孔壁半石墨化介孔硅纳米粒及其制备方法和用图
【技术领域】
[0001]本发明属制药领域，涉及化疗-光热联合治疗载体，具体涉及孔壁半石墨化介孔硅纳米粒及其制备方法和在制备联合治疗脑胶质瘤药物中的用途。
【背景技术】
[0002]肿瘤联合治疗已成为肿瘤治疗的热点，特别是可控性的化疗和近红外光介导的光热治疗的联合，因其在克服肿瘤多药耐药、提高肿瘤治疗效果、减少对正常组织的损伤方面具有独特的优势，目前备受本领域技术人员的关注。
[0003]化疗-光热联合治疗肿瘤成功与否的关键在于所使用的载体材料。理想的化疗-光热联合治疗载体，既要求具有足够高的近红外吸收光热转换能力，以利于光热治疗，又要求具有足够强的载药能力，以利于化疗，同时要求本身分散性好，生物相容。已有文献报道，具有局域表面等离子体共振的贵金属纳米材料如金纳米粒、钮纳米片、银纳米粒等，以及具有近红外吸收的碳纳米材料如碳纳米管、石墨烯等，可以作为化疗-光热联合治疗的载体。然而，为了使贵金属材料在能穿透深层组织的近红外光窗口有强的吸收，使碳材料具有良好的亲水性，以及使材料具有大的比表面积以利于药物装载，通常需要对这些材料进行复杂的修饰，其耗时长，成本高。并且，大多数用于化疗-光热联合治疗的纳米平台，产热点集中在纳米载体中心，减弱光热效果，降低近红外触发的药物释放，不利于肿瘤治疗。
[0004]介孔硅纳米粒MSN是目前广泛研究的药物载体，因其具有高的表面积、大的孔体积、可调的孔径和较好的亲水性。MSN表面富含硅醇基，可方便地连接功能基团，达到可控药物递释。然而，现有技术的MSN制备过程需要使用有毒的模板剂，即使经过费时费力的去除过程，仍会有模板剂残留，不利于生物应用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为克服现有技术存在的缺陷，提供孔壁半石墨化介孔硅纳米粒及其制备方法，尤其是在将介孔硅纳米粒制备过程中的有毒模板剂半石墨化，合成孔壁半石墨化的介孔娃纳米粒。
[0006]本发明中，使用简便的方法使MSN制备过程中的有毒模板剂变成半石墨化的碳，均匀分布于介孔硅内壁，制成孔壁半石墨化的介孔硅纳米粒TsGMSN。制得的TsGMSN保留了 MSN的优良性能，免除了残留模板剂的毒性，同时赋予其新的功能如可控释放、化疗-光热联合治疗特性。
[0007]本发明的进一步目的是将制得的孔壁半石墨化的介孔硅纳米粒载药后用于制备化疗-光热联合治疗脑胶质瘤的药物。
[0008]本发明基于脑胶质瘤通过手术切除、放疗、化疗等，难以达到良好的治疗效果现状，以制得的TsGMSN为载体，负载抗肿瘤药物阿霉素D0X，利用该载体的优良特性，实现脑胶质瘤的化疗-光热联合治疗。
[0009]本发明中，通过下述步骤合成孔壁半石墨化介孔娃纳米粒:
[0010]一定量的CTAB水溶液加热至80°C，加入适量NaOH溶液后剧烈搅拌，随后加入适量TEOS搅拌2h，离心获得固体产物，水洗除去纳米粒表面吸附的表面活性剂，过滤，冻干；所得固体产物浸入98%浓硫酸溶液数小时，干燥，惰性气体条件下高温灼烧一定时间，制得孔壁半石墨化的介孔硅纳米粒TsGMSN。
[0011]上述合成方法中，CTAB:TEOS: NaOH: H2O 的质量比为 1:4.7:0.28:480。
[0012]上述合成方法中，通过向CTAB碱溶液中加入1，3，5-TMB调节TsGMSN介孔孔径和孔壁半石墨化碳含量，I, 3，5-TMB和CTAB的质量比为O?1.2:1。
[0013]上述合成方法中，冻干后固体产物:98%浓硫酸:H20的质量比为:1:0.08?0.36:1 ?4。
[0014]上述合成方法中,惰性气体为氮气、氩气和氦气。
[0015]上述合成方法中，惰性气体条件下高温灼烧的条件为:450°C<温度彡1000°C，0.5h彡时间彡10h。
