ug/ml、pH 6. 5~8. 0的 壳寡糖溶液的步骤包括：先在pH为5. 5~6. 5的条件下溶解壳寡糖，得到pH为5. 5~6. 5 的壳寡糖溶液；再调节所述pH为5. 5~6. 5的壳寡糖溶液的pH至7. 0。
[0040] 优选地，所述步骤（1)中，所述制备浓度为10~30ug/ml、ρΗ6· 5~8. 0的壳寡糖 溶液的步骤包括：先将壳聚糖溶于1% (V/V)的醋酸溶液，室温下磁力搅拌充分溶解后，再 用10% (w/v)的氢氧化钠溶液调pH值，配置成浓度为10~30ug/ml、pH为7. 0、碱性或偏 碱性的壳寡糖溶液。
[0041] pH值在壳聚糖基因纳米粒制备过程中发挥重要作用，脱乙酰基的壳聚糖溶解性较 差，pH值降低会增加壳聚糖溶解性。但另一方面，DNA带负电，中性、偏碱性或碱性的溶液环 境有利于保持DNA的构象，有助于其与壳聚糖的静电结合作用；而酸性的环境使其聚合变 难。
[0042] 本发明先调节缓冲液的pH为5. 5~6. 5,使壳聚糖在质子H+占优势的缓冲液充 分溶解后再调节溶液的PH至7. 0、偏碱性或碱性，然后才将寡聚脱氧核苷酸溶液与该pH为 7. 0或碱性的壳聚糖溶液混合，在该条件下，壳聚糖带大量正电荷，能有超过90%氨基被质 子化；同时，DNA的磷酸基团带有多聚负电荷，因此壳聚糖-DNA纳米粒子靠二者之间的静电 作用相吸附，从而得到更多、结合更稳定的负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒。
[0043] 优选地，所述步骤（2)中，所述缓冲液为PBS磷酸缓冲液、三聚磷酸钠缓冲液、硫酸 钠缓冲液或柠檬酸钠缓冲液。
[0044] 优选地，所述步骤（2)中，所述缓冲液的酸根离子的摩尔浓度为5mM~50mM。
[0045] 进一步优选地，所述步骤（2)中，所述缓冲液为PBS磷酸缓冲液。
[0046] 进一步优选地，所述步骤（2)中，所述缓冲液为酸根离子的摩尔浓度为IOmM的PBS 磷酸缓冲液。
[0047] 进一步优选地，所述步骤（2)中，所述缓冲液为pH为5. 5~6. 5的PBS磷酸缓冲 液。
[0048] 本发明采用的PBS磷酸缓冲液、三聚磷酸钠缓冲液、硫酸钠缓冲液或柠檬酸钠缓 冲液含有多价的酸根离子，可作为离子交联剂来制备纳米粒。此外，加入Na 2SO4溶液等含 多价酸根离子的缓冲液有相分离的作用。因为盐溶液具有较高的亲水性，可以脱去壳聚 糖-DNA结合物周围的水层，使之发生聚合，从而导致相分离，在这个过程中，脱水作用和静 电作用相互促进，使凝聚成微小颗粒，并涡流振荡使其分散均匀。
[0049] 本发明采用的酸根离子摩尔浓度为5mM~50mM的缓冲液，有利于维持壳聚糖大分 子链的分子构象；酸根离子的浓度太低，会降低缓冲液的缓冲能力；酸根离子的浓度太高， 会干扰带负电的DNA与壳聚糖的静电结合作用。
[0050] 优选地，所述步骤（3)中，所将步骤（1)制备的壳聚糖溶液与步骤（2)制备的寡聚 脱氧核苷酸溶液按〇. 2~5:1的体积比混合均匀的方式为将CpG-ODN溶液逐滴加入60~ 75°C恒温的壳聚糖溶液中，同时采用磁力搅拌器进行磁力搅拌混匀，溶液滴加完毕后继续 在60~75°C下磁力搅拌混匀5~15min。
[0051] 优选地，所述步骤（3)中，所将步骤（1)制备的壳聚糖溶液与步骤（2)制备的寡聚 脱氧核苷酸溶液按1:1的体积比混合均匀。
[0052] 优选地，所述步骤（3)中，所将步骤（1)制备的壳聚糖溶液与步骤（2)制备的寡聚 脱氧核苷酸溶液按〇. 2~5:1的体积比混合均匀的方式为将CpG-ODN溶液逐滴加入60~ 75°C恒温的壳聚糖溶液中，同时进行涡旋混匀，溶液滴加完毕后继续在60~75°C下涡旋混 匀 5 ~15min。
[0053] 优选地，所述步骤（3)中，所将步骤（1)制备的壳聚糖溶液与步骤（2)制备的寡聚 脱氧核苷酸溶液按〇. 2~5:1的体积比混合均匀的方式为将CpG-ODN溶液逐滴加入60~ 75°C恒温的壳聚糖溶液中，同时进行吹打混匀，溶液滴加完毕后继续在60~75°C下吹打混 匀 5 ~15min。
[0054] 优选地，所述负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒的粒径为112~121nm。
[0055] 优选地，所述负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒的Zeta电位为80~146mV。
[0056] 更进一步优选地，所述负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒的粒径为112. 6nm。
[0057] 该112. 6nm的壳聚糖纳米粒的粒径为平均粒径。
