明技术方案为前提下进行 实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。 实施例1
[0055] 本实施例通过构建目标蛋白的表达载体，并将该表达载体导入大肠杆菌中实现表 达生产。
[0056] 本实施例具体操作包括：利用NdeI和XhoI两个限制性内切酶，构建产生了 CTD^ CTD2XTD3的表达载体。尔后，将不同载体转化进入Escherichia, coli BL21(DE3)细胞中， 将该菌株在含氨苄青霉素的4mL LB培养基中37°C培养至0D600为1. 8~2. 0时，以1%的 接种量转入含氨苄青霉素的IOOmL LB培养基中37°C培养；当0D600为3. 0~4. 0时，将其 全部转入含氨苄青霉素的800mL的TB培养基中37°C培养；当0D600为6. 0~8. 0时，加入 ImM的IPTG16°C诱导12~16h后收菌。
[0057] 本实施例上述操作中涉及到的菌株、质粒、酶、抗生素和培养基为：克隆宿主 Escherichia. coliDH5,表达宿主Escherichia. coliBL21 (DE3);表达质粒pET -19b ;限制性 内切酶，T4DNA连接酶；氨苄青霉素；LB培养基，TB培养基。
[0058] 所述的限制性内切酶为NdeI和XhoI。
[0059] 所述的LB培养基的成分包括：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L氯化钠。
[0060] 所述的TB培养基的成分包括：12g/L胰蛋白胨、24g/L酵母粉、5g/L甘油及10% (v/v)TB盐溶液。
[0061] 所述的TB盐溶液是指：23. lg/L磷酸二氢钾和125. 4g/L磷酸氢二钾组成的混合 溶液。 实施例2
[0062] 本实施例构建产生了（Rep)4 - CTD^ (CTD1)4的表达载体，并通过实施例1中的方 法，在大肠杆菌Escherichia. coliBL21 (DE3)中进行表达生产。
[0063] 本实施例得到浓度为150mg/mL的蛋白溶液。利用旋转流变仪（HAAKEMARSIII) 以lrad/s的频率、2°C/min的实验条件，测定0°C~80°C间的流变学性质。
[0064] 结果显示，（CTD1)2在升温的过程中，在~40°C时发生了相变（G' >G"），水凝胶形 成，且弹性模量（G'）不断变化，最大可达到IO5Pa(见图9)。 实施例3
[0065] 本实施例中，按照Ig的湿菌体对应IOmLBufferA的比例重悬实施例1中得到的菌 体；以0. 5mg/mL的比例加入溶菌酶37°C孵育30min ;超声破碎后12000rpm离心得到上清， 经0. 45 ym的滤膜过滤之后上样于填充了 Ni -Sepharose的柱子上。用BufferB洗去非特 异性结合的蛋白后，再用BufferC洗脱目标蛋白。以截流量为IOkDa的浓缩管将目标蛋白 浓缩到130~150mg/mL，再通过不断的添加，不断离心的方式将目标蛋白的溶剂换为pH7. 2 的20mM的磷酸盐缓冲液。
[0066] 将BufferC的洗脱液跑还原条件下的SDS-PAGE(如图1 - 2所示）。图中的箭头 所示为相应的重组蛋白的主条带。
[0067] 上述亲和层析所用的缓冲液如下：
实施例4
[0068] 本实施例是（R印)x - (CTDn) y中x取0、y取I、n取1的CTD i (亦是NcCTD)的水凝 胶的制备。
[0069] 本实施例通过测定实施例2中浓缩后的NcCTD的蛋白浓度，并将其稀释到50~ 150mg/mL ;然后将此蛋白溶液分装到小玻璃瓶中，测试不同温度下成胶的情况；再将形成 的水凝胶冷冻干燥，并利用扫描电子显微镜观察水凝胶的表面特征。
[0070] 结果发现，CTD1分别在2°C~4°C和65°C~85°C范围内均可以形成透明的水凝胶 (见图3)。有趣的是，低温下形成的水凝胶在温度逐渐升高的过程中又恢复到之前的水溶 液状态，但高温下形成的水凝胶在温度不断下降的过程中是不能恢复的；另外，低温下比高 温下形成的水凝胶更为紧密（见图4)，这可能是因为，在高温下存在水蒸发的问题，使得孔 径变大。所以，低温下形成的水凝胶可能具有更广泛的用途。 实施例5
[0071] 本实施例是（R印)x - (CTDn)y中X取0、y取4、n取1的（CTD D4的水凝胶的制备。
[0072] 本实施例通过测定实施例2中浓缩后的（CTD1)4的蛋白浓度，并将其稀释到 50~150mg/mL ;然后将此蛋白溶液分装到小玻璃瓶中，测试不同温度下成胶的情况； 再将形成的水凝胶冷冻干燥，并利用扫描电子显微镜观察水凝胶的表面特征。
[0073] 实验结果发现，（CTD1)4失去了低温成胶的性能，只能在50°C~80°C范围内形成白 色的水凝胶（见图5)，这与CTD 1形成的透明水凝胶是不同的，另外这种多肽形成的水凝胶 在温度下降的时候是不可恢复的，说明成胶的机制可能有所不同。再者，重复了四次的CTD 1 的成胶的最低温度由65°C降到50°C，说明我们可以通过调节CTDj^重复数，来调节其成胶 的温度，以适应不同领域的需要。 实施例6
[0074] 本实施例是（R印)x - (CTDn)y中X取4、y取1、n取1的（R印）4 - CTD1的水凝胶的 制备。