[0016]本发明通过物理表征方法，性质表征方法对所制备的TsGMSN进行表征，其中，
[0017]物理表征方法包括:扫描电镜、透射电镜、小角X射线衍射、N2吸附脱附等温线、拉曼光谱和热重曲线；
[0018]性质表征方法包括:紫外-可见吸收光谱和热效应测试。
[0019]本发明所制备的孔壁半石墨化介孔硅纳米粒(TsGMSN)，其颗粒形状为球形，颗粒尺寸为115±20nm，具有高度有序的六方P6mm介孔结构，晶胞参数为3.73nm,孔径1.5?3.0nm可调，半石墨化碳含量5%?13%可调，比表面积和孔体积分别约为769111?4和0.TScm3g-1 ;在808nm处有强的近红外吸收，其光热转换显示出浓度依耐性和激光能量强度依赖性，浓度为50 μ g/ml的TsGMSN溶液在能量强度为6W/cm2的近红外激光照射5分钟后，温度可达到53 °C。
[0020]本发明进一步制备载DOX的孔壁半石墨化介孔硅纳米粒(TsGMSND)递药系统:
[0021]一定量TsGMSN分散于适量pH值为9.0的磷酸盐缓冲液PBS中，加入等体积适当浓度的DOX水溶液，调节最终溶液pH值为9.0，避光搅拌一定时间，离心获得固体产物，使用pH值8.0的PBS溶液润洗去除表面吸附的D0X，即得TsGMSND。
[0022]固体产物分散于pH值为7.4的PBS溶液，配成适当浓度使用。
[0023]上述制备方法中，合成投料质量比为:1TsGMSN: 1.8?3.6D0X。
[0024]上述制备方法中，避光搅拌反应时间为24h?72h。
[0025]本发明测试TsGMSND在不同pH条件下的热触发累积释放情况。TsGMSND分别均匀分散于pH为5.0、6.0和7.4的PBS溶液中，置于MWCO为8_10kDa的透析管中，在设定的时间点，取液测试，并补足同等体积的相应溶剂，近红外照射组使用能量强度为6W/cm2的近红外激光照射5分钟，释放的DOX采用荧光光谱仪测定，结果显示，TsGMSND的释放是热触发和pH响应的，并且具有缓释特性。
[0026]本发明进一步评价所制备的TsGMSND纳米递药系统化疗-光热联合治疗脑胶质瘤的效果。
[0027]本发明使用激光共聚焦显微镜观察不同处理后人脑胶质瘤细胞U251的死亡情况:TsGMSN和TsGMSND分别与脑胶质瘤U251细胞避光孵育2h，浓度为20 μ g/ml,50 μ g/ml和100 μ g/ml(以TsGMSN的质量计算)，光热治疗组使用近红外激光照射5分钟，能量强度为6ff/cm2,更换新鲜培养液，继续孵育12h，按照Live-Dead试剂染色说明进行细胞染色，激光共聚焦显微镜下观察，活细胞呈绿色，死细胞呈红色；结果显示，在不同浓度时，化疗和光热治疗联合治疗组(TsGMSND+NIR组)的肿瘤细胞死亡明显高于单纯的化疗组(TsGMSND组)或单纯的光热治疗组(TsGMSN+NIR组)，提示联合治疗的良好效果，结果还显示，单纯TsGMSN未经任何处理组没有观察到明显细胞毒性。
[0028]本发明使用CCK-8检测法定量考察不同处理方法对人脑胶质瘤细胞U251的毒性:
[0029]制备TsGMSN和TsGMSND成系列浓度，与U251细胞避光孵育4h，光热治疗组使用近红外激光照射5分钟，能量强度为6W/cm2，更换新鲜培养液，继续孵育12h，按照CCK-8使用说明定量检测细胞毒性，未经任何处理的U251细胞作为对照，结果显示半数抑制浓度IC5tl值分别为:单纯TsGMSN未经任何处理组(4.131θ+09μ g/ml，以TsGMSN质量计算)、单纯的化疗组(468.45μ g/ml,以DOX质量计算)、单纯的光热治疗组(74.83μ g/ml,以TsGMSN质量计算)以及化疗和光热治疗联合治疗组(90.97 μ g/ml,以DOX质量计算，和24.72 μ g/ml,以TsGMSN质量计算)，由此计算得到联合指数值Cl为0.589，该值小于1，表明化疗和光热治疗具有协同作用。
