专利名称：含红细胞糖苷脂的药物组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及含红细胞糖苷脂(Globoside)的药物组合物及其应用，特别是可用来治疗脑胶质瘤、肾癌、肺癌等肿瘤的药物组合物及其应用。
已知鞘糖脂大多位于细胞膜上，根据其结构中有无唾液酶分为神经节苷脂和中性鞘糖脂，前者含有唾液酸。鞘糖脂由寡糖链和神经酰胺组成，以亲水有的寡糖链伸向细胞外侧，作为细胞表面糖萼的成分之一。根据以上特点，经过大量实验研究，普通认为鞘糖脂参与细胞识别、分化、信号转导、相互作用等。自从Hakomori提出鞘糖脂与肿瘤的关系以来，大量的实验研究发现细胞恶变时，某些鞘糖脂的缺失或发生的某些变化，可使细胞丧失接触抑制性，从而导致一些生命信号物质缺失，突变物质增加。目前国内外对鞘糖脂的研究集中于酸性鞘糖脂，即神经节苷脂，对中性鞘糖脂的研究较少。已有的研究集中在某些细胞菌毒素和微生物的受体、血型抗原、肿瘤相关抗原、胚胎特异性抗原等，对肿瘤相关鞘糖脂的研究则集中于发生机理方面，尚未见中性鞘糖脂作用于肿瘤药物治疗的报导。
本发明的目的是提供一种可用来治疗脑胶质瘤、肾癌、肺癌等肿瘤的药物。
脑胶质瘤是脑部最常见的原发性肿瘤，其发病机理及生物学行为至今尚不清楚。近十年来胶质瘤的治疗常规采用手术、放疗、化疔等综合治疗手段，均难以取得令人满意的效果，而严重的不良反应也限制了传统化疗药物的剂量和疗程，加上肿瘤的特异性和血脑屏障的影响，进一步削减了药物的疗效。因此胶质瘤发生、发展的机理成为近年来研究的热点。
有关脑肿瘤相关鞘糖脂的研究是肿瘤鞘糖脂研究领域中研究得较为深入和广泛的一部分。研究发现①脑胶须瘤细胞株及瘤组织样本表达的神经节苷脂主要有GM2、GD2、GD3及3′-isoLM，其中3′-isoLM特异性较强；②singh-LP等发现各种病理类型的脑胶质瘤中性鞘糖脂的组成具有异质性其中多形性成胶质细胞瘤(AA)总的中性鞘糖脂、CMH及CDH的含量较高，而水的含量低。不含CTH和Globoside；神经胚层肿瘤(PNET)总的中性鞘糖脂及CMH含量低。但常出现CTH和Globoside；低度恶性的星形胶质瘤(LGA)水含量高，总脂及CMH含量低；而高度恶性的星形胶质瘤(HGA)，所有中性糖脂的成分均具备，且含量中等；少突胶质瘤CMH含量高，水成分含量低，较少出现CTH和Globoside；③鞘糖脂的含量或节苷脂的相对百分含量与脑胶质瘤病人的预后相关。
我们研究发现脑胶质瘤、肾癌、肺癌组织中性鞘糖脂的表达存在着异性，与正常人相应组织相比，大部分肿瘤细胞CDH及CTH的表达较正常组织强，它们均不含有中性鞘糖Globoside，而正常组织中性鞘糖脂的表达虽然也存在着一定的异质性，但它们均含有一定的Globoside，提示Globoside的缺乏可能是细胞癌变的原因之一。
根据本发明，我们可以将从各种动物细胞中提取的Globoside(组分A)与各种制药中的载体(组分B)配制成药物组合物，从而治疗脑胶持质瘤、肾癌和肺癌等肿瘤。
组分(A)的来源新鲜猪脑、牛脑、羊脑、动物血细胞、正常人血细胞，经匀浆器匀浆或超声粉碎，分别以2∶1、1∶2、1∶1的氯仿/甲醇溶液提取总脂，总体积为组织的20倍，最后一次在4℃下过夜。滤纸过滤、收集并合并三次滤液，39±3℃下减压蒸馏，得到淡黄色油状物，即为总脂，以1∶1氯仿/甲醇溶液溶解，-20℃保存备用DEAE-Sephadex A-25柱层析物取2.2gDEAE-Sephadex A-25置一广口瓶中，加30mlB液(氯仿∶甲醇∶0.8M醋酸钠为60∶30∶8混合物)，振荡30分钟，静置，去上清，如此重复三次，最后一次让树脂浸泡在B液中4℃下过夜。B为新鲜配置。次日用30mlA液(氯仿∶甲醇∶水为60∶30∶8混合物)洗树脂3-4次，最后悬浮于10mlA液中倒入外径为14mm的层析柱中，柱中先放少许A液，让树脂自然沉降，溶剂流出，再用60-80mlA液洗涤以去除全部醋酸钠。各种组织的总脂置入A液中缓慢上柱，速度为0.2ml/分，上柱后过夜使总脂与树脂充分交换。次日再以A液80ml洗脱，收集洗脱液，39±3℃下减压蒸馏，即为中性鞘糖脂粗提物；同样方法将粗提物过Flossil层析柱，得到纯化中性鞘糖脂。
