基于蜘蛛丝蛋白的温敏性水凝胶的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是一种可用于制备水凝胶的蛛丝蛋白材料，具体是将一种生物合成 的蜘蛛牵引丝蛋白的羧基端结构域（CTD)及其衍生肽段制备成水凝胶。
【背景技术】
[0002] 水凝胶是由亲水性物质交联形成的三维空间网络结构。较高的含水量使其可以模 拟天然生物生存的环境，并赋予其较好的生物相容性。另外，水凝胶多孔的微结构使其具有 一定的可渗透性，而三维网状结构可以提供一定的机械支撑，所以水凝胶在医学，药学，生 物材料方面有着广泛的用途，例如隐形眼镜，人造器官材料，及药物传输载体等。根据对外 界环境刺激的响应情况，水凝胶可被分为传统型和智能型两大类。其中，智能型水凝胶是现 今研究的热点，主要包括温敏型水凝胶、pH敏感型水凝胶、生物分子敏感型水凝胶、电场敏 感型水凝胶等。
[0003] 目前，用于制备智能型水凝胶的分子大多是化学合成的多聚物，虽然这种多聚物 的机械性能较好，但生物相容性较差，降解耗时太长，另外不利于细胞粘附。所以，科学家们 把目光转向了生物聚合物，主要是一些天然存在的蛋白多肽类物质（如胶原蛋白，丝蛋白 和明胶等）。这些多肽类物质具有很好的生物相容性和可降解性，且细胞毒性较低，被认为 是制备水凝胶的理想材料。
[0004] 蜘蛛丝蛋白以其优越的机械性能（强度、弹性等）和生物相容性成为最近水凝胶 研究的热点（Schacht K，Scheibel T.Biomacromolecules. 2011，12(7) :2488 - 95.)。大 部分的蜘蛛可以产七种丝，如牵引丝、小壶状腺丝、鞭毛状腺丝等。其中牵引丝作为蜘蛛网 的主要骨架及逃生的生命线，因此具有其他纤维无法比拟的机械性能。牵引丝主要由牵 引丝蛋白 1 和牵引丝蛋白 2(MaSpl&2)组成（0〇81;[116，工]\1;6116代1^6，？.厶.；〇1'1:16口卩，（1 S. ；Savage, K. N. J. Exp. Biol. 1999, 202 (Pt. 23), 3295 - 3303. Hinman, M. B. ； Jones, J. A.； Lewis, R. V. Trends Biotechnol. 2000, 18, 374 - 379.);前人的研究表明，MaSPl 强度较 高，而MaSP2弹性较好。牵引丝蛋白的结构具有一定的相似性，它们主要由重复片段结构 域（R印）和两端的氨基端结构域（NTD)、羧基端结构域（CTD)组成。其中Rep不断串联 重复（大概100个）形成中间的部分，且被认为对纤维的机械性能比较重要；而两端的末 端结构域（NTD和CTD)是非重复且较为保守的氨基酸序列，被认为对蛛丝蛋白的组装和 排列做了重要贡献（Sponner A，Schlott B，Vollrath F，Unger E，Grosse F, Weisshart K. 2005a. Biochemistry 44:4727 - 4736. Rising A, Hjalm G, Engstrom ff,Johansson J.2006.Biomacromolecules7:3120 - 3124.Gaines WAj Marcotte WRj Jr. 2008. Insect Mol Bioll7:465 - 474.)。其中关于CTD的研究还是较多的，结果表明其可促进蛛丝蛋 白的溶解以利于高浓度蛋白溶液的储存；对pH、盐离子和剪切力（蜘蛛腺体中成丝过 程的不断变化的物理化学因素）较为敏感，且可在剪切力作用下形成连接较好的纤维 (Hagn, F. ；Eisoldt, L. ；Hardy, J. G. ；Vendrely, C. ；Coles, M. ；Scheibel, T. ；Kessler, H. Nature 2010, 465 (7295), 239-42. Askarieh, G. ；Hedhammar, M. ；Nordling, K. ；Saenz,A.； Casals，C. ;Rising，A. ; Johansson, J. ;Knight，S.D. Nature2010, 465 (7295) ,236-8.) 〇
[0005] 经过对现有技术的检索发现，PCT专利文献号W02007/078239公开了一种分离富 含Ala和Gly的重复片段和C端结构域的微型蜘蛛丝蛋白及可溶性蛋白的方法，并且提供 了制备大壶腹腺蛛丝蛋白纤维的方法。
[0006] PCT专利文献号W02010/123450公开了一种构建并获得了既包含重复片段，又含 有C端结构域和N端结构域的蜘蛛丝蛋白，并提供了一种分离以上所述的蛋白聚合物的方 法。通过调节所用液体介质的PH、离子浓度等条件，获得了肉眼可见的纤维。
[0007] 中国专利文献号CN104045841A公开了一种通过将废蚕丝脱胶、溶解、透析处理后 得到低浓度的丝素蛋白溶液，然后在常温下采用高速搅打匀质处理的方法得到凝胶化时间 较短的丝素蛋白水凝胶。
[0008] Kristin Schacht 等，Biomacromolecules. 2011，12, 2488 -2495?表达了园蛛科蜘 蛛（Araneus diadematus)的富含Ala和Gly的重复片段的蜘蛛丝蛋白，并通过提高浓度和 化学交联的手段将其制备形成水凝胶。但该蛋白材料中不包含CTD。
