达或仅表达少量病毒结构蛋白，造成“无抗原”状态，这些因素导致了HIV很易逃脱机体的免疫监视，其结果使机体免疫系统处于一种相对无能状态。因此，单纯应用疫苗防治艾滋病效果不理想。
基于近年对HIV辅助受体感染机制的阐明，尤其是近两年陆续发现的一些辅助受体的变异可阻止艾滋病的发病，目前研究者正加紧从辅助受体和趋化因子(作为此辅助受体的配体)两方面寻找HIV感染的防治药物，包括①受体功能抑制剂；②受体的中和抗体，因为gp120与CCR5的结合对中和抗体非常敏感；③改造的趋化因子，人们希望经改造的趋化因子只封闭受体而不激活受体，即不影响机体功能，是目前最为理想的抗HIV药物研究方案。
有关作用于HIV辅助受体方面的药物，包括上述提到的受体中和抗体和趋化因子类物(受体的配体)；在趋化因子类物中有正常的人源趋化因子和变异的RANTES。这些新型药物目前均在试验中，尚未见其他来源的趋化因子类物用于艾滋病的防治。
人疱疹病毒8，英文为Human herpesvirus 8，属于γ2疱疹病毒，是HIV感染者或移植病人用免疫移植剂后常发生的一种恶性血管内皮细胞增生即Kaposis肉瘤得病原菌。1996年测序成功，至今已对此病毒编码的Bcl-2、Cyclin D、GPCR等类似与人源蛋白的病毒产物进行了较多研究。此病毒尚编码的人MIP类似物，MIP为单核细胞炎症蛋白，英文为Mononuclecyte inflammatory protein，是人体CC类趋化因子，其受体主要为单核细胞表面的CCR5。目前对此病毒所编码的人MIP类似物的功能尚未见任何文献报道。
本发明的目的在于提供HHV8的MIP同源物的新用途，即人疱疹病毒8的趋化因子基因分子产物在防治艾滋病药物中的新应用。
本发明所公开的HHV8所编码的类似于人的MIP，具有封闭趋化因子受体但不具备人MIP功能，在防治艾滋病药物中可成为理想的HIV辅助受体拮抗剂(
图1所示)。
HHV8的开放读框K4编码的蛋白产物vMIP-II类似于人MIP-1β，其核苷酸序列和氨基酸序列如下。
K4核苷酸序列，长度为285bp1 atggacacca agggcatcct gctcgtcgct gtgctgactg ccttgctttg tttgcaatct61 ggggacacgc tgggagcgtc ctggcataga ccggacaagt gctgtctcgg ttaccagaaa121 agaccattac cacaggtgct tctgtccagc tggtacccca cctcccaact gtgcagcaag181 ccgggtgtga tatttttgac aaagcgtggt cgccaggtgt gtgccgacaa atcgaaagac241 tgggtgaaga agctgatgca gcaattacca gtcactgctc gctgaK4氨基酸序列(94个氨基酸)ORF K4(macrophage inflammatory protein vMIP-II homolog)MDTKGILLVAVLTALLCLQSGDTLGASWHRPDKCCLGYQKRPLPQVLLSSWYPTSQLCSKPGVIFLTKRGRQVCADKSKDWVKKLMQQLPVTARHHV8开放读框K6编码的蛋白产物vMIP-I类似于人MIP-1α，其核苷酸序列和氨基酸序列如下。
K6核苷酸序列，长度为288bp1 atggcccccg tccacgtttt atgctgcgtt agcgtactgc ttgccacgtt ttacctgacg61 cccacagaaa gcgcggggtc actcgtgtcg tacacgccta atagctgctg ctacgggttc121 cagcagcacc caccgcccgt ccaaattcta aaagagtggt atcccacgtc cccagcgtgc181 ccaaaacccg gagttatttt gctgaccaag cgagggcgtc agatctgcgc agacccttcc241 aaaaactggg ttaggcagct gatgcagcgg ctgcctgcca tagcttagK6的氨基酸序列(95个氨基酸)ORF K6 protein(functional macrophage inflammatory protein vMIP-I homolog)MAPVHVLCCVSVLLATFYLTPTESAGSLVSYTPNSCCYGFQQHPPPVQILKEWYPTSPACPKPGVILLTKRGRQICADPSKNWVRQLMQRLPAIA这些病毒基因与人源基因具有高度同源性，而且保留人源基因的功能结构区。所以在理论上这些病毒类似物可以结合相应的人源受体，即K6的蛋白产物vMIP-I可以与人MIP-1α的受体(分布于单核、淋巴细胞膜上的CCR5、CCR4、CCR5)相结合，K4的蛋白产物vMIP-II可以与人MIP-1β的受体(分布于单核细胞膜上的CCR5)结合。由于各种人源趋化因子之间均具有相似的功能区和较高的基因同源性，vMIP-I和vMIP-II有可能结合多种人源趋化因子的受体。实验证明HHV8的MIP同源物具有高效地竞争结合HIV辅助受体，且不引起宿主细胞粘附反应释放介质等人源趋化因子的功能。
