a-l和/或其成熟 miRNA的引物；所述的基于探针杂交方法包括与mir-518a-l和/或其成熟miRNA的核酸序 列杂交的探针；所述免疫检测方法包括与其成熟miRNA调控基因表达蛋白特异性结合的抗 体，进一步优选调控的靶基因为FOXMl、MIDI、MKI67蛋白特异性结合的抗体。
[0021] 定义：
[0022] 现阶段检测miRNA的表达水平的方法主要包括基于高通量测序技术、基于核苷酸 杂交和基于PCR的miRNA检测方法。基于探针杂交技术的miRNA检测方法是一种直接检测 法，不需要对样本RNA进行预扩增，包括northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护 分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞术等技术。
[0023] (I) Northern 杂交
[0024] 又称RNA印迹技术为最经典的检测真核生物RNA大小，估计其丰度的实验方法。基 本原理如下：首先在载体（如娃片、微球或膜等）上固定miRNA样本，再与经过标记的探针 杂交，洗涤多余的杂交探针后进行信号检测；也可以在载体上先固定与靶miRNA序列互补 的DNA探针，然后与经过标记的样本miRNA杂交，再进行信号检测。信号标记的方法包括同 位素标记、荧光标记和纳米金标记等。
[0025] (2) miRNA表达谱芯片
[0026] 原理同样是使用标记探针检测固相支持物上的目标分子。通过设计芯片上miRNA 基因及内参序列，可精确分析出样品中相应miRNA的表达水平。基因芯片具有高通量的优 点，可以一次在同一样本中检测出几百个基因的全部表达。Luminex公司研制的液相芯片 (Liquid chip)又称多功能悬浮点阵（Multi analyte suspension array，MASA)，是出的 新一代生物芯片技术。液相芯片体系由许多小球体为主要基质构成，每种小球体上固定有 不同的探针分子，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的球形基质都带有一个独特 的色彩编号，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成了液相芯片系统。该系统可以对 同一个微量样本中的多个不同分子同时进行快速的定性、定量分析，这种检测技术被称为 FMAP (Flexible multianalyte profiling)技术。分子杂交在悬浮溶液中进行，检测速度极 快。
[0027] (3)核酶保护分析技术（RPA)
[0028] miRNA的检测还可以采用核酶保护分析技术，将标记好的探针和待测RNA样本混 合，热变性后杂交，未杂交的RNA和多余的探针用单链核酸酶消化，热失活核酸酶后纯化受 保护的RNA分子，最后通过变性PAGE电泳分离探针，显色。这种基于液相杂交的新方法简 单快速，灵敏度高，但也只能用于分析已知miRNA。
[0029] (4) RAKE 法
[0030] RAKE 法（RNA primed array based Klenow emzyme)是在 miRNA microarray 的基 础上利用DNA聚合酶I的Klenow片段，使miRNA与固定的DNA探针杂交的方法。RAKE可以 敏感特异地检测miRNA，适用于大量快速的筛选所有己知的miRNA。能够在特定的细胞和肿 瘤中检测miRNA表达谱情况。不仅如此，RAKE法还可以从由福尔马林固定了的石蜡包埋的 组织中分离出miRNA并对其进行分析，为从存档标本中分析miRNA开启了希望之门。
[0031] (5)原位杂交（in situ hybridization)
[0032] 原位杂交技术可直观了解miRNA表达方式，是观测miRNA时空表达的一种较简便 的方法，常标记方式包括地高辛、生物素、荧光标记等。锁定核酸基础上的原位杂交（Locked Nucleic Acid(LNA)based in situ hybridization(LNA-ISH))是当前应用较多的探针方 式。
[0033] (6)基于微球的流式细胞术（bead-based flow cytometry)
[0034] 是一种液相芯片技术，该方法将流式细胞检测与芯片技术有机地结合起来，兼有 通量大、检测速度快、灵敏度高和特异性好等特点。
[0035] (7)实时荧光定量 PCR 技术（Real-time PCR，RT-PCR)
[0036] 荧光检测PCR仪可对整个PCR过程中扩增序列的累积速率绘制动态变化曲线。在 反应混合体系中靶序列的起始浓度越大，要求获得扩增产物某特定产量的PCR循环数（一 般用特定阈值循环数Ct来表达）越少。由于miRNA长度仅为22nt，传统的qRT-PCR不适合 扩增如此短的片段。现今有几种用于miRNA的实时定量PCR方法，如加尾法、颈环法等。颈 环法是一种理想的miRNA检测qRT-PCR方法：首先设计特殊的莖环结构引物，以待测miRNA 为模板逆转录合成cDNA第一链，该cDNA -端为茎环状引物，茎环状结构被打开便增加了 cDNA的长度，随后以合成的cDNA为模板设计引物进行实时定量PCR扩增。qRT-PCR具有特 异性高、灵敏度好、快速简单等多种优点。