[0009] 虽然关于CTD的研究日益深入，但到目前为止，还没有关于其能够形成水凝胶的 报道。通过我们的研究，发现不同种属的蜘蛛丝蛋白的CTD及其衍生肽段对温度较为敏感， 且可在高温和低温条件下形成水凝胶。
[0010] 作为蜘蛛丝蛋白的一部分，CTD形成的水凝胶既具有多肽类水凝胶的生物相容性、 可降解性、细胞毒性低等优势，又具有蛛丝蛋白部分优越的机械性能，这将为水凝胶在组织 工程，药物传输等医学工程中的应用提供更好的选择。
【发明内容】
[0011] 本发明针对现有技术存在的上述不足提出一种基于蜘蛛丝蛋白的温敏性水凝胶， 通过利用公开的CTD及R印的氨基酸序列设计和优化对应的核苷酸序列，在大肠杆菌中实 现表达和生产，最终利用其温敏性制备形成水凝胶。利用蜘蛛丝蛋白的CTD及其衍生肽段 制备得到孔径致密且弹性模量高达IO 5Pa的水凝胶，具体可用于组织工程等医学领域。
[0012] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0013] 本发明通过将人工设计的核苷酸序列无缝连接到pET -19b质粒载体上，经由大肠 杆菌表达后采集其中的蛋白溶液并稀释于磷酸盐缓冲液中，最后通过对应的温度控制形成 水凝胶。
[0014] 所述的多肽为（Itep)x _ (CTDn)y，其中：整数X代表R印，即络新妇属蜘蛛（N印hila clavipes)牵引丝蛋白I(MaSPl)中单体序列重复的次数，取值范围为[0,16];整数y代表 CTD，即络新妇属蜘蛛（Nephila clavipes)、园蛛科蜘蛛（Araneus diadematus)或非洲育儿 网蛛（Euprosthenops australis)的MaSPl的羧基末端结构域（CTD)序列重复的次数，取 值范围为[1，8];整数n代表CTD的种类，当n取1、2、3时，分别代表NcCTD、AdCTD、EaCTD。
[0015] 所述的多肽中，x、y和n在相应区间内自由组合，如X取4、y取1、n取1时，即 (R印)4 - CTD1，其中=CTD1 即为 NcCTD。
[0016] 所述的N印hila clavipes牵引丝蛋白I(MaSPl)重复序列的单体氨基酸序列，如 Seq ID No. 1 所示，即：
[0017] N' - GRGGLGGQGAGAAAAAGGAGQGGYGGLGSQG - C'，来自于文献 Xu Ming and Randolph
[0033] 所述的成胶温度控制，具体为：
[0034] a)对（Rep)x - (CTDn)y中，X为0，y为l，n取1~3间的任意整数的多肽CTD "来 说，温度设置为2°C~KTC时，可形成透明且可热回复的水凝胶；温度设置为65°C~85°C 时，可形成透明且热不可回复的水凝胶；
[0035] b)对（R印)x - (CTDn) y中，X为0, y为4, n取1~3间的任意整数的多肽（CTD n) 4 来说，温度设置为50°C~80°C时，可形成白色且热不可回复的水凝胶；
[0036] c)对（Rep)x - (CTDn)y中，X为4，y为l，n取1~3间的任意整数的多肽（Rep) 4 -CTDn来说，温度设置为2°C~KTC时，可形成白色且热可回复的水凝胶。
[0037] 本发明涉及制备得到的水凝胶，其物理化学表征为：孔径致密；弹性模量的范围 是 10° ~10 5Pa。
[0038] 本发明涉及上述水凝胶的应用，将其用于组织工程等医学领域。
【附图说明】
[0039] 图 1 为 CTD0 CTD2、CTD3的 SDS - PAGE 图及其特征；
[0040] 图中：A为分离后重组蛋白的SDS -PAGE图，箭头指示处为目标条带；B为重组蛋白 的信息图。
[0041] 图 2 为（R印)4 - CTDp (CTD1)4的 SDS - PAGE 图及其特征；
[0042] 图中：A为分离后重组蛋白的SDS -PAGE图，箭头指示处为目标条带；B为重组蛋白 的信息图。
[0043] 图3为CTD^升温和降温的过程中的倒置实验；
[0044] 图4为CTD1在低温和高温下形成的水凝胶的扫描电子显微镜的形貌图；
[0045] 图中：A和B是CTD1在低温下形成水凝胶的形貌图，C和D为CTD i在高温下形成 水凝胶的形貌图；B和D分别为A和C中方框处的放大图。
[0046] 图5为（CTD1) 4在50°C时的正、倒置实验。
[0047] 图6为（R印)4 - (^^在升温和降温的过程中的倒置实验。
[0048] 图7为（R印)4 - CTD1在低温下形成的水凝胶的扫描电子显微镜的形貌图。
[0049] 图中：A是（R印)^CTD1在低温下形成水凝胶的形貌图，B为A中方框处的放大图。
[0050] 图8为(^^在不断升温过程（(TC~80°C )的流变学实验。
[0051] 图中G'为弹性模量；G"为损耗模量。
[0052] 图9为（CTD1)2在不断升温过程（(TC~80°C )的流变学实验。
[0053] 图中G'为弹性模量；G"为损耗模量。
【具体实施方式】
[0054] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发