[0075] 本实施例通过测定实施例2中浓缩后的（Rep)4 - CTD1的蛋白浓度，并将其稀释到 50~150mg/mL ;然后将此蛋白溶液分装到小玻璃瓶中，测试不同温度下成胶的情况；再将 形成的水凝胶冷冻干燥，并利用扫描电子显微镜观察水凝胶的表面特征。
[0076] 结果显示，（R印)4 _ CTD^去了高温成胶的性能，只能在2°C~10°C范围内形成白 色的水凝胶（见图6)，且在温度升高时是可恢复的。这与（CTD 1)4形成的水凝胶的颜色是 一致的，虽然它们分别是在低温和高温条件下形成的，但可能其成胶机制有一定的相似性。 另外，其在低温下形成的水凝胶的孔径更为紧密（见图7)，这可能是由于Rep存在的原因。 实施例7
[0077] 本实施例是对由CTD1制备形成水凝胶的物理化学表征。
[0078] 本实施例通过实施例2的方法，得到浓度为150mg/mL的蛋白溶液。利用旋转流变 仪（HAAKE MARS III)以lrad/s的频率、2°C /min的实验条件，测定0°C~80°C间的流变学 性质。
[0079] 结果显示，CTD1在低温下的弹性模量（G'）要小于损耗模量（G"），说明未形成水 凝胶，这可能是由于低温维持的时间不足以使其形成水凝胶；另外，随着温度的上升，G'和 G"出现交点，随后G' >G"，说明此温度下发生相变，形成水凝胶，且弹性模量的最大值可达 到IO5Pa(见图8)。故，高温条件下形成的水凝胶具有很好的弹性，又因为这种水凝胶具有 热不可恢复性，所以可应用于组织工程等医学应用。
【主权项】
1. 一种基于蜘蛛丝蛋白的温敏性水凝胶的制备方法，其特征在于，通过将人工设计的 核苷酸序列无缝连接到PET -19b质粒载体上，经由大肠杆菌表达后采集其中的蛋白溶液并 稀释于磷酸盐缓冲液中，最后通过对应的温度控制形成水凝胶； 所述的多肽为（R印)x - (CTDn)y，其中：整数X代表R印，即络新妇属蜘蛛（N印hila clavipes)牵引丝蛋白I(MaSPl)中单体序列重复的次数，取值范围为[0,16];整数y代表 CTD，即络新妇属蜘蛛（Nephila clavipes)、园蛛科蜘蛛（Araneus diadematus)或非洲育儿 网蛛（Euprosthenops australis)的MaSPl的羧基末端结构域（CTD)序列重复的次数，取 值范围为[1，8];整数n代表CTD的种类，当n取1、2、3时，分别代表NcCTD、AdCTD、EaCTD。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的Nephila clavipes牵引丝蛋白 I (MaSPl)重复序列的单体氨基酸序列，如Seq ID No. 1所示；所述的NcCTD的氨基酸序列 如Seq ID No. 3所示；所述的AdCTD的氨基酸序列如Seq ID No. 4所示；所述的EaCTD的氨 基酸序列如Seq ID No. 5所示。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的人工设计核苷酸序列，包括：Rep、 NcCTD、AdCTD和EaCTD的人工核苷酸序列，其中： 所述的Rep的人工核苷酸序列如Seq ID No. 2所示； 所述的NcCTD的人工核苷酸序列如Seq ID No. 6所示； 所述的AdCTD的人工核苷酸序列如Seq ID No. 7所示； 所述的EaCTD的人工核苷酸序列如Seq ID No. 8所示。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的温度控制，具体为： a) 对（R印)x - (CTDn)y中，X为0, y为1，n取1~3间的任意整数的多肽CTD n来说，温 度设置为2°C~KTC时，可形成透明且可热回复的水凝胶；温度设置为65°C~85°C时，形成 透明且热不可回复的水凝胶； b) 对（Itep) x - (CTDn) y中，X为0, y为4, n取1~3间的任意整数的多肽（CTD n) 4来说， 温度设置为50°C~80°C时，形成白色且热不可回复的水凝胶； c) 对（R印)x - (CTDn)y中，X为4, y为1，n取1~3间的任意整数的多肽（R印）4 - CTDn 来说，温度设置为2°C~KTC时，形成白色且热可回复的水凝胶。5. -种基于蜘蛛丝蛋白的温敏性水凝胶，其特征在于，根据上述任一权利要求所述方 法制备得到。6. 根据权利要求5所述的基于蜘蛛丝蛋白的温敏性水凝胶，其特征是，所述的水凝胶 弹性模量为10°~10 5Pa。
【专利摘要】一种生物技术领域的基于蜘蛛丝蛋白的温敏性水凝胶，通过将人工设计蜘蛛丝蛋白的羧基端结构域(CTD)及其衍生肽段的核苷酸序列，再将其无缝连接到pET‐19b质粒载体上，经由大肠杆菌表达后分离纯化，最后通过对应的温度控制形成水凝胶。本发明利用蜘蛛丝蛋白的CTD及其衍生肽段制备得到孔径致密且弹性模量高达105Pa的水凝胶，具体可用于组织工程等医学领域。
【IPC分类】A61L27/52, A61L27/22, C07K14/435, C12N15/70
【公开号】CN105031723
【申请号】CN201510350217
【发明人】夏小霞, 秦看看, 钱志刚, 周名亮, 宋雯雯
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年6月23日