支架材料置入损伤部位，形成局 部细胞定向分化，分布均匀可替代生物支架材料。
[0041] 实施例3胶原/丝素蛋白材料的制备
[0042]
[0043] (1)胶原蛋白溶液的制备
[0044] 以嫩猪皮或牛腱作为胶原生物材料，清洗干净后用pH 8. 0-12的NaOH溶液脱脂， 脱脂后溶解于PH 5. 0-6. 5的乙酸溶液，搅拌混匀后加入复合蛋白酶，胶原蛋白与复合蛋白 酶质量比为500-1000:1，继续搅拌过夜；
[0045] 离心，收集上清液，加入NaCl，搅拌，收集沉淀物，加入乙酸，离心，收集上清液，加 入NaCl，搅拌，收集沉淀物，加入乙酸，重复操重复离心，收集上清液，加入NaCl，搅拌，收集 沉淀物，加入乙酸的步骤4次后，得到的沉淀物为胶原蛋白，将胶原蛋白溶解于0. 01-0. 1% 乙酸溶液中，获得1-3%的胶原蛋白溶液。
[0046] (2)丝素蛋白溶液的制备
[0047] 取蚕丝，将蚕丝原材料放入80-120°C的似20)3的溶液中，高温清煮30-60min，蒸馏 水反复清洗；重复清煮及清洗2-3次，真空干燥完成脱胶；将脱胶后成分以质量比1:10比 例置于LiBr溶液中，50-60°C水浴箱保温直至溶解，溶解液置于透析袋中用蒸馏水匀速透 析，得到丝素蛋白溶液，浓度为0. 5-20%，5°C储存，使用时6°Co照射灭菌
[0048] (3)胶原/丝素蛋白材料的制备
[0049] 将上述两溶液静置24_48h后，加胶原和丝素蛋白混合溶液以1:1或1:2或1:3或 1:4浓度进行配比，同时加入甘油和马来酸酐，进行透析及超滤，最后浓缩成材料溶液。
[0050] 实施例4胶原/丝素蛋白支架材料的打印
[0051] (1)将实施例3得到的生物材料的溶液置于打印机材料储存器中；生物打印机针 头直径为60-400 y m，针头数量为6 -16个，针头到基底打印层为100- 300 y m，打印速度 2-10mm/秒，打印间隙为100 y m -400 y m，温度设置为-30°C - 5°C。
[0052] (2)根据大鼠脊髓神经解剖结构及测量数据进行比较分析，了解脊髓皮质脊髓束、 脊髓丘脑束、薄束和楔束的直径及走行，设计并优化脊髓微导管支架3D模型，进行有限元 分析；将脊髓微导管3D模型导入3D生物打印机电脑中，进行格式转换、数据模拟及参数优 化，直径在2. 5-2. 8mm，横径在2. 2-2. 5mm ;
[0053] (3)按照常规技术制备含有神经干细胞的溶液，加B27、bFGF无血清培养基及神 经元特定培养基，加NT-3和BDNF生长因子；将打印的脊髓微导管 6°Co灭菌消毒，置入含有 IOfVml细胞的培养液中，培养4一 12天。
[0054] 制备精确大鼠胸10水平脊髓损伤模型，将制备的含有细胞的已成熟脊髓微导管 置入脊髓损伤处，形成局部对合良好，力学性能稳定，分布均匀、生物可降解的脊髓导管支 架材料。
[0055] 实施例5胶原/丝素蛋白支架材料的打印
[0056] (1)将实施例3得到的生物材料的溶液置于打印机材料储存器中；生物打印机针 头直径为60-400 y m，针头数量为6 -16个，针头到基底打印层为100- 300 y m，打印速度 2-10mm/秒，打印间隙为100 y m -400 y m，温度设置为-30°C - 5°C。
[0057] (2)根据大鼠坐骨神经解剖结构及测量数据进行测量分析，优化神经导管支架3D 模型，进行有限元分析；将神经导管3D模型导入3D生物打印机电脑中，进行格式转换、数据 模拟及参数优化，直径在1. 8-3. 2_。
[0058] (3)按照常规技术制备含有神经干细胞的溶液，加B27、bFGF无血清培养基及神经 元特定培养基，加NT-3和BDNF生长因子；将打印的神经导管 6°Co灭菌消毒，置入含有IO8/ ml细胞的培养液中，培养4一 12天。
[0059] (4)制备大鼠单侧坐骨神经损伤模型，将制备的含有细胞的神经导管置入脊髓损 伤处，形成局部对合良好，力学性能稳定，生物可降解的神经导管。
[0060] 实施例6胶原/丝素蛋白支架材料的打印
[0061] (1)将实施例3得到的生物材料的溶液置于打印机材料储存器中；生物打印机针 头直径为60-400 y m，针头数量为6 -16个，针头到基底打印层为100- 300 y m，打印速度 2-10mm/秒，打印间隙为100 y m -400 y m，温度设置为-30°C - 5°C。
[0062] (2)根据大鼠坐骨神经解剖结构及测量数据进行测量分析，优化神经导管支架3D 模型，进行有限元分析；将神经导管3D模型导入3D生物打印机电脑中，进行格式转换、数据 模拟及参数优化，直径在I. 8-3. 2_ ;