K4编码的vMIP-II(A)与人MIP-Iβ(B)氨基酸残基相似比较如下A31 PDKCCLGYQKRPLPQVLLSSWYPTSQLCSKPGVIFLTKRGRQVCADKSKDWVKKLMQQL 89P CC Y R LP+ + +Y TS LCS+P V+F TKR +QVCAD S+ WV++ + LB31 PTACCFSYTARKLPRNFVVDYYETSSLCSQPAVVFQTKRSKQVCADPSESWVQEYVYDL 89K6编码的vMIP-I(A)与人MIP-Iα(B)氨基酸残基相似比较如下A27 SLVSYTPNSCCYGFQQHPPPVQILKEWYPTSPACPKPGVILLTKRGRQICADPSKNWVRQLMQRL 91SL + TP +CC+ + P + +++ TS C KPGVI LTKR RQ+CADPS+ WV +++ LB2 SLAADTPTACCFSYTSRQIPQNFIADYFETSSQCSKPGVIFLTKRSRQVCADPSEEWVQKYVSDL 66实际上HHV8的K4、K6编码的vMIP与多种人源趋化因子具有相似性，由共同的-CC-膜体，在EBEL的CLUTALW软件中检到vMIP-I、vMIP-II与人MIP-1α、LD78αβ、SCYA3、MCP等的同源性如下。
vMIP-II-MDTKGILLVAVLTALLGLQSGDTLGASW-HRPDKCCLGYQKRPLPQVLL 48vMIP-T MAPVHVLCGVSVLLATFYLTPTESAGSLVSYTPNSCCYGFQQHPPPVQIL 50LD78αβ ------ALAVLLCTMAGCNQFSASLAA---DTPTACCFSYTSRQIPQNFM 41SCYA3 MQVSTAALAVLLCTMALCNQFSASLAA---DTPTACCFSYTSRQIPQNFI 47MIP-1α----------------------ASLAA---DTPTACCFSYTSRQIPQNFI 25-----------------SLPAMAPYGA---DTPTACCFSYS-RKIPRQFI 29. .: * ** .: : * ::
vMIP-1I SSWYPTSQLCSKPGVIFLTKRGRQVCADKSKDWVKKLMQQLPVTAR 94vMIP-I KEWYPTSPACPKPGVILLTKRGRQICADPSKNWVRQLMQRLPAIA- 95LD78αβ ADYFETSSQCSKPSVIFLTKRGRQVCADPSEEWVQKYVS------- 80SCYA3ADYFETSSQCSKPGVIFLTKRSRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA- 92MIP-1α ADYFETSSQCSKPGVIFLTKRSRQVCADPSEEWVQKYVSDLELSA- 70Exon 3 VDYFETSSLCSQPGVIFLTKRNRQICADSKETWVQEYITDLELNA- 74.:: ** *.:*.**:****.**:*** .: **:: :
BLAST软件检查到的与vMIP-II(K4)相似的人源趋化因子或小分子细胞因子有
本发明具有如下突出的优点1、本发明为预防与治疗艾滋病开辟了一条新途径。用病毒来源的基因产物封闭HIV感染的辅助受体，具有不引起宿主细胞粘附反应、释放介质等人源趋化因子的功能。从目前的试验看，此病毒来源的趋化因子可特异高效地封闭HIV辅助受体，不引起细胞粘附反应等优点，而其他人源趋化因子虽封闭HIV辅助受体，但也引起不必要的细胞粘附等功能反应。所以人疱疹病毒8的这两种病毒性MIP在趋化因子类物质防治HIV感染中具有明显的优点和较好效果，使有效控制艾滋病成为可能。
2、人疱疹病毒8的这两种病毒性MIP可单独用作HIV辅助受体的阻断剂，也可与其他药物联合应用。
3、人疱疹病毒8的这两种病毒性MIP均为小分子肽，极少引起机体的免疫反应。
4、实现本发明前景好，可以用基因工程方法和化学合成等方法得到纯的vMIP-I和vMIP-II蛋白，或通过诱变等方法制得它们的突变体以提高药用效果。这些基因工程等生物技术难度不大，根据目前技术水平在制药工业上能够工业化生产。
