[0066] 对测序正确的PMD-19T-IL12的质粒进行双酶切处理，同时，对pCAGGS载体以同样 的酶切位点进行双酶切，胶回收1. 6kb左右DNA片段和质粒，以IL12 :pCAGGS为1:3-1 :10 的比例，两个总体积为8yL，再加入10xT4DNALigasebufferlyL，T4DNA连接酶lyL 至总体积为10μL，16°C连接18小时。将连接产物转化DH5a感受态细胞，在含有氨苄青霉 素的LB平板上37°C培养。
[0067] 5.在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取单个菌落，菌落进行PCR、质粒双酶切鉴定。 菌落PCR的反应体系为：上、下游引物（20μ mol/L)各0.2 μL，菌液1. 2 μL，ddH208.4μ L， R TaqlOyL。反应参数为：94°C处理 4min，然后 94￡€3〇8、55￡€3〇8、72￡€211^11，共30个循 环，72°C延伸10min。PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶电泳观察，可见约为1.6kb的扩增条带， 检测结果如图1所示。将鸡白细胞介素12基因真核表达质粒pCAGGS-IL12分别用EcoRl、 Xhol进行双酶切，酶切产物在1%琼脂糖凝胶电泳观察，pCAGGS-IL12双酶切后产生约为 4. 8kb和1.6kb左右的两条带，证明已经成功构建了鸡白细胞介素12基因真核表达质粒，并 送测序鉴定，命名测序正确的质粒为PCAGGS-IL12。
[0068] 6.鸡白细胞介素12基因真核质粒pCAGGS-IL12的表达。在100ml的三角瓶中加 入40mL含氨苄LB培养基，加入100yL的上述菌液，37°C，230rpm/min，培养14h。同时，对 空载体也进行摇菌，用MN去内毒质粒抽提盒，抽提的质粒用Lipofectamine 3000转染293T 细胞，通过western blot、间接免疫荧光鉴定其表达，间接免疫荧光鉴定其表达见图2所示 (为p CAGGS-IL12转染到293T细胞，用抗鸡IL12的抗体，通过间接免疫荧光来验证IL12 的表达）。鉴定表达后，对质粒进行大提，质粒浓度为lmg/ml，即为鸡白细胞介素12基因分 子佐剂PCAGGS-IL12。该分子佐剂与DNA疫苗用上海塔瑞莎公司的活体基因导入仪的方法 进行预防接种。
[0069] 7.用该分子佐剂与构建的新城疫含F基因的质粒（pCAGGS-F)联合应用（所述 的F基因核苷酸序列见SeqIDNO:9)，该分子佐剂与DNA疫苗用上海塔瑞莎公司的活体基 因导入仪的方法进行预防接种。PCAGGS-IL12与pCAGGS-F在鸡体内应用的初步安全性评 价：PCAGGS-IL12与pCAGGS-F在鸡体内大剂量应用（肌肉注射，1:1，各200μg)。观察其 体温、体重、一般状况等，结果显示，体温为40-42Γ，体重与对照组（未做任何处理组）无 明显差别，均在上升。精神状态良好，无异常反应。进一步分析PCAGGS-IL12作为佐剂的作 用，将14日龄健康SPF雏鸡，随机分成5个组，每组10只，分别用PBS液（0. 2ml)、pCAGGS、 pCAGGS-F(100μg)、pCAGGS-F+pCAGGS-IL12 (100μg+100μg)、pCAGGS-IL12 (100μg)腿部 肌肉电穿孔注射进行免疫，于14日龄、28日龄、42日龄进行免疫，每周进行翅静脉釆血，分 离血清，监测抗体水平，于三免后14天用NDV强毒进行攻毒保护实验。测定结果发现，在免 疫后加PCAGGS-IL12佐剂组鸡血清总IgG值二免后第7天起就一直高于DNA疫苗单独注 射组。攻毒结果显示PBS对照组和pCAGGS对照组死亡率为100%，pCAGGS-IL12死亡率为 100 %。pCAGGS-F死亡率为 30 %，pCAGGS-IL12+pCAGGS-F疫苗组死亡率为 0 %，pCAGGS-IL12 与pCAGGS-F核酸疫苗在SPF体内共免疫，可显著增强核酸疫苗的免疫效果，发挥理想的基 因佐剂功能。但需要进一步对免疫剂量及电穿孔参数进行改善，为IL-12作为佐剂的研究 奠定了基础。
