高脂肪饲料，而治疗组喂饲高脂肪饲 料，并每天强饲投予2. 5, 5mg/kg的KMUP-1肥1、5mg/kg的simvastatin或其它待测药物。于 体重增加后进行生化分析。每天投予Img/kg的KMUP-mCl于预防组，收集肝脏测定3-径 基-3-甲基戊二酷辅酶A还原酶（3-hy化oxy-3-methylgluta巧 1-CoAreductase,HMGCoA reductase,HMGR)的表达。
[034引于14周的实验小鼠，从第1周喂饲高脂肪饲料至第14周。于该3个月的实验，经 由饮用方式分别于14周或是后期6周期间，或是喂饲高脂肪饲料的肥胖小鼠，投予200毫 升含有2. 5毫克KMUP-1盐酸盐的液态药物。预防组5只小鼠从第1周至第14周，治疗组 从第8周至第14周的后期6周期间，自由地饮用自来水。自来水作为常态矿物质营养。
[0349] 于高雄医学大学动物实验中屯、的日夜循环系统喂养上述动物。动物的全部照顾方 式及实验室的使用规定，遵守高雄医学大学委员会的核准指南，且依照美国国家卫生研究 院的动物照顾与使用协议。
[0350] 血液的生化分析度iochemicalanalysisofserum)
[0351] 如流程A所示2个月内喂饲3天饲料后量测小鼠的平均重量。每组小鼠体重的增 加量、血清脂肪含量（plasmalipidlevels),均加W测量体并与对照组进行比较。小鼠屯、 脏穿刺后，W90克度enchtopCentri化ge，U.S.A.)速度将收集的血液离屯、，分离血清，随 后于-80°C冻结，运用日立临床分析仪7070化itachiClinicalAnalyzer7070,日本），W 默克公司（Merck&Co.，Kenilwcxrth,NJ,Co.USA)的试剂，进行生化分析。运用临床常用方 式量测小鼠血清的甘油Ξ醋（Triglyceride)、总胆固醇（totalcholesterol)、低密度脂蛋 白固醇（low-densitylipoproteincholesterol,LDLcholesterol)、高密度脂蛋白固醇 (hi曲-densitylipoproteincholesterol,皿Lcholesterol)。动物肝脏，经分离切片后 量测肝脏的甘油Ξ醋。
[0352] 细胞培养（Cellculture)
[0353] 购自美国菌种保藏中屯、（AmericanTypeQiltureCollection(ATCC; Manassas,VA，U.S.A.)的胎pG2细胞培养于基础培养基值u化ecco'Modified Eagle'Medium,DMEM)。该基础培养基包含5%热灭活的胎牛血清（FetalBovineSerum， FB巧、lOOU/mL盘林西尼（penicillin)、100μg/mL链霉素（streptomycin)。细胞生长环境 为37°C饱和湿度空气的20%氧气（20% 02,v/v)、5%二氧化碳巧％C02)培养箱。KMUP-1 盐酸盐溶于蒸馈水，辛伐他汀（simvastatin)溶于丙二醇（propyleneglycol)投于培养基 培养24小时后，进行蛋白质萃取。分别加入含溶媒或蒸馈水最终浓度的辛伐他汀或KMUP-1 盐酸盐培养细胞后，观察在丙二醇或介质内，3-径基-3-甲基戊二酷辅酶A还原酶（HMGR) 的表达变化低于0.1%。
[0354] 西方墨点法分析HepG2细胞W及肝脏的蛋白质表现（Westernblottinganalysis ofproteinexpressioninHepG2cellsandliver)
[0355] W各种浓度的药物培养化pG2细胞后，经冷却胎牛血清洗涂2次，W终止 反应，收集细胞。W冰冷溶解缓冲溶液（lysisbuffer)W及Sigma-Al化ich公司 (Sigma-Al化ich，St.Louis，M0，U.S.A.)的蛋白酶抑制剂，将整个细胞溶解并均质化。W 90, 000克速度将均质化的血液离屯、，回收上清液作为细胞蛋白质总量（totalcellular protein)。依照BioQiain公司度ioQiainInstituteInc. ,Hayward,CA,U.S.A.)细胞胞 浆及膜（切tosolNuclearMembrane,CNM)萃取蛋白质划分试剂（compartmentprotein extractionkit)方法，进行化pG2细胞的细胞质W及细胞膜制备。所有分馈的蛋白溶液， 储存于-80°C待用。W药物衡量蛋白质的表达含量，培养与治疗24小时后的总蛋白，经萃取 后，运用如前述西方蛋白印迹方法进行分析。
[035引 SR-B1、HMGCoAreductase、PPAR丫与ROCKII的表达（theexpressionof SR-B1,HMGCoAreductase,PPAR丫andROCKII)
