发酵实验的微生物群落中 的拟杆菌种系型的丰度。示出4个主要拟杆菌种-样种系型（OTU)。y-轴描述序列数目的 10-l〇g值，其与丰度正相关。含有酪蛋白水解产物的营养组合物明显地抑制拟杆菌丰度，其 可通过碳水化合物以及存在于产品中的肽二者介导。图5显示在T=18下，在暴露于本公开 内容的非-消化的或消化的（因此>500Da)酪蛋白水解产物（以低浓度加入并用454焦磷 酸测序测定）后，本公开内容的酪蛋白水解产物（APZ-1)对粪便发酵实验的微生物群落中 拟杆菌属水平的影响。y-轴描述与丰度相关的序列数目的10-l〇g值。本公开内容的酪蛋 白水解产物抑制拟杆菌丰度，表明成品的作用部分地受存在于产品中的水解产物/肽部分 的介导。包括作为参照的本公开内容的含有酪蛋白水解产物的营养组合物（消化的，以低 浓度）。图6 & 7显示在T=18下，在暴露于本公开内容的消化的（因此>500Da)酪蛋白水 解产物（APZ-1)(以高（图6)浓度（19mg/ml)或低（图7)浓度（9. 5mg/ml)加入并用 454焦磷酸测序测定）后，粪便发酵实验的微生物群落中拟杆菌种系型的丰度。y-轴描述 序列数目的10-l〇g值，其与丰度正相关。本公开内容的酪蛋白水解产物明显地抑制拟杆菌 丰度，表明成品的作用部分地受存在于产品中的水解产物/肽部分的介导。有趣地，水解产 物主要影响涉及奠便拟杆菌（B. stercoris)/单形拟杆菌（B. uniformis)的0TU013和 4f58,而对0TU0〇6(多形拟杆菌群（B. thetaiotaomicron group))和〇22〇(脆弱类杆菌 群（B. fragilis group))观察到很少的作用至没有作用。在文献（Giongo等，2010)中， 在发生T1D的儿童的微生物群中观察到单形拟杆菌（B. uniformis)和在对照儿童中的脆 弱类杆菌（B. fragilis)的丰度增加，意味着水解产物对这些菌群的作用可能在对抗T1D 的发展中是有益的。
[0215] 在婴儿粪便样品发酵的体外模型中，本公开内容的含有酪蛋白水解产物的营养组 合物或本公开内容的酪蛋白水解产物对双歧杆菌组成没有明显的影响。拟杆菌类的丰度在 粪便菌群暴露于包括本公开内容的含有酪蛋白水解产物的营养组合物的各种商业产品后 受到严重的影响，并且这还可涉及糖类发酵。粪便生态系统暴露于水解产物影响拟杆菌群， 如通过qPCR所测定的。本公开内容的酪蛋白水解产物对粪便拟杆菌/单形拟杆菌群有显 著的生长抑制作用。对多形拟杆菌（B. thetaiotaomicron)或脆弱类杆菌（B. fragilis) 群仅有很少的作用至没有作用。注意到某些拟杆菌种类，卵形拟杆菌（B. ovatus)、脆弱类 杆菌、普通拟杆菌（B. vulgates)、单形拟杆菌可与自身免疫或慢性炎性疾病相关。在这方 面，拟杆菌种类的减少可能意味着潜在的健康益处。
[0216] 氨基酸和短链脂肪酸 图8显示用低浓度的本公开内容的含有消化的（因此>500Da)酪蛋白水解产物的营养 组合物的粪便发酵实验于T=0和T=6下的谷氨酸浓度。对照条件使用MES缓冲液。与成品 一起加入的谷氨酸浓度（微克/ml)在发酵期间降低。这可表明有益的作用，因为在血浆中 的谷氨酸水平升高与T1D发病有关（Oresic等，2008)。