[0070] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂，其特征在于：所述的高效新城疫DNA疫苗的 分子佐剂为将鸡白细胞介素12的构建到真核表达载体pCAGGS中，获得重组鸡白细胞介素 12的真核表达载体pCAGGS-IL12。2. 根据权利要求1所述的高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂，其特征在于：所述的重组 鸡白细胞介素12通过下述的四对引物扩增的获得： IL12亚单位P40的扩增引物对： IL12-p40-Fl：SEQIDNO：1 ； IL12-p40-Rl：SEQIDNO：2 ； IL12亚单位P35的扩增引物对： IL12-p35-Fl：SEQIDNO：3 ； IL12-p35-Rl：SEQIDNO：4 ； IL12亚单位P40的拼接引物对： IL12-p40-F2：SEQIDNO：5 ； IL12-p40-R2：SEQIDNO：6 ； IL12亚单位P35的拼接引物对： IL-12-p35-F2：SEQIDNO：7 ； IL-12-p35-R2:SEQIDNO:8。3. 权利要求1或2所述的高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂的制备方法，其特征在于： 上述的高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂的制备方法为：采用（G4S) 3疏水的柔性氨基酸接 头连接的方案获取rIL-12的P40、P35融合基因，融合基因插入真核表达质粒pCAGGS，构建 pCAGGS-IL12〇4. 根据权利要求3所述的高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂的制备方法，其特征在于： 所述的采用（G4S) 3疏水的柔性氨基酸接头连接的方案获取rIL-12的P40、P35融合基因的 制备方法，包括以下步骤： (1) 首先单独设计引物分别扩增IL12亚单位P40和P35,获得IL12亚单位P40和P35 基因片段，其中IL12亚单位P40的扩增引物对序列如下： IL12-p40-Fl：SEQIDNO：1 ； IL12-p40-Rl：SEQIDNO：2 ； IL12亚单位P35的扩增引物对序列如下： IL12-p35-Fl：SEQIDNO：3 ； IL12-p35-Rl：SEQIDNO：4 ； (2) 以步骤（1)扩增获得IL12亚单位P40和P35基因片段为模板，用含酶切位点和互 补的linker(G4S) 3的连接引物去扩增，获得IL12亚单位P40和P35基因的拼接片段，上游 目的基因P40去掉终止密码子TTA，下游目的基因P35去掉起始密码子ATG，所述的连接引 物如下： 其中，IL12亚单位P40的拼接引物对序列如下： IL12-p40-F2：SEQIDNO：5 ； IL12-p40-R2：SEQIDNO：6 ； IL12亚单位P35的拼接引物对序列如下： IL-12-p35-F2：SEQIDNO：7 ； IL-12-p35-R2：SEQIDNO：8 ； (3)再次分别以步骤（2)胶回收获得的拼接片段产物按照总量1:1的比例，加入Taq酶和dNTPs，PCRbuffer，进行第一轮PCR反应，循环数为8~12 ;第一轮PCR反应后取出 2μL反应混合物作为模板，以IL12-p40-F2和IL-12-p35-R2为模版，进行第二轮PCR，循环 数28~35 ;产物回收，送测序鉴定正确后获得采用（G4S) 3疏水的柔性氨基酸接头连接的 方案获取rIL-12的Ρ40、Ρ35融合基因。5.权利要求1或2所述的高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂的应用，其特征在于：将重 组鸡白细胞介素12真核表达载体与新城疫DNA疫苗共同通过电穿孔的方法免疫动物，重组 鸡白细胞介素12真核表达载体发挥分子佐剂的作用。
【专利摘要】本发明公开了一种高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂及其制备方法和应用，属于疫苗技术领域。所述的高效新城疫DNA疫苗的分子佐剂为将鸡白细胞介素12的构建到真核表达载体pCAGGS中，获得重组鸡白细胞介素12的真核表达载体pCAGGS-IL12。本发明成功地构建了重组鸡白细胞介素12的单链双亚基真核表达质粒，不仅可保证P40、P35两亚基以1∶1比率表达，而且柔性氨基酸接头可使两个亚基充分延展、正确折叠，从而获得最大的生物学活性。pCAGGS-IL12与pCAGGS-F核酸疫苗通过电穿孔方法在SPF鸡体内共免疫，可显著增强核酸疫苗的免疫效果，发挥理想的基因佐剂功能。
【IPC分类】A61P31/14, A61K39/17, C12N15/85, A61K39/39
【公开号】CN105251001
【申请号】CN201510547261
【发明人】任涛, 李艳玲, 康银峰, 谢鹏
【申请人】华南农业大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年8月31日