间充质干细胞分泌因子精华液及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明方法涉及一种精华液及其制备方法和应用，更具体地，涉及间充质干细胞 (MSC)分泌因子精华液及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 在美容化妆品的发展史中，第一代使用天然的动植物油脂对皮肤做单纯的物理防 护；第二代为通过油水混合技术生产的化妆品；第三代为含有纯天然动植物萃取精华的化 妆品，例如，将皂角、木瓜或者深海鱼等的动植物精华加入到化妆品中去；第四代为仿生化 妆品，即采用生物技术制作与人体自体结构相仿、并具有亲和力的生物精华物质。随着生物
技术领域的发展，第五代纯生物制剂化妆品又一次发生重大突破，使得含有生物活性因子 的化妆品在美容界倍受青睐。
[0003] 间充质干细胞（mesenchymalstemcell,MSC)是属于中胚层的一类多能干细胞， 具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下不仅可分化为成骨细 胞、软骨细胞、脂肪细胞，还具有分化为肌细胞、肝细胞、造血细胞、神经细胞、胰岛细胞等多 种细胞的能力，MSC细胞可以在适合的环境中分化成特定细胞来修复损伤组织，而旁分泌作 用在治疗组织损伤中发挥了更大的作用，即MSC分泌细胞因子在组织修复中起了很大的作 用。
[0004] 题目为"可促进皮肤修复与再生的美容护肤品及其制备方法和应用"的专利申请 201310493266.X公开了一种美容护肤品，该美容护肤品除了含有体外培养的间充质干细胞 分泌到胞外的活性物质成分之外，还含有细胞培养液配置步骤中添加的营养成分，诸如氨 基酸、维生素、糖、微量元素、不饱和脂肪酸、抗氧化剂和细胞生长因子，该美容护肤品易于 造成人体皮肤过敏，从而对人体带来危害，而且该美容护肤品中的MSC分泌因子不稳定，在 体外易于发生化学变化而导致含量急剧降低，从而影响产品保质期。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中精华液容易导致过敏的缺陷，根据本发明的一个方面，提供了一 种不含过敏源的间充质干细胞（MSC)分泌因子精华液。该精华液，含有：
[0006] 血管内皮生长因子，浓度范围为11. 4-0. 45ng/ml;
[0007] 表皮生长因子，浓度范围为6. 2-1.Ong/ml;
[0008] 成纤维细胞生长因子，浓度范围为8. 5-2. 4ng/ml;
[0009] 肝细胞生长因子，浓度范围为40. 8-0. 6ng/ml;
[0010] 白细胞介素6,浓度范围为17. 1-1. 5ng/ml;以及
[0011] 白细胞介素8,浓度范围为32.3-0.4ng/ml。
[0012] 针对现有技术中精华液不稳定，保质期短的缺陷，根据本发明的另一方面，提供了 一种在上述不含过敏源的间充质干细胞（MSC)分泌因子中添加白蛋白的精华液。该精华液 含有
[0013] 血管内皮生长因子，浓度范围为11. 4-0. 45ng/ml;
[0014] 表皮生长因子，浓度范围为6. 2-1.Ong/ml;
[0015] 成纤维细胞生长因子，浓度范围为8. 5-2. 4ng/ml;
[0016] 肝细胞生长因子，浓度范围为40. 8-0. 6ng/ml;
[0017] 白细胞介素6,浓度范围为17. 1-1. 5ng/ml;
[0018] 白细胞介素8,浓度范围为32. 3-0. 4ng/ml;以及
[0019] 人血清白蛋白，浓度范围为10mg/mL。
[0020] 根据本发明的又一方面，提供了一种制备上述两种精华液的方法。该方法包括以 下步骤：
[0021] 将间充质干细胞接种于无血清间充质干细胞培养基中并培养；
[0022] 收集间充质干细胞培养的营养上清；以及
[0023] 提纯营养上清以得到间充质干细胞分泌因子精华液以得到不含过敏源的间充质 干细胞（MSC)分泌因子精华液。
[0024] 在上述方法中，提纯营养上清以得到间充质干细胞分泌因子精华液的步骤进一 步包括：以2000转/分钟的转速离心10分钟，去除营养上清中的间充质干细胞；以及 利用2000da-3000da的透析袋或超滤管浓缩营养上清、去除营养上清中残留的培养基成 分，同时截留间充质干细胞分泌因子以得到浓度为I. 5mg/ml的含间充质干细胞分泌因子 的浓缩液；其中，去除的培养基成分包括氨基酸类：甘氨酸（75da)、丙氨酸（89da)、酪氨 酸（225da);维生素类：烟酰胺（122da)、核黄素（376da)、维生素B12(1355da);无机盐： 氯化钠（58da)、碳酸氢钠（84da)、亚硒酸钠（362da);微量元素：硫酸铜（160da)、硫酸猛 (151da)、硫酸锌（161da);葡萄糖（180da);酌红（376.4da)。