[0217] 图9显示用以低浓度加入的本公开内容的非-消化的酪蛋白水解产物（APZ-1)的 粪便发酵实验于T=0和T=6下的谷氨酸浓度。对照条件使用MES缓冲液。与水解产物一起 加入的谷氨酸浓度（微克/ml)在发酵期间稍有降低，表明本公开内容的含有酪蛋白水解产 物的营养组合物对谷氨酸水平的作用可能部分地受存在于产品中的水解产物/肽部分的 介导。
[0218] 与其它产品比较，在本公开内容的含有酪蛋白水解产物的营养组合物、本公开内 容的含有酪蛋白水解产物和氨基酸的营养组合物和Similac的发酵后谷氨酸生产降低，伴 有脯氨酸和苏氨酸增加。
[0219] 图10显示用以低浓度加入的消化的（因此>500Da)产品Alimentum Similac和 本公开内容的含有酪蛋白水解产物的营养组合物的粪便发酵实验于T=0和T=6下的a -氨 基-n- 丁酸浓度（微克/ml)。对照条件使用MES缓冲液。本公开内容的含有酪蛋白水解产 物的营养组合物在发酵期间比Similac显著更大程度地刺激a -氨基-n- 丁酸的生产。
[0220] 图11显示用以低浓度加入的本公开内容的消化的（因此>500Da)酪蛋白水解产 物（APZ-1)的粪便发酵实验于T=0和T=6下的a -氨基-n- 丁酸浓度（微克/ml)。对照条 件使用MES缓冲液。这些结果强烈地表明水解产物/肽部分有助于含有酪蛋白水解产物的 营养组合物的作用。
[0221] 图12显示用以低浓度加入的本公开内容的含有消化的（因此>500Da)酪蛋白水 解产物的营养组合物的粪便发酵实验于T=0和T=6下的脯氨酸浓度（微克/ml)。对照条件 使用MES缓冲液。本公开内容的含有酪蛋白水解产物的营养组合物在发酵期间刺激脯氨酸 生产。
[0222] 图13显示用以低浓度加入的本公开内容的消化的（因此>500Da)酪蛋白水解产 物（APZ-1)的粪便发酵实验于T=0和T=6下的脯氨酸浓度（微克/ml)。对照条件使用MES 缓冲液。这些结果强烈地提示水解产物/肽部分参与本公开内容的含有酪蛋白水解产物的 营养组合物的脯氨酸刺激作用。
[0223] 本公开内容的含有酪蛋白水解产物的营养组合物和本公开内容的含有酪蛋白水 解产物和氨基酸的营养组合物的发酵导致羟基脯氨酸比其它产品更大的增加，而赖氨酸则 更少耗尽。
[0224] 图14显示用以低（9. 5 mg/ml)和高浓度（19 mg/ml)加入的消化的（因此>500Da) Alimentum Similac和本公开内容的含有酪蛋白水解产物的营养组合物的奠便发酵实验于 T=6下的丁酸浓度（微克/ml)。对照条件使用MES缓冲液。与Similac比较，本公开内容 的含有酪蛋白水解产物的营养组合物导致丁酸生产增加。
[0225] 图15显示用以低（9. 5 mg/ml)和高浓度（19 mg/ml)加入的本公开内容的消化的 (因此>500Da)酪蛋白水解产物（APZ-1)的粪便发酵实验于T=6下的丁酸浓度（微克/ml)。 对照条件使用MES缓冲液。这些结果表明存在于成品中的水解产物/肽有助于对丁酸生产 的作用。
[0226]与其它产品比较，在用本公开内容的含有酪蛋白水解产物的营养组合物的发酵中 观察到丁酸的最高生产，也反映了丁酸：（乙酸+丙酸）的最高比例。
[0227] 在发酵实验中，本公开内容的含有酪蛋白水解产物的营养组合物被发现在刺激多 种氨基酸（谷氨酸、苏氨酸）和短链脂肪酸，特别是丁酸方面优于其它产品。