纯化中性鞘糖脂以1∶1氯仿/甲醇溶液溶解，拌硅胶H(10-40u)加压柱层析，以不同浓度氯仿/甲醇溶液梯度洗脱，分管收集，于TLC板点样检测，60∶35∶8氯仿/甲醇/水展开，碘显色，并与标准中性鞘糖脂比较，收集纯化的Globoside,TLC板点样一个斑点，Rf值0.45，减压蒸干得到白色固体1NMR、FAB质谱仪鉴定结构，为三～六糖基神经鞘氨醇。
各种来源的Globoside，结构如下Globotriaosyl cermide(Gb3)GalNAc(betal-3)Gal(alphal-4)Gal(betal-4)Glc-cerGb5:Gal(betal→3)GalNAc(betal-3)Gal(alphal-4)Gal(betal-4)Glc-CerGL7:sialyl Gal(betal→3)GalNAc(betal-3)Gal(alphal-4)Gal(betal-4)Glc-CerGlobo H:Fuc(alphal→2)Gal(betal→3)GalNAc(betal→3)Gal(alphal→4)Gal(betal→4)Glc-Cer{GalNAc:(N-acetylgalactosamine)N-乙酰氨基半乳糖Gal:(galactose)半乳糖Glc:(9lucose)葡萄糖Fuc:(fucose)岩藻糖Cer:(ceramide)神经酰胺}各种来源Globoside的结构分别是羊脑细胞提取三糖基神经鞘氨醇；牛脑细胞提取四和五糖基神经鞘氨醇；猪脑细胞提取四和五糖基神经鞘氨醇；人红细胞提取四和五糖基神经鞘氨醇；猪红细胞提取六糖基神经鞘氨醇；组分(B)为(1)助溶剂，包括酒精、二甲基亚砜、水(2)其它赋形剂组分(A)溶解于助溶剂中经超声乳化或加入其它赋形剂配制成溶液，也可以采用冷冻干燥法制成粉剂，或将粉剂再压缩成片剂。
组分(A)和组分(B)配制成品的有效浓度3～100％(V/V)。最佳浓度范围为25～100％(V/V)。
本发明提出的药物组合物是可应用于治疗肿瘤的药物，因Globoside干扰肿瘤细胞有丝分裂和DNA合成，阻断肿瘤细胞周期时、信号传导和生长增殖，抑制肿瘤细胞基因表达，诱导肿瘤细胞凋亡。
下面结合附图
详细说明本发明的实施例。
附图为本发明的细胞生长曲线图。
实施例1实验材料(1)将Globoside和助溶剂配制成100％的组合物。
(2)细胞株体外SWO-38、SK-RC-49、SPC-A-1细胞株于含10％小牛血清的RPMI-16-40的培养液中常规培养传代。
(3)动物SCID裸小鼠，雄性，体重20-26g，由中山医科大学动物中心提供，合格证号96015。
(4)主要试剂MTT(Sigma产品)实验方法MTT实验取指数生期内的肿瘤细胞株如SWO-38、SK-RC-49、SPC-A-l，以2×102孔接种于96孔板内，5％CO2、37℃孵箱内培养24hr；分别加入不同来源浓度梯度的Globoside，每种浓度设3个复孔，并设立不同来源CDH和空白对照，继续培养48hr；测试前4hr每孔加入MTT(5mg/ml)液10ul,4hr后每孔加入DMSO溶液200ml，于酶联免疫仪570mm下测定每孔的OD值。以浓度的对数对抑制率作图，求得各种Globoside的IC50值为23.4±4.54。