5、本发明所用的基因工程生产重组蛋白技术较成熟、成本低廉、终产物为分泌型蛋白故工艺程序较简单。
图1为病毒MIP同源物阻断HIV进入宿主细胞的示意图。
通过如下实施例及其附图对本发明作进一步的描述。
一、实验证明K4或K6的基因表达产物具有结合HIV辅助受体的作用，如图1所示，vMIP-I和vMIP-II通过与HIV的辅助受体如CCR5结合，从而阻断HIV感染进入宿主细胞内。试验过程的结果如下1、应用计算机软件Primer3设计的HHV8开放读框K4、K6全长基因的引物为K4 5’-atggacaccaagggcatcc--3’(5’端引物)5’-tcagcgagcagtgactggtaa--3’(3’端引物)K6 5’-atggcccccgtccacgtttt--3’(5’端引物)5’-ctaagctatggcaggcagc--3’(3’端引物)并分别用BLAST软件检查无人源相似序列。
2、从一淋巴瘤细胞株BCBL(证实有HHV8病毒，而无EB病毒感染)基因组DNA中扩增出全长K4或K6基因片断，约290bp。T/A法将K4或K6片段克隆于扩增载体pUC19质粒。将酶切纯化后的K4或K6片断用ABI377测序仪自动测序。并将K4或K6片断用于PCEP4载体构建，K4克隆于BamHI位点，K6克隆于XhoI位点，得到PCEP4-K4或PCEP4-K6哺类细胞表达载体。
5、用脂质包裹法转染PCEP4-K6载体到NIH3T3的细胞，潮霉菌素选择得到稳定表达体系。
6、用RT-PCR法测得转染的3T3细胞有K6的mRNA的转录。
7、密度梯度(Ficoll-Hypaque)离心法分离正常人外周血淋巴细胞，含10％小牛血清的1640培养基在37℃，8％CO2，30min条件下培养以分离单核细胞。
8、配体-受体结合实验用转染及未转染(作为对照)K6的NIH3T3细胞的培养上清液(换液后24h)作为条件培养基及正常PRMI1640培养基培养的外周血单核细胞与I125标记的人源趋化因子MIP-Iα(10cpm/ml)共同孵育37℃、60min，用含2mg/ml葡萄糖和1mg/ml BSA的PBS洗去未结合的I125-MIP-Iα。γ计数测得三种培养条件下单核细胞的I125结合率。结果表明，在用转染K6的条件培养基的细胞I125吸收率明显地降低(见表1)说明转染K6的3T3细胞培养液的vMIP-I(K6基因产物)可与I125-MIP-Iα竞争结合受体。
表1 I125-MIP-Iα和vMIP-I在外周血单核细胞的配体结合率(％)培养基PRMI 1640培养基 3T3细胞的条件培养基未转染K6 转染K6I125结合率(％) 64+9 17±2 61±8表中数值为3次实验的平均结果9、外周血单核细胞对细胞间粘附分子(Intercellular Adhesion Molecular-1，ICAM)的粘附实验外周血单核细胞用10μg/ml CD3单克隆抗体(New EnglandBioLabs Inc.)共同孵育过夜后，以105细胞/孔密度接种于ICAM(以约1000个点/mm3，4℃过夜)包被的96孔培养板，37℃，孵育不同时间后，洗去未结合细胞，在高倍镜下计数每孔细胞数，每组8个孔，计算结合细胞占输入细胞总数的百分率。重复实验三次(表2)。
表2 vMIP-I和rhMIP-Iα引起的外周血单核细胞对ICAM的粘附率(％)时间(min) 0 510 15 20vMIP-I 5.1±1.37.8±2.1 6.5±1.84.9±2.47.1±2.3rhMIP-Iα 5.0±1.542.1±3.1 59.7±6.5 50.2±6.0 44.8±4.2表中数值为3次实验的平均结果10、重组的K4表达载体与K6同样的方法证明其表达产物可以与I125-MIP-Iα竞争外周血单核细胞的受体，且无细胞粘附的作用。
以上实验初步证明，HHV8的K4和K6基因产物vMIP-II和vMIP-I均可以结合外周血单核细胞MIP-Iα的受体(CCR5)，而且不引起细胞粘附反应。由于CCR5是HIV感染的共受体，所以，MIP-I具有抑制HIV与CCR结合的作用。艾滋病的特征为HIV病毒的快速增殖并感染淋巴细胞而导致的机体免疫功能减弱，抑制HIV与其共受体(CCR5)的结合，对艾滋病具有预防和治疗的作用。
二、HHV8的K4和K6基因重组蛋白vMIP-II和vMIP-I的基因工程载体的构建。