[0030]本发明提供了一种经济实用的孔壁半石墨化介孔硅纳米粒的制备技术及其应用方法。
[0031]本发明的突出优点在于，提供一种简便的方法，将介孔硅纳米粒制备过程中的有毒模板剂半石墨化，合成孔壁半石墨化的介孔硅纳米粒，载药后用于化疗-光热联合治疗脑胶质瘤，结果显示具有协同作用。本发明所合成的TsGMSN，与现有的介孔硅纳米粒MSN相t匕，保留了 MSN的优良性能，巧妙地避免了残留模板剂的毒性；制备成TsGMSND纳米递药系统，具有优异的功能，如热触发释放药物性能、PH敏感释放药物性能、近红外激发产热性能、化疗-光热治疗特性等。
【附图说明】
[0032]图1TsGMSN的物理表征结果，
[0033]其中，A:扫描电镜图(插入图:相应的透射电镜和粒径分布曲线)，
[0034]B:透射电镜图(插入图:单个粒子的透射电镜图)，
[0035]C:小角X射线衍射图(插入图:高分辨率透射电镜图)，
[0036]D =N2吸附脱附等温线(插入图:孔径分布曲线)，
[0037]E:拉曼光谱图，
[0038]F:热重曲线。
[0039]图2载体材料的性质表征结果，
[0040]其中，A:不同载体材料的紫外-可见吸收光谱曲线，
[0041]B:固定浓度为50μ g/ml，能量强度为6W/cm2，不同载体材料的热效应曲线，
[0042]C:固定能量强度为6W/cm2，不同浓度TsGMSN的热效应曲线。
[0043]图3TsGMSND在不同pH条件下的热触发累积释放曲线，近红外照射组固定能量强度为 6W/cm2。
[0044]图4共聚焦显微镜观察U251细胞经不同处理后的死亡情况
[0045]其中，近红外照射组固定近红外能量强度为6W/cm2，绿色表示活细胞，红色表示死细胞，Bar=75 μ m
[0046]A-H:浓度为 20 μ g/ml
[0047]1-P:浓度为 50 μ g/ml
[0048]Q-X:浓度为 100 μ g/ml。
[0049]图5CCK-8法定量测定不同处理对U251细胞的毒性结果。
【具体实施方式】
[0050]实施例1.[0051 ] 称量CTABlOOmg，溶于48ml水中，溶液加热至80 °C，加入2M的NaOH溶液0.35ml后剧烈搅拌，随后加入500 μ 1TE0S搅拌2h，使得CTAB:TE0S:Na0H:H2O的质量比为1:4.7:0.28:480，离心获得固体产物，水洗除去纳米粒表面吸附的表面活性剂，过滤，冻干。所得固体产物浸入98%浓硫酸溶液12h，使得固体产物:98%浓硫酸=H2O的质量比为1:0.12:2，干燥，氮气条件下550°C灼烧5h，即得孔壁半石墨化的介孔硅纳米粒TsGMSN。测得TsGMSN孔径为1.5nm,孔壁半石墨化碳含量为5.5%。
[0052]实施例2.
[0053]称量CTABlOOmg，量取 I, 3，5-TMB34 μ I (与 CTAB 的质量比为 0.3:1)，溶于 48ml 水中，溶液加热至80°C，加入2M的NaOH溶液0.35ml后剧烈搅拌，随后加入500 μ 1TE0S搅拌2h，使得CTAB: TEOS: NaOH: H2O的质量比为1:4.7:0.28:480，离心获得固体产物，水洗除去纳米粒表面吸附的模板剂，过滤，冻干。所得固体产物浸入98%浓硫酸溶液12h，使得固体产物:98%浓硫酸=H2O的质量比为:1:0.12:2，干燥，氮气条件下550°C灼烧5h，即得TsGMSN。测得TsGMSN孔径为1.9nm,孔壁半石墨化碳含量为7.2%。
[0054]实施例3.
[0055]称量CTABlOOmg，量