一种新的治疗肺癌的Der p1纳米疫苗及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及新型疫苗发明领域，具体地说是一种新的治疗肺癌的Derpi纳米疫苗 及其制备方法和用途。
【背景技术】
[0002] 肺癌已经成为全球范围内所有癌症发病率的首位，其五年存活率大约为15%，约 30-40%的肺癌患者发生骨转移，一旦发生骨转移，其中位生存时间只有7个月。美国2012 年肺癌有超过163万新发病例及57万死亡病例。肺癌同时也超过肝癌成为了我国第一大 高发癌症，且发病率及死亡率增长最为迅速，每年以13%的速度增长。目前，肺癌占据癌症 发病率排行(男女综合）的首位，其中在男性发病率中排第一，在女性癌症发病率中也始终 排在前三位。预计到2025年，中国每年新增肺癌病例将超过100万例。肺癌患者还呈现年 轻化趋势，尤其是近几年来，45岁以下的肺癌患者多有出现。因此，肺癌已经严重影响威胁 我国人民的生命健康。
[0003]目前治疗方法主要有手术治疗、化疗、放疗等方法。纵观目前的疗法，手术治疗主 要适合早中期（i~ii期）肺癌和肿瘤局限在一侧胸腔的部分选择性的mb期肺癌，和放疗 同属局部治疗，从肿瘤生物学角度看，癌症是全身性疾病，存在转移和扩散的特性；常规的 放疗和化疗等治疗方式，在杀死肿瘤细胞的同时也损伤机体正常细胞和免疫系统，降低免 疫力，毒副作用大。因此，开展新的抗癌药物的研发重要且必要，寻找对抗癌效果好且对正 常组织毒害小、不损害机体免疫的药物的确迫切需求。经过我们发明人前期研究表明，屋尘 螨Derpi疫苗对肺癌的治疗有着显著的作用，且能增强机体免疫能力，具有抗癌功能。
[0004] 本发明采用基因工程技术在大肠杆菌中克隆和表达制备重组Derpi蛋白，克服了 从螨体中大量提取的困难。同时采用PLGA纳米佐剂制备尘螨重组变应原Derpi疫苗，用 于治疗肺癌。本发明国内外尚未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一是克服现有技术的上述不足，而提供一种新的治疗肺癌的Der pl纳米疫苗。
[0006] 实现本发明上述发明目的的技术方案是：一种新的治疗肺癌的Derpl纳米疫苗， 其是采用如下步骤制备而成的： 步骤一，用基因工程技术制备重组屋尘螨变应原Derpl: (1)挑取单个含重组表达质粒重组pET-24a(+)Derpl的基因工程菌菌落接种于含 50iig/ml卡那霉素的LB中，35~37°C，160~240rpm摇菌过夜，按1~4%的接种量将基因工程 菌菌落接种于LB/kam培养液中，200~300rpm摇菌至0D600为0. 5~0. 7时，加入IPTG使其 终浓度为〇.l~〇. 4mM，诱导4~6小时后，2000~4000g在2~6°C离心5~15min，去上清，沉淀用 lxPBS洗涤，将细菌重悬于40mllxPBS/5mMEDTA中，加入溶菌霉至终浓度0. 4~0. 6mg/ml， DIT至终浓度 5~15mM，PMSF至终浓度 0? 8~1. 2mmol/L，TritonX-100 至终浓度 0? 8~1. 2%， 并于室温中振荡20~40分钟，制成基因工程菌培养物裂解液，-80°C保存； (2) 将裂解液置于冰浴下40W超声5~15遍，超声20~40s、停20~40s，直至菌体不粘为 止，10000~12000g3~5°C离心10~20min，去上清，得基因工程菌包涵体； (3) 在冰浴下，用100ml包涵体洗液1重悬沉淀，并磁力搅拌20~40min, 10000~12000g3~5°C离心10~20min，去上清，再依次用包涵体洗液2和包涵体洗液3重悬， 冰浴磁力搅拌，离心去上清，最后将沉淀溶于20ml包涵体溶解液中，10000~12000g离心 30min，弃沉淀，得包涵体； 由于重组蛋白N-端带有6-His标签，故通过Ni2+金属螯合层析进行重组Derpi亲和 层析纯化，得重组屋尘螨变应原Derpi; 步骤二，制备PLGA-尘螨应变原Derpi(PLGA-Derpi)纳米疫苗： 称50mgPLGA溶于二氯甲烷中，再加入100iiL已制备好的浓度为100mg/ml的重组屋尘 螨应变原Derpl，混旋lmin，40w，超声乳化1min形成初乳液，再加入2ml浓度为2%的聚 乙烯醇（PVA)，再超声乳化1~2min，形成复乳液，然后将复乳液转移至50ml的双蒸水中，室 温下搅拌3~5h，使有机溶剂充分挥发，lOOOOrpm/min离心lOmin，离心收集微粒，再用双蒸 水洗涤，最后真空冷冻干燥成微粒粉末状的PLGA-尘螨变应原Derpi纳米疫苗，4°C保存。
[0007] 优选地，所述步骤一（1)中的基因工程菌菌落接种量为2%;摇菌至终浓度为 0? 2mM;PMSF至终浓度为lmmol/L;TritonX-100 至终浓度为 1%。
[0008] 优选地，所述步骤一（3)中的包涵体洗液1为50mmol/LPBPH8.0，100mmol/L Nacl，5mmol/LEDTA;包涵体洗液 2 为 50mmol/LPBPH8.0，100mmol/LNacl，5mmol/LEDTA， 2%TritonX-100;包涵体洗液 3 为 50mmol/LPBPH8.0，100mmol/LNacl，5mmol/LEDTA， 4mol/L尿素；包涵体溶解液为 50mmol/LPBPH8. 0,300mmol/LNacl，20mmol/L咪唑，6mol/ L尿素。