[0228] CCK的刺激 与部分水解产物（例如，Gentlease)或游离氨基酸比较，发现本公开内容的酪蛋白水 解产物刺激CCK从STC-1(肠内分泌细胞系）释放。而且，来自本公开内容的酪蛋白水解 产物的特定的肽可刺激CCK从STC-1细胞释放（DISLLDAQSAPLR、ALPMHIR、GPVRGPFP)。这 些结果可以转化成潜在的饱腹感和胃肠道动力支持作用。
[0229] 动物模型（N0D小鼠） 本公开内容的含有酪蛋白水解产物的营养组合物和本公开内容的酪蛋白水解产物减 少实验动物模型（分别是N0D小鼠和DP-BB大鼠模型）中T1D的发病率。
[0230] 实施例2:小鼠0细胞测定 材料和方法：胰岛素分泌（BRIN-BD11)细胞被维持在含有11. 1 mM葡萄糖、补充有10% (v/v)胎牛血清、2 mM谷氨酰胺、50 IU/mL青霉素、0.05 mg/mL链霉素的Gibco? RPMI-1640 培养基中，并于37°C在含有5% 0)2和95%空气的潮湿气氛中培养。
[0231] 对于胰岛素分泌实验，BRIN BD11细胞用1. 1 mmol/L葡萄糖Krebs培 养40分钟。然后所有孔用（1) 16. 7 mmol/L葡萄糖Krebs和10 mmol/L丙氨酸 或（2) 16.7 mM葡萄糖和1mg/mL广泛水解的酪蛋白处理20分钟。该处理后，除 去上清液并冷冻直至分析胰岛素。使用Mercodia超灵敏大鼠胰岛素ELISA试剂盒 (Mercodia AB, Uppsala,瑞典）测量分泌的胰岛素。蛋白质含量使用二辛可宁酸 (BCA)蛋白质测定法测定，且浓度表示为如前所述的ng胰岛素/mg蛋白质（Wallace 等2012)。细胞活力通过MTT (3-(4,5_二甲基噻唑-2-基）-2,5_二苯基-2H-四唑 績溴化物）测定法评价。
[0232] 加入最终浓度10ng/mL的经选择的具有已知对0 -细胞功能和活力有害作用的细 胞因子白介素10 (IL-1P)、白介素-23 (IL-23)、干扰素-y(IFN-y)。选择浓度以不诱 导细胞毒作用，但引起温和的作用，以允许广泛水解的酪蛋白的潜在救援作用的研究。
[0233] 对于胰岛素分泌实验，10mM丙氨酸和16. 7 mM葡萄糖用作阳性对照。诱导胰岛素 分泌超过这种阳性对照品的样品被认为是有效的促分泌素。
[0234] 广泛水解的酪蛋白在暴露于IL-1 0时对胰岛素分泌的作用（n=4)描述于图16A 中。值是平均值土 SEM。Glu表示16. 7 mM葡萄糖，和Glu/Ala表示16. 7 mM葡萄糖和10 mM丙氨酸（阳性对照）。进行方差分析，整体显著性为P〈 0.001。事后分析揭示与阳性对 照的显著性差别（* P〈〇. 05)。广泛水解酪蛋白证实比阳性对照更大程度地显著促进胰岛素 分泌的能力。
[0235] 图16B显示>500Da部分的广泛水解酪蛋白的相应的作用。Glu-IL-1表示未暴 露于IL-10的葡萄糖对照，G/A-IL-10表示未暴露于IL-10的葡萄糖/丙氨酸对照，Glu: 葡萄糖表示暴露于IL-1P的对照品，和G/A:葡萄糖/丙氨酸表示暴露于IL-1P的对照品。
[0236] 图17描述水解产物样品在暴露于IFN-y时对胰岛素分泌（n=4)的影响。值是平 均值土SEM。Glu表示16. 7 mM葡萄糖，和Glu/Ala表示16. 7 mM葡萄糖和10 mM丙氨酸 (阳性对照）。进行方差分析，整体显著性为P〈 0.001。事后分析揭示与阳性对照的显著 性差别（**P〈0. 01)。广泛水解酪蛋白证实比阳性对照更大程度地显著促进胰岛素分泌的 能力。