[0357]经分离的肝脏，切成小片后置入萃取缓冲液（extractionbuffer)，于20,OOOg离 屯、30分钟，W萃取肝脏的蛋白质。萃取缓冲液的组成为抑值为7. 0的lOmMΞ径甲基氨基 甲烧（T;ris)、2mM的苯甲基横酷氣（phenylmethylsulfonylfluoride,PMSF)、140mM的氯 化钢、5mM的二硫苏糖醇值ithiot虹eitol，DTT)、0. 5%的NP-40裂解液、0. 05mM的抑肤素 (P巧statinA)和0. 2mM的亮肤素（leupeptin)。获得的蛋白质萃取物，煮沸成为4 :1比例 的检品缓冲液。检品缓冲液的组成为lOOmM抑值为6. 8的Ξ径甲基氨基甲烧（Tris)、20% 的甘油（glycerol)、4%的十二烷基硫酸钢（SodiumDodec}dSulfate,SD巧、0.2%的漠酪 蓝化1'〇111〇地日]1〇113111日）。运用1〇%十二烷基硫酸钢聚丙締酷胺凝胶（5〇5-9〇17日(3巧1日1111(10 gel)，W100V、40mA，将 20μg蛋白质进行电泳（Electrophoresis) 1 小时。
[035引分离蛋白质经3次离心清除上层脂肪杂质，W5%脱脂奶粉转印至聚偏氣乙締 (Polyvin}dideneDifluoride，PVD巧膜，W90 分钟 100V阻隔不具非特异性的IgGs，W培 养特异性蛋白质的抗体。运用带有碱性憐酸酶1:1000标记的抗山羊、抗小鼠的抗体培养该 印迹1小时。W量测SR-BU3-径基-3-甲基戊二酷辅酶A还原酶，PPAR与ROCKII的表 达。
[0359] 3-径基-3-甲基戊二酷辅酶A还原酶活化与[14口甲径戊酸的形成（HMGCoA reduct曰se曰ctivity曰nd[14C]mev曰Ion曰teform曰tion)
[0360]于大肠杆菌化7039,Sigma-A化ich,Mo,U.S.A.)，进行人类基因重组的3-美圣 基-3-甲基戊二酷辅酶A还原酶表达的实验。运用10%十二烷基硫酸钢聚丙締酷胺凝 胶（SDS-polyac巧lamidegel)纯度>90%的蛋白质，拥有2-8units/mg蛋白质的活性， 其分子量约76kDa，W测定[14口3-径基-3-甲基戊二酷辅酶A还原酶的形成量。于 37°C，将KMUP-1、辛伐他汀等药物预培养于含有35ng/ml酶的抑7. 5憐酸缓冲液。实 验最初添加2.5yM[14C]3-^基-3-甲基戊二酷辅酶A还原酶另行培养20分钟，于添 加1N盐酸终止反应。经由管柱移除等分试样，W测定[14C]甲径戊酸的形成（riceraR Co.Ltd. ,T曰ipei,T曰iw曰η)。
[036UcGMP的途径与化oA/ROCKII(cGMPpathwayand化oA/ROCKII)
[0362]MioA激酶括抗剂5μg/ml的C3胞外酶（exoenzyme)和ROCK括抗剂10μM的Y27632,溶于10%丙締乙二醇（pop5deneglycol)，能令ROCKII失活，分别将其添加于细胞 培养液24小时。进行R0CKII的表达量测，并于胎pG2细胞量测PPAR丫、ABCA-1相关的表 达。
[036引将10μΜ的环憐酸鸟嚷岭核巧（cGMP)括抗剂化-8-pCPT-cGMPs，溶于10%丙二醇 能增加ROCKII活性，而化-8-pCPT-cGMPs诱导R0CKII活性的现象可被KMUP-1所抑制。 于化pG2细胞W化-8-pCPT-cGMPs预培养30分钟作为对照组，再添加10μΜ的KMUP-1培 养24小时。
[0364]肝脏内LDLRs的免疫组织化学染色（ImmunohistochemistiTstainingofLDLRs inliver)
[0365]W10%的福尔马林（化；rmalin)固定肝脏组织24小时，并经石蜡（paraffin) 包埋。将石蜡包埋的肝脏组织切成厚4μπι的切片，先热封再W二甲苯脱蜡，其后W梯次 浓度的乙醇加W脱水，蒸馈水进行洗涂。最后，组织切片进行过舰酸希夫瓦（Periodic Acid-Schiff，PA巧和苏木素染液（Mayer'Shematoxylin)的染色。