[0009]优选地，所述步骤二中的PLAG为LA:GA=65:35,Mw=40000-75000。
[0010] 本发明的目的之二是克服现有技术的上述不足，而提供一种新的治疗肺癌的Der pl纳米疫苗的制备方法。
[0011] 实现本发明上述发明目的的技术方案是：一种新的治疗肺癌的Derpl纳米疫苗 的制备方法，其步骤如下： 步骤一，用基因工程技术制备重组屋尘螨变应原Derpl: (1) 挑取单个含重组表达质粒重组pET-24a(+)Derpl的基因工程菌菌落接种于含 50iig/ml卡那霉素的LB中，35~37°C，160~240rpm摇菌过夜，按1~4%的接种量将基因工程 菌菌落接种于LB/kam培养液中，200~300rpm摇菌至0D600为0. 5~0. 7时，加入IPTG使其 终浓度为〇.l~〇. 4mM，诱导4~6小时后，2000~4000g在2~6°C离心5~15min，去上清，沉淀用 lxPBS洗涤，将细菌重悬于40mllxPBS/5mMEDTA中，加入溶菌霉至终浓度0. 4~0. 6mg/ml， DIT至终浓度 5~15mM，PMSF至终浓度 0? 8~1. 2mmol/L，TritonX-100 至终浓度 0? 8~1. 2%， 并于室温中振荡20~40分钟，制成基因工程菌培养物裂解液，-80°C保存； (2) 将裂解液置于冰浴下40W超声5~15遍，超声20~40s、停20~40s，直至菌体不粘为 止，10000~12000g3~5°C离心10~20min，去上清，得基因工程菌包涵体； (3) 在冰浴下，用100ml包涵体洗液1重悬沉淀，并磁力搅拌20~40min, 10000~12000g3~5°C离心10~20min，去上清，再依次用包涵体洗液2和包涵体洗液3重悬， 冰浴磁力搅拌，离心去上清，最后将沉淀溶于20ml包涵体溶解液中，10000~12000g离心 30min，弃沉淀，得包涵体； 由于重组蛋白N-端带有6-His标签，故通过Ni2+金属螯合层析进行重组Derpi亲和 层析纯化，得重组屋尘螨变应原Derpi; 步骤二，制备PLGA-尘螨应变原Derpi(PLGA-Derpi)纳米疫苗： 称50mgPLGA溶于二氯甲烷中，再加入100iiL已制备好的浓度为100mg/ml的重组屋尘 螨应变原Derpl，混旋lmin，40w，超声乳化1min形成初乳液，再加入2ml浓度为2%的聚 乙烯醇（PVA)，再超声乳化1~2min，形成复乳液，然后将复乳液转移至50ml的双蒸水中，室 温下搅拌3~5h，使有机溶剂充分挥发，lOOOOrpm/min离心lOmin，离心收集微粒，再用双蒸 水洗涤，最后真空冷冻干燥成微粒粉末状的PLGA-尘螨变应原Derpi纳米疫苗，4°C保存。
[0012] 优选地，所述步骤一（1)中的基因工程菌菌落接种量为2%;摇菌至终浓度为 0? 2mM;PMSF至终浓度为lmmol/L;TritonX-100 至终浓度为 1%。
[0013] 优选地，所述步骤一（3)中的包涵体洗液1为50mmol/LPBPH8. 0，100mmol/L Nacl，5mmol/LEDTA;包涵体洗液 2 为 50mmol/LPBPH8.0，100mmol/LNacl，5mmol/LEDTA， 2%TritonX-100;包涵体洗液 3 为 50mmol/LPBPH8.0，100mmol/LNacl，5mmol/LEDTA， 4mol/L尿素；包涵体溶解液为 50mmol/LPBPH8. 0,300mmol/LNacl，20mmol/L咪唑，6mol/ L尿素。
[0014]优选地，所述步骤二中的PLAG为LA:GA=65:35,Mw=40000-75000。
[0015] 本发明的目的之三是克服现有技术的上述不足，而提供一种新的治疗肺癌的Der pl纳米疫苗的用途。
[0016] 实现本发明上述发明目的的技术方案是：一种新的治疗肺癌的Derpl纳米疫苗， 用于治疗肺癌。
[0017] 本发明与现有技术相比具有如下优点：本发明的一种新的治疗肺癌的Derpl纳 米疫苗，具有良好的抗癌功能，对肺癌有着显著的治疗效果，既对人体无毒害作用，还能增 加机体免疫能力，且制备工艺简单。
[0018] 以下通过具体实施例对本发明作进一步描述。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1 : 一种新的治疗肺癌的Derpl纳米疫苗，其是采用如下步骤制备而成的： 步骤一，用基因工程技术制备重组屋尘螨变应原Derpl: (1)挑取单个含重组表达质粒重组pET-24a(+)Derpl的基因工程菌菌落接种于20ml含50iig/ml卡那霉素的LB中，35°C，160rpm摇菌过夜，按1%的接种量将基因工程菌菌 落接种于1LLB/kam培养液中，200rpm摇菌至0D600为0. 5时，加入IPTG使其终浓度为 0.ImM，诱导4小时后，2000g在2°C离心5min，去上清，沉淀用lxPBS洗涤一遍，将细菌重悬 于40mllxPBS/5mMEDTA中，加入溶菌霉至终浓度0. 4mg/ml，DTT至终浓度5mM，PMSF至终 浓度0. 8mmol/L，TritonX-100至