[0237] 图18A描述广泛水解酪蛋白在暴露于IL-23时对胰岛素分泌（n=4)的影响。值 是平均值土SEM。Glu表示16. 7 mM葡萄糖，和Glu/Ala表示16. 7 mM葡萄糖和10 mM丙 氨酸（阳性对照）。进行方差分析，整体显著性为P〈 0.001。事后分析揭示与阳性对照的 显著性差别（** P〈〇.01)。广泛水解酪蛋白证实比阳性对照更大程度地显著促进胰岛素分 泌的能力。
[0238] 图18B显示>500Da部分的广泛水解的酪蛋白对于IL-17的相应的作用。G/ A-IL-17:葡萄糖/丙氨酸表示未暴露于IL-17的对照，Glu:葡萄糖表示暴露于IL-17的对 照，和G/A:葡萄糖/丙氨酸表示暴露于IL-17的对照。
【主权项】
1. 一种通过给予受试者包含酪蛋白水解产物的组合物，在受试者中减少自身免疫性疾 病的风险，治疗自身免疫性疾病和/或减轻自身免疫性疾病的症状的方法，其中所述水解 产物由分子量超过500 Da的肽组成。2. 权利要求1的方法，其中所述自身免疫性疾病选自1型糖尿病、克罗恩氏病、溃疡性 结肠炎、代谢综合征、HLA-DQ8相关疾病、HLA-DQ2相关疾病和腹腔疾病。3. 权利要求2的方法，其中所述自身免疫性疾病是1型糖尿病。4. 权利要求1的方法，其中所述水解产物包含至少3种选自SEQ ID NO: 1-68的肽。5. 权利要求4的方法，其中所述水解产物包含至少3种选自SEQ ID NO: 1-24的肽。6. 权利要求5的方法，其中所述水解产物包含至少3种选自SEQ ID NO: 1-15的肽。7. 权利要求4的方法，其中所述水解产物包含具有SEQ ID NO: 1的肽和至少3种选自 SEQ ID NO: 2-68 的肽。8. 权利要求1的方法，其中所述水解产物以包含脂质或脂肪相和蛋白质源的营养组合 物给予。9. 权利要求8的方法，其中所述营养组合物包含约0. 1-约I g/100 kcal的益生元组 分，其中所述益生元组分包含至少20%的寡糖。10. 权利要求8的方法，其中所述营养组合物还包含约5-约100 mg/100 kcal的长链 多不饱和脂肪酸源，所述长链多不饱和脂肪酸包括二十二碳六烯酸。11. 权利要求10的方法，其中所述营养组合物还包含花生四烯酸。12. 权利要求1的方法，其中所述受试者是人类儿童或青少年。13. 权利要求1的方法，其中营养制剂还包含碳水化合物、核酸、脂质、矿物质、合成代 谢营养物、维生素、抗氧化剂、益生菌菌株和抗脂肪肝剂中的一种或多种。
【专利摘要】本公开内容提供通过给予包含选自酪蛋白水解产物的肽的组合物，减少自身免疫性疾病的风险的方法。这样的组合物可减轻自身免疫性疾病的症状，并可以是自身免疫性疾病，特别是1型糖尿病的治疗。优选地，所述水解产物由分子量超过500Da的肽组成。
【IPC分类】A61P37/06, A61K38/01
【公开号】CN105073126
【申请号】CN201480015737
【发明人】D.洪曼, E.A.F.范托尔, G.格罗斯, M.H.舍马克, T.T.兰伯斯
【申请人】Mjn 美国控股有限责任公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2014年3月11日
【公告号】CA2905817A1, US20140274892, WO2014150566A1