[0063] (3)按照常规技术制备含有脂肪干细胞的溶液，加B27、bFGF无血清培养基及神经 元特定培养基，加NT-3和BDNF生长因子；将打印的神经导管 6°Co灭菌消毒，置入含有IO8/ ml细胞的培养液中，培养4一 12天。
[0064] (4)制备大鼠单侧坐骨神经损伤模型，将制备的含有施万细胞的神经导管置入脊 髓损伤处，形成局部对合良好，具有神经传导性能的神经导管。
[0065] 以上对本发明的较佳实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施 例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进 等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
【主权项】
1. 一种低温快速成型三维打印胶原丝素蛋白材料，其特征在于：所述胶原/丝素蛋白 材料由如下质量份数的组份制备而成：2. 根据权利要求1所述的胶原丝素蛋白材料，其特征在于：所述胶原/丝素蛋白材料 如下质量份数的组份制备而成：3. -种低温快速成型三维打印胶原丝素蛋白材料的制备方法，其特征在于：分别配置 1-3%胶原蛋白溶液和0. 5-20 %丝素蛋白溶液，静置24-48h后，按照丝素蛋白和胶原蛋白 质量比为6-45 :40-80均匀混合，加入甘油和相容剂，低温及冷冻干燥后，制备获得胶原/丝 素蛋白材料。4. 根据权利要求3所述的胶原丝素蛋白材料的制备方法，其特征在于：所述低温干燥 的温度不高于_5°C。5. 根据权利要求3所述的胶原丝素蛋白材料的制备方法，其特征在于：所述胶原蛋白 溶液的制备方法包括如下步骤： (a) 将富含胶原蛋白的动物组织去除血管、肌肉和表皮等杂质，清洗干净后用弱碱溶液 脱脂； (b) 脱脂后溶解于稀酸溶液，搅拌混匀后加入复合蛋白酶，胶原蛋白与复合蛋白酶质量 比为500-1000:1，继续搅拌过夜； (c) 离心，收集上清液，加入NaCl，搅拌，收集沉淀物，加入乙酸，重复步骤（c)操作3-4 次后，得到的沉淀物为胶原蛋白，将胶原蛋白溶解于0.01-0. 1%乙酸溶液中，获得1-3%的 胶原蛋白溶液。6. 根据权利要求5所述的胶原丝素蛋白材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（a) 中的弱碱溶液为pH8. 0-12的NaOH。7. 根据权利要求5所述的胶原丝素蛋白材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（b) 中的稀酸溶液为pH5. 0-6. 5的乙酸或盐酸。8. 根据权利要求3所述的胶原丝素蛋白材料的制备方法，其特征在于：所述丝素蛋白 溶液的制备方法包括如下步骤： (d) 取蚕丝，加入0. 5-1 %的Na2CO3稀碱溶液中，高温清煮30-60min，蒸馏水反复清洗； 重复清煮及清洗2-3次，真空干燥完成脱胶； (e) 将脱胶后成分以质量比1:10比例置于LiBr溶液中，50-60°C水浴箱保温直至溶 解； (f) 溶解液置于透析袋中用蒸馏水匀速透析，得到丝素蛋白溶液，所述丝素蛋白溶液的 浓度为〇. 5-20 %，5 °C储存，使用时6°Co照射灭菌。9. 一种低温快速成型三维打印胶原丝素蛋白材料的应用，其特征在于：胶原/丝素蛋 白材料作为生物支架材料使用时，细胞或生长因子可贴服或融合与胶原/丝素蛋白材料的 内外表面；优选的，所述细胞为神经干细胞、少突胶质细胞、神经元或星形胶质细胞。10. -种低温快速成型三维打印胶原丝素蛋白材料的打印方法，其特征在于：将胶原/ 丝素蛋白材料的溶液置于生物打印机材料储存器中，生物打印机针头直径为60- 400ym， 针头数量为6 - 16个，针头到基底打印层为100- 300ym，打印速度2-10mm/秒，打印间隙 为100ym- 400ym，温度设置为-30°C- 5 °C，打印。
【专利摘要】本发明提供一种低温快速成型三维打印胶原丝素蛋白材料，所述胶原丝素蛋白材料由如下质量份数的组份制备而成：胶原蛋白40-80；丝素蛋白6-45；甘油0.5-6；相容剂0.1-5。本发明采用的材料均匀，良好的生物相容性和力学性能，同时为生物降解可控性材料，在生物体内不同组织可降解为人体可吸收的无毒无害物质，通过控制其成分质量比，控制其体内的降解时间，促进组织再生。
【IPC分类】A61L27/26, A61L27/22, A61L27/58, A61L27/24
【公开号】CN105031728
【申请号】CN201510400438
【发明人】陈旭义, 涂悦, 李瑞欣, 张赛, 汤锋武, 马军, 刘红斌, 杨凯
【申请人】中国人民武装警察部队后勤学院附属医院
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月9日