不同来源Globeside对SWO-38、SK-RC-49、SPC-A-1细胞株的IC50(单位ug/ml)牛脑猪脑 羊脑 人血细胞 猪血细胞 人白细胞SWO-3821.326.4 29.216.5 27.6367SK-RC-49 24.523.1 28.618.4 26.7358SPC-A-1 23.622.4 26.017.4 26.9396细胞生长曲线取指数生长期的SWO-38、SK-RC-49、SPC-A-1，细胞株，1×105孔接种于24孔板内，并于每孔加入不同来源的Globoside,5％CO2、37℃孵箱内培养；次日测定第一组三个孔内的细胞株总数，依次测定7天，绘制成细胞生长曲线，可见不同来源Globoside均能抑制SWO-38、SK-RC-49、SPC-A-1细胞生长(见附图，横坐标为Globoside的浓度，纵坐标为抑制率％)。
Globoside诱导胶质瘤细胞株凋亡流式细胞仪检测Globoside作用于SWO-38、SK-RC-49、SPC-A-1细胞株后，按常规方法收集细胞，上流式细胞仪检测，每例样品测1万个细胞核，检测结果输至计算机作数据处理，专用软件作细胞周期分析。结果发现Globoside可抑制肿瘤细胞DNA合成，诱导肿瘤细胞凋亡。
DNA电泳检测凋亡梯形带Globoside作用于SWO-38、SK-RC-49、SPC-A-1细胞后细胞bcl-2、c-fos、c-myc等基因表达的变化情况。Globoside作用后的SWO-38、SK-RC-49、SPC-A-1细胞依次加入鼠抗人一抗，荧光标记的羊抗鼠二抗后，上流式细胞仪检测，发现上述基因表达减少弱。
对荷人肿瘤小鼠的影响研究(1)荷瘤小鼠模型的建立取一定数量、指数期生长、活力在95％以上的SWO-38、SK-RC-49、SPC-A-1细胞，依次接种于裸鼠右后肢大腿内侧肌肉，约1×105个瘤细胞；
(2)用药方法肿瘤移植后第4天，可触及移植局部稍有隆起时，将裸鼠随机分为4组，Globoside组和生理盐水组，各12只。实验组分别给予瘤体局部注射或口服Globoside10mg/kg，对照组相应部位注射生理盐水或口服赋形剂；(3)取材与制片肿瘤移植后的14天，各组处死4只，取瘤体、同侧腹主动脉旁淋巴、腋窝淋巴结，瘤体以电子天平称重，淋巴结测量长、宽，计算体积。组织均以福尔马林固定，石蜡包埋切片，HE染色镜检；(4)结果实验组瘤体重量平均较对照组减轻，具有统计意义；实验组淋巴体积较对照组减小，具有统计学意义。
不同来源的Globoside对荷人肿瘤小鼠的影响大体观察小鼠移植瘤后第4天即可触及瘤结，以后肿瘤增长迅速，患肢功能受限。处死前均呈消瘦状态。
牛脑猪脑羊脑 人血细胞猪血细胞 生理盐水组肿瘤重量g 1.54 1.69 1.82 1.701.635.16淋巴结大小 0.01 0.01 0.01 0.010.010.036P＜0.05毒理学实验(1)不同来源的Globoside作用于肿瘤细胞株的同时，测定其对正常人白细胞的IC50值，结果人白细胞的IC50值远远高于肿瘤细胞。可见Globoside对正常血细胞的毒性低；(2)观察Globoside对正常小鼠脑组织的作用Balb/c小鼠，雌雄兼有，体重23-259，共99只，随机分为9组，每组11只；分别给予下列药物或试剂生理盐水、溶剂、赋形剂、动物来源的Globoside及正常人血细胞Globoside，对照采用吐温；将小鼠用乙醚麻醉后，开颅或静脉注身各种来源的Globoside；分别观察小鼠呼吸、心率、意识、肢体活动情况、及有无抽搐、呕吐、体重变化等。之后，于第2、4、6天每组取2只小鼠处死后取脑组织做病理切片，第7天后将所有小鼠处死做脑组织及重要脏器病理不同来源Globoside对小鼠生命体征及脑组织的影响异常表现及死亡情况第七天平均体重(g)牛脑 无 24.5猪脑 无 25.9羊脑 无 25.8猪红细胞 1只鼠嗜睡 23.1人红细胞 无 24.6生理盐水组 无 23.8溶剂组 无 24.8赋形剂组1只鼠活动性差，无死亡 25.1吐温对照组 普遍进食差，死亡9只 14.2P＜0.05(3)慢性毒性实验受试小鼠长期口服或静脉注射不同来源Globoside，观察对器官系统的损害情况，并设立BCNU对照组。