[0025] 在上述方法中，在提纯营养上清以得到间充质干细胞分泌因子精华液的步骤之 后，进一步包括：向间充质干细胞分泌因子中添加人血清蛋白以得到含有人血清白蛋白的 间充质干细胞分泌因子精华液，其中，在含有人血清白蛋白的间充质干细胞分泌因子精华 液中，人血清白蛋白的浓度为10mg/mL。
[0026] 在上述方法中，精华液中含有的间充质干细胞分泌因子包括：血管内皮生长因子， 分子量为34-45KD;表皮生长因子，分子量为6KD;成纤维细胞生长因子，分子量为16. 4KD; 肝细胞生长因子，分子量为11-17KD;白细胞介素6,分子量为21-30KD;以及白细胞介素8， 分子量为69-79KD。将这些间充质干细胞分泌因子应用于皮肤，可以发挥美容、抗衰老的功 能。
[0027] 在上述方法中，在将间充质干细胞接种于间充质干细胞培养基中并培养的步骤之 前，进一步包括：
[0028] 从骨髓、脐血、脐带、脂肪的组织中分离间充质干细胞。
[0029] 在上述方法中，将间充质干细胞接种于间充质干细胞培养基中并培养的步骤包 括：将间充质干细胞以IXlOfVml至5X106/ml的密度接种于培养基中；在37°C、5%C02、饱 和湿度下培养；诱导贴壁，72小时后全量换液，去除非贴壁细胞，添加新鲜培养基；以及当 贴壁细胞的融合度为85% -95%时，胰酶传代；其中，培养基为IMDM基础培养基。
[0030] 在上述方法中，当每次细胞融合度为85% -95%时，收集间充质干细胞培养的营 养上清，并4°C储存备用。
[0031] 根据本发明提供的方法制备的间充质干细胞分泌因子精华液可应用于美容、护肤 品中的霜剂、乳剂、水剂、膏剂、凝胶剂、粉剂、冻干产品。
[0032] 在本发明提供的间充质干细胞（MSC)分泌因子精华液的制备方法中，通过使用 2000da-3000da的透析袋或超滤管可以脱除培养基中诸如甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸等过敏成 分，同时保留间充质干细胞分泌因子，以便在发挥美白、抗衰老的同时，防止皮肤发生过敏， 最大程度地降低对人体皮肤的危害，从而使得通过本发明提供的方法制备的间充质干细胞 (MSC)分泌因子精华液能够放心、安全地使用。
[0033] 通过在间充质干细胞（MSC)分泌因子中添加人血清白蛋白，有利于充质干细胞 (MSC)分泌因子的稳定性，从而保持蛋白在存储过程中的生物活性，同时也避免了异源蛋白 的加入，此外，在作用于皮肤时，也能起到美容保湿的效果。
[0034] 综上，由于通过本发明提供的方法制备的间充质干细胞（MSC)分泌因子精华液中 不含有培养基成分和细胞组分，因此，可以避免外来添加剂对人体和皮肤的伤害，避免了皮 肤发生过敏的潜在危害，同时通过添加人血清白蛋白可以使得精华液中的间充质干细胞 (MSC)分泌因子更加稳定，以便更加长久地发挥其生物活性。从而，通过本发明提供的方法 制备的间充质干细胞（MSC)分泌因子精华液具有美白、抗衰老的效果，以及无副作用、稳定 性好等优点。此外，通过本发明提供的方法还具有简单易行，易于大规模生产的优点。
【附图说明】
[0035] 图1根据本发明的实施例4示出了在使用不同浓度的MSC分泌因子过程中手部皮 肤黑色素含量的变化。
[0036] 图2根据本发明的实施例4示出了使用MSC分泌因子过程中手部亮度的变化。
[0037] 图3是根据本发明的实施例6示出裸鼠皮肤平滑深度对比分析的柱状图。
[0038] 图4是根据本发明的实施例6示出裸鼠皮肤平均粗糙度对比分析的柱状图。
[0039] 图5是根据本发明的实施例6示出了裸鼠皮肤算术平均粗糙度对比分析的柱状 图。
【具体实施方式】
[0040] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施 例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通 技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0041] 实施例1脐血MSC分离培养
[0042] 将收集的顺产婴儿8小时内的脐血和Gibco生产的1640培养基等量混匀，与天津 灏洋生物制品科技有限责任公司生产的Ficoll分离液按照2:1的体积置于分离液上方， 1800转/分钟离心15分钟，收集单核细胞，根据单核细胞数量，按照1-5XIOfVml接种于 MSC无血清培养基中，在37°C、5 %CO2、饱和湿度下培养，诱导贴壁，72小时后全量换液，去 除非贴壁细胞，添加新鲜培养基，待贴壁细胞融合85-95%左右时，胰酶传代。
[0043] 实施例2MSC分泌因子提取
[0044] 收集MSC融合度为85-95%的培养营养上清，2000转/分钟离心10分钟，去除培 养基中残余细胞，把培养基加入2000da到3000da的超滤管中，5000rpm离心30min，去除培 养基中残余成分，离心完后使用无菌水洗涤一次，彻底清除残留培养基。
[0045] 实施例3MSC生物活性因子美容精华液制备
[0046] 收集MSC因子，浓度定容