将HHV8的K4和K6基因片段分别再克隆于杆状病毒表达载体pBlueBacIIIHisA，在其多角体读框下游的BamH1(K4)或XhoI(K6)位点连入K4或K6基因片段，转化大肠杆菌，蓝白斑实验鉴定转化菌落，以单菌落再扩增，制备重组质粒。重组质粒与线性化杆状病毒AcMNPV以脂质体法共转染单层培养的SF9细胞，培养2天后蚀斑实验筛选重组病毒，再转入SF9细胞培养，以培养上清液(MIP为分泌型蛋白)测蛋白质浓度、电泳分析，以及用试剂盒提供的重组病毒引物鉴定重组蛋白。经此双重鉴定的重组病毒作为种液以用于大量扩增生产。重组蛋白的纯化因其有6个组氨酸尾，故用镍螯合树脂亲和层析法进行纯化(NTA介质填料，Pharmacia Biotech公司)。电泳分析所得产物为K4或K6的表达蛋白vMIP II或vMIP I。
所得蛋白分子量约为9KD，同样方法测得此重组K4或K6蛋白具有与人源I125-MIP-Iα竞争结合外周血淋巴细胞受体作用，竞争结合抑制率为80％左右，并不引起细胞粘附反因。
通过此杆状病毒-昆虫细胞表达系统获得的K4或K6的重阻蛋白vMIP-II或vMIP-II可以封闭HIV的辅助受体，具有防治艾滋病的作用，并有高效生产、成本较低等基因工程生产的特点。
权利要求
1.HHV8的MIP同源物在防治艾滋病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的HHV8的MIP同源物在防治艾滋病的药物中的应用，其特征在于有如下核苷酸序列和氨基酸序列的HHV8的K4读框编码的vMIP-II蛋白产物在防治艾滋病的药物中的应用K4核苷酸序列，长度为285bp1 atggacacca agggcatcct gctcgtcgct gtgctgactg ccttgctttg tttgcaatct61 ggggacacgc tgggagcgtc ctggcataga ccggacaagt gctgtctcgg ttaccagaaa121 agaccattac cacaggtgct tctgtccagc tggtacccca cctcccaact gtgcagcaag181 ccgggtgtga tatttttgac aaagcgtggt cgccaggtgt gtgccgacaa atcgaaagac241 tgggtgaaga agctgatgca gcaattacca gtcactgctc gctgaK4氨基酸序列(94个氨基酸)ORF K4(macrophage inflammatory protein vMIP-II homolog)MDTKGILLVAVLTALLCLQSGDTLGASWHRPDKCCLGYQKRPLPQVLLSSWYPTSQLCSKPGVIFLTKRGRQVCADKSKDWVKKLMQQLPVTAR
3.根据权利要求1所述的HHV8的MIP同源物在防治艾滋病的药物中的应用，其特征在于有如下核苷酸序列和氨基酸序列的HHV8的K6读框编码的vMIP-I蛋白产物在防治艾滋病的药物中的应用K6核苷酸序列，长度为288bp1 atggcccccg tccacgtttt atgctgcgtt agcgtactgc ttgccacgtt ttacctgacg61 cccacagaaa gcgcggggtc actcgtgtcg tacacgccta atagctgctg ctacgggttc121 cagcagcacc caccgcccgt ccaaattcta aaagagtggt atcccacgtc cccagcgtgc181 ccaaaacccg gagttatttt gctgaccaag cgagggcgtc agatctgcgc agacccttcc241 aaaaactggg ttaggcagct gatgcagcgg ctgcctgcca tagcttagK6的氨基酸序列(95个氨基酸)ORF K6 protein(functional macrophage inflammatory protein vMIP-Ihomolog)MAPVHVLCCVSVLLATFYLTPTESAGSLVSYTPNSCCYGFQQHPPPVQILKEWYPTSPACPKPGVILLTKRGRQICADPSKNWVRQLMQRLPAIA
全文摘要
本发明涉及HHV8的同源物在制药领域中的新用途,尤其涉及在防治艾滋病的药物中的应用。本发明用HHV8的K6(vMIP-Ⅰ)、HHV8的K4(vMIP－Ⅱ)来源的基因产物封闭HIV感染的辅助受体,具有不引起宿主细胞粘附反应、释放介质等人源趋化因子的功能,使有效控制艾滋病成为可能。根据目前技术水平,本发明所指vMIP－Ⅰ和vMIP－Ⅱ蛋白在制药工业上能够工业化生产,实现本发明前景好。
文档编号A61K38/17GK1242236SQ9911628
公开日2000年1月26日 申请日期1999年7月13日 优先权日1999年7月13日
发明者孙晗笑, 谢作煊, 利奕成, 郑佩娥, 严群超, 钟瑛, 何文芳 申请人:暨南大学