结果与阳性对照组比较，小鼠长期应用Globoside未见明显器官损害。
实施例2将各种不同来源的Globoside和助溶剂配制成3％的组合物，然后按照实施例1的方法进行(1)MTT实验、(2)细胞生长曲线、(3)Globoside诱导瘤肿细胞株凋亡、(4)对荷人肿瘤小鼠的影响研究、(5)毒理学实验，可以得出以下结论，3％的Globoside组合物能抑制肿瘤细胞生长，且毒副作用小。
实施例3将各种不同来源的Globoside和助溶剂配制成50％的组合物，然后按照实施例1的方法进行(1)MTT实验、(2)细胞生长曲线、(3)Globoside诱导肿瘤细胞株凋亡、(4)对荷人肿瘤小鼠的影响研究、(5)毒理学实验，可以得出以下结论50％的Globoside组合物能抑制肿瘤细胞的生长、且毒副作用小。
权利要求
1.一种药物组合物，含Globoside(红细胞糖苷脂)组分(A)和制药可接受的载体(B)其特征在于组分(A)为各种结构的Globoside结构如下globotraosyl ceramide(Gb3)GalNAc(betal-3)Gal(alphal-4)Gal(betal-4)Glc-CerGb5:Gal(betal→3)GalNAc(betal-3Gal(alphal-4)Gal(betal-4)G1c-CerGlobo H:Fuc(alphal→2)Gal(betal→3)GalNAc(betal→3)Gal(alphal→4)Gal(betal→4)Glc-Cer{GalNAc:(N-acetylgalactosamine)N-乙酰氨基半乳糖Gak:(galactose)半乳糖Glc:(glucose)葡萄糖Fuc:(fucose)岩藻糖Cer:(ceramide)神经酰胺}组分(B)为(1)助溶剂，包括酒精、二甲基亚砜、水(2)其它赋形剂组分(A)溶解于助溶剂中经超声乳化或加入其它赋形剂配制成溶液，也可以采用冷冻干燥法制成粉剂，或将粉剂再压缩成片剂。
2.按照权利要求1所述的组合物，其特征在于组分(A)和组分(B)配制成品的有效浓度3～100％(V/V)。
3.按照权利要求1所述的组合物，其特征在于组分(A)和组分(B)配制成品的最佳浓度范围为25～100％(V/V)。
4.按照权利要求1所述的组合物，其特征在于；Globoside为三～六糖基神经鞘氨醇，并且来自于不同的动物细胞，分别是羊脑细胞提取三糖基神经鞘氨醇；牛脑细胞提取四和五糖基神经鞘氨醇；猪脑细胞提取四和五糖基神经鞘氨醇；人红细胞提取四和五糖基神经鞘氨醇；猪红细胞提取六糖基神经鞘氨醇；
5.按照权利要求1至4中所述的任何一种组合物作为治疗脑胶质瘤、肾癌、肺癌等肿瘤药的应用。
全文摘要
本发明公开了一种含Glodoside(红细胞糖苷脂)的药物组合物及其应用,该组合物是将Globoside(红细胞糖苷脂)溶解于助溶剂中经超声乳化或加入其它赋形剂配制成溶液,也可以采用冷冻干炼法制成粉剂,或将粉剂再压缩成片剂,该组合可作为治疗脑胶质瘤,肾癌,肺癌等肿瘤药的应用。
文档编号A61K31/70GK1235831SQ9911607
公开日1999年11月24日 申请日期1999年3月2日 优先权日1999年3月2日
发明者张积仁, 张健, 张宗诚 申请人:第一军医大学珠江医院