[0366] 为动物肝脏LDLRs，进行免疫组织化学染色（Immunohistochemistry，I肥）。让动 物经由饮用方式投予含有2. 5毫克/200毫升KMUP-1盐酸盐的液态药物，1-14周或8-14周 后，如上述方法制作的肝脏组织切片。将抗原浸泡于蔬菜蒸锅，其中放置抑9.0的祀标赋 活溶液值akotargetretrievalsolution),令已脱蜡的切片进行抗原性修复，随的W含 3.0%过氧化氨的甲醇溶液，抑制内源性过氧化物酶活性。在4°C恒湿试验箱，W含特异性 主要抗体过夜培养肝脏组织切片。WDAK0公司（DAK0，Carpinteria，CA，U.S.A.)检测系统 试剂（DAK0REALlinVisionTMDetectionSystemkit)进行检测，然后用苏木精进行复染。 经由尼康显微镜巧clipseTE200巧获得图像。
[0367] 于外源性LDL下LDLRs的表达与巧光染色巧xpressionandfluorescence stainingofLDLRsinthepresenceofexogenousLDL)
[0368] 于存在着500μg/ml外源性LDLRs,运用胎pG2细胞W检测外源性低密度脂蛋白 (LDLRs)细胞蛋白的表达。4°C下过夜培养，于化pG2细胞的LDLRs表达，W绿色巧光染料氣 棚二化咯（4, 4-二氣-1，3, 5, 7, 8-五甲基-4-棚-3A，4A-二氮杂-S-巧締，4, 4-difluorro -1, 3, 5, 7, 8-penta-methy]_-4-bora-3a, 4a-diaza-s_indacene，Bodipy493/503)和二级抗 体共辆的红色切3,可加W检测。而氣棚二化咯度0DIPY-)和低密度脂蛋白-图像，更能W 图像分析得知LDLRs位置。上述图像，是经由尼康显微镜巧clipseTE200-巧获得且进行 分析。
[0369]PKA/PKG的表达与PKA/服L的免疫活性巧xpressionofPKA/PKGand immunoreactivityofPKA/HSL)
[0370] 于化pG2细胞，添加待测化合物培养24小时，运用免疫印迹法衡量PKA/PKG的蛋 白表达，或巧光染色法衡量PKA/PKG和服L的免疫活性，更添加或无添加200μg/ml的氧化 型低密度脂蛋白（oxidizedLDLoxLDL)结合图像扫描，W评估待测化合物可否影响PKA。
[0371] 量测脂肪性肝炎的油滴直径与数量（Measurementofhepaticoilglobulet diameter)
[0372] 在全肝切片W白色条纹作为直径100μM的显微镜观测标准，借助计算机软件（微 软，美国）W测量照片中油滴的直径，并W美国惠普她）打印机打印。油滴直径和细胞数目 的增加，表示肝脏脂肪变性增多，即脂肪性肝炎（steaotohepatitis)。相对地，直径和脂肪 细胞的数量减少，显示脂肪性肝炎的形成受到抑制。在全肝切片，W尼康EclipseTE200-S 显微镜观察油滴。
[037引肝脏和附睾脂肪垫经苏木精-伊红染色（H&Estainingofliverand epididym曰1fatpads)
[0374] 小鼠肝脏、附睾脂肪垫组织及下肢主动脉W10%福尔马林固定24小时后，经石蜡 包埋。将石蜡包埋的肾皮质组织切成4μm厚标本，经热封、二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，用 蒸馈水轻轻地冲洗。最后W过舰酸雪夫氏染色（periodicacid-schiffstain)和改良的 苏木精溶液（Mayer,Shematoxylinsolution)进行染色切片。
[0375]MMP-9/TNFα、服L/p-服L/ATGLW及eNOS/比-10的免疫组织化学染色（I肥 stainingofMMP-9/TNFα，服L/p-服L/ATGLandeNOS/IL-10)
[0376] 对于脱蜡切片的基质金属蛋白酶-9(MMP-9)/肿瘤坏死因子（TNF-α)、促使激素 敏感性脂肪酶化化)/p-HSL/脂肪甘油Ξ醋脂肪酶（ATGL)、eN0S和白细胞介素-IO(IL-IO) 的抗原修复（antigenretrieval),是W在蔬菜蒸锅（veget油lesteamer)内含抑9.0赋 活溶液值akotargetretrievalsolution)进行，再W含3.0%过氧化氨化202)的甲醇溶 液，抑制其内源性过氧化物酶活性，而后进行免疫组织化学染色（IHC)。切片W特定的主要 抗体，在4°C恒溫箱化umidifiedchamber)培养过夜。使用的抗体包括经1:50稀释兔多 克隆抗eNOS(Abeam,Cambridge,UK)，或经 1:50 稀释CellSi即aling(USA)公司活化半脫 胺酸蛋白酶蛋白-3兔单克隆抗体（rabbitmonoclonalanti-cleavedcaspase-3)。使用 DAKO公司检测试剂（DAKOREAL化VisionTMDetectionSystemkit)检测切片，再经苏木 素化emato巧lin)复染。W尼康显微镜（WkonEclipseTE200-巧观察图像。