[0058] 更进一步优选地，所述负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒的Zeta电位为 146. OmV。
[0059] 该146. OmV的壳聚糖纳米粒的Zeta电位为平均Zeta电位。
[0060] 优选地，所述的壳寡糖的分子量在80000~160000Da之间。
[0061] 优选地，所述的壳寡糖的脱乙酰度在90%~98%之间。
[0062] 进一步优选地，所述的壳寡糖的分子量为80000Da。
[0063] 进一步优选地，所述的壳寡糖的脱乙酰度为95%。
[0064] 优选地，所述 DNA 序列为 5' -CGNNATCGATGGCGTTGTCGTCAACGTTG TCGTTAACGTTNNNNNNCG-3'，其中，N 为 A、T、C 或 G。
[0065] 优选地，所述DNA序列如SEQ ID NO : 1所示。
[0066] 第三方面，本发明提供了如第一方面所述的负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒 或如第二方面所述的负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒的制备方法在制备免疫佐剂药 物中的应用。
[0067] 本发明提供了的负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒及其制备方法和应用具有 如下有益效果：
[0068] (1)本发明提供的负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒由CpG-ODN通过静电吸附 或物理吸附的作用吸附壳聚糖，包封率较高，形成的纳米粒比较稳定，能提高CpG-ODN在体 内的半衰期；
[0069] (2)与使用硫代修饰稳定的CpG-ODN相比，本发明提供的负载寡聚脱氧核苷酸的 壳聚糖纳米粒不仅能刺激机体产生较强的免疫效应，且细胞毒性很小，使用更加安全；
[0070] (3)本发明提供的负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒的制备方法简单、低成 本；
[0071] (4)本发明提供的负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒可用于制备免疫佐剂药 物。
【附图说明】
[0072] 图1为本发明实施例1制得的负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒的扫描电子显 微镜图像；
[0073] 图2为本发明实施例4制得的负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒的细胞毒性实 验结果；
[0074] 图3为本发明实施例5提供的荧光定量PCR检测各种细胞因子表达量的变化图。
【具体实施方式】
[0075] 以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为 本发明的保护范围。
[0076] 若无特别说明，本发明实施例采用的试剂皆为市售商品。
[0077] 实施例1
[0078] -种负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
[0079] (1)提供或制备如SEQ ID NO :1所示的寡聚脱氧核苷酸（CpG-ODN)，其中，所述 CpG-ODN为未甲基化的寡聚脱氧核苷酸；
[0080] (2)将分子量为160kDa，脱乙酰度为90%的壳聚糖溶于1% (v/v)的醋酸溶液，室 温下磁力搅拌24h，用10% (w/v)的氢氧化钠溶液调pH值，配置成浓度为20ug/ml、pH 7.0 的壳寡糖溶液，在无菌室用0. 22 μ m滤膜进行过滤，用无菌小瓶分装，放在4°C冷藏备用；
[0081] (3)取CpG-ODN溶于IOmM的PBS溶液中，配制成浓度为lug/ml的CpG-ODN溶液；
[0082] (4)取步骤（1)制备的壳聚糖溶液ImL和步骤（2)制备的CpG-ODN溶液5mL，分别 置于65°C的条件下水浴IOmin ;
[0083] (5) 65°C条件下，用无菌的Tip头将壳聚糖溶液迅速吸出并加到CpG-ODN溶液中， 采用磁力搅拌混合10分钟，得到负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒（CNP-CpG)混悬液。
[0084] 实施例2
[0085] 一种负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
[0086] (1)提