[0037] ⑶测序法
[0038] 大部分已知的miRNA都是通过cDNA克隆测序发现和鉴定的。该法需要先构建 miRNA的cDNA文库，再进行PCR扩增，扩增产物随后克隆到表达载体上测序。Takada开发 了一种改进的扩增克隆法（miRNA amplification profiling，mRAP)，mRAP 法先在 miRNA 的 3'端连上接头，然后用与接头互补的反转录引物反转录。因为特定的反转录酶具有末端脱 氧核苷酸转移酶活性，一些核苷酸（主要是脱氧胞苷酸）会连接到反转录出的cDNA链的3' 末端。当5'端接头与cDNA链的poly(C)粘性末端退火后，加入一对共用引物即可实现对 cDNA的PCR扩增。由于mRAP高度灵敏，可以直接用克隆和测序技术检测少量组织中miRNA 的表达量。标签序列克隆法是一种在在基因表达系列分析（SAGE)技术的基础上发展了检 测效率更高的miRAGE (miRNA SAGE)克隆法，该法通过生成大的串联子，通过单个测序反应 可检测多个miRNA，明显提尚了检测效率。
[0039] 高通量测序（High-throughput sequencing)又称下一代测序技术（next generation sequencing)是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA 分子进行序列测定，极大提高了测序效率。这类大规模测序技术极大的提高了多个物种遗 传信息的解读速度，为获取所有miRNA的序列信息，解密miRNA图谱提供了保证。同时高 通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为 深度测序（deep sequencing)。高通量测序平台的代表是罗氏公司（Roche)的454测序 仪（Roch GSFLX sequencer)，Illumina 公司的 Solexa 基因组分析仪（Illumina Genome Analyzer)和 ABI 的 SOLiD 测序仪（ABI SOLiD sequencer)。
[0040] 免疫检测方法是以一种抗体或多种抗体作为分析试剂，对待测物进行定量或定 性分析的检测方法。其基本原理是抗体和抗原之间的相互作用。为提高抗原和抗体检测 的敏感性，将已知抗体或抗原标记上易显示的物质，通过检测标记物，反映有无抗原抗体反 应，从而间接测出微量的抗原或抗体。常用的标记物有酶、荧光素、放射性同位素、胶体金 及电子致密物质等。这种抗原或抗体标记上显示物所进行的特异性反应称为免疫标记技术 (immunolabelling technique)。目前应用最广的免疫检测技术主要有：酶联免疫吸附试验 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)，胶体金免疫层析法等。
[0041] 酶联免疫吸附试验原理是将抗原或抗体与底物（酶）结合，使其保持免疫反应和 酶的活性。把标记的抗原或抗体与包被于固相载体上的配体结合，再使之与相应的无色底 物作用而显示颜色，根据显色深浅程度目测或用酶标仪测定OD值判定结果。
[0042] 胶体金试纸条一般由样品垫、金标垫、层析膜、吸水垫四部分组成。层析材料有硝 化纤维膜（NC)、聚酯膜、尼龙膜和PVDF膜等，根据试验需要可选择不同要求的膜，其中NC膜 最为常用，使用前可根据试验具体情况确定是否需要活化或处理，多数情况下无需处理，即 可直接使用。将金标蛋白溶液均匀喷涂在金标垫上，于室温下晾干备用。NC膜可捕获一定 量的包被（抗体）和二抗作为检测线和质控线。最后将样品垫、金标垫、NC膜和吸水纸依 次固定于PVC板，即成试纸条。
[0043] 基于RNA的microRNA功能获得性技术即通过外源性补充miRNAs合成的前体物质 来升高miRNAs的水平。例如，可以人工合成与内源性miRNA序列一致的短发夹样RNA (short hairpin RNA，shRNA)，由聚合酶II或III做启动子，以病毒为载体转染细胞，被Dicer酶修 饰后载入RISC发挥作用，相当于升高pre-miRNA的水平，作用效果稳定而持久。
[0044] 基因特异性miR Mimics技术该技术避免了 miRNA与基因的非特异性作用。这种 人工合成的与靶基因3' UTR互补结合的特异性寡核苷酸链，能够起到与miRNA相同的转录 后调节作用。
[0045] 包含在本发明的药剂学组合物的药剂学上许可的载体为在制剂时通常利用的载 体，该载体包含乳糖（lactose)、右旋糖（dextrose)、鹿糖（sucrose)、山梨醇（sorbitol)、 甘露醇（mannitol)、淀粉、阿拉伯橡胶、磷酸妈、藻酸盐（alginate)、凝胶（gelatin)、娃酸 妈、微晶纤维素、聚乙稀吡略烧酮（polyvinylpyrrolidone)、纤维素（cellulose)、水、糖 楽·、甲基纤维素 （methyl cellulose)、羟基苯甲酸甲醋（methyl hydroxybenzoate)、