[0377] 量测脂肪性肝炎的油滴直径与数量（Measurementofoilglobuletdiameter 曰ndnumberinste曰tohep曰titis)
[0378] 经由苏木精-伊红（服巧与免疫组织化学染色（MC)的肝脏，可在显微镜下观察， 用于评估油滴直径与数量。在全肝切片W白色条纹作为直径100μΜ的显微镜观测标准，借 助计算机软件（微软，美国）W测量照片中油滴的直径，并W美国惠普化巧打印机打印。 油滴直径和细胞数目的增加，表示肝脏脂肪变性增多，即脂肪性肝炎（steaotohepatitis)。 相对地，直径和脂肪细胞的数量减少，显示脂肪性肝炎的形成受到抑制。在全肝切片，W尼 康EclipseTE200-S显微镜观察油滴。
[0379]试剂（Materialsandreagents)
[0380] 运用辣根过氧化物酶化orseradishperoxidase)-共辆二次抗体和随后的增 强化学发光巧nhancedQiemiluminescence，E化）检测（GEHealthcareBio-Sciences Ccxrp. ,Piscataway,NJ,U.S.A.)，令免疫反应的结合带呈现可视化。免疫印迹分析使用的抗 体包括抗ROCKII的抗小鼠或抗兔单株抗体（Mouseorr油bitmonoclonalantibodyfor ROCKII，Upstate,LakePlacid,NY,U.S.A.)、抗RhoA(SantaCruze,Biotechnology,Santa Cruz,CA,U.S.A.)、抗HMGCoAreductase(Upstate,LakePlacid,NY,U.S.A.)、抗 PPAR丫（Abeam,Cambridge,UK)、抗ABCA-l(CellSignaling,Boston,MA,U.S.A.)、 抗ApoA-I(Abeam,Cambridge,UK)、抗LXR口（SantaCruze,Biotechnology,Santa Cruz,CA,U.S.A.)、抗LDLR(Abcam,Cambridge,UK)、抗HSL(CellSignaling,Boston,MA,U. S.A.)、抗p-服L(CellSi即aling，NY，U.S.A.)、抗eNOS(Abcam，Cambridge，UK)、 抗MMP-9 (Abcam,Cambridge,UK)、抗TNFP(Abcam,Cambridge,UK)、抗 比-1〇(413。曰111,〔曰1]1131'1(1邑6,1]1()和加载控制蛋白0-肌动蛋白（51邑1]1曰-4化;[油,51:. Louis,MO,U.S.A.)。W兔多克隆抗体进行识别PPAR丫 1 与PPAR丫 2，化-8-pCPT-cGMPs 与C3 胞外酶购自Sigma-A化ich公司（Sigma-A化ich,St.Louis,Mo,U.S.A.)。高脂肪食 品（HFD)含60%脂肪能源的基础纯化饲料（W/60%energyf;romfat,Blue:58G9Test Diet;L油Diet,St.Louis,Missouri,U.S.A.)。巧光染色试验，LDL购自Abeam公司 (Abeam,Cambridge,UK)氧化态低密度脂蛋白（oxidizedLDLoxLDL)购自Biomedical TechnologiesInc. (Stou曲ton,MA,USA)。WSigma-A化ich公司纯度>90%的蛋白质，拥 有2-8units/mg蛋白质的活性，其分子量约~76kDa的[14C]3-径基-3-甲基戊二酷辅酶 A还原酶（[14C]HMGCoAreductase)，W测定[14C]甲径戊酸的形成。
[0381]统计分析（Statisticalanalysis)
[0382] 实验结果，皆W平均值加减标准误（Mean±SEM)表示。统计间的差异，在非配对及 配对样本中分别采用非相依性的Student'st-test。当多个治疗组与对照组相比较，采用 单因子变异数分析（onewayAN0VA)，或双因子重复测量变异数分析（twowayrepeated measuresANOVA)。当变异数分析（Analysisofva;riance，ANOVA)呈现统计学差异时，采用 Dunnett's或Student-Newman-Keulstest。P值小于0. 05,表不实验值具有统计学上显著 性差异。资料和图面的分析，在IBM计算机运用SigmaPlot软件（版本8. 0,化icago,IL，U. S.A.)和SigmaStat(版本 2. 03,Qiicago,IL,U.S.A.)。
[0383]实施例一合成氯