样分析，每个浓度样品重复5次，以样品中EGCG峰面积与直 接溶于流动相下所测峰面积之比，计算高、中、低3种浓度下方法回收率（即，样品中EGCG峰 面积与直接溶于流动相下所测峰面积之比=EGCG回收率）。比较以上样品于日内5次和日间 5次测定的峰面积的变化，计算日内精密度和日间精密度。
[0031]备注说明："日内精密度和日间精密度"主要用于评价上述方法（即HPLC检测方法） 的精密度和准确性，以此来判断最终检测结果的可靠性。
[0032] (2)准确量取1000 mL小肠模拟液(K氏液），向其中加入24mL盐酸，混匀后作为溶出 介质，加热至37°C后，条件旋转浆转速为100转/分;将精密称定重量的药片一片放入溶出介 质中，以溶出介质接触药片时为零时刻开始计时，然后按2、5、10、15、20、30分钟定时取样， 每次取出样品液后，同时补充相同体积的空白溶液。按照上述处理方法，检测不同时刻溶出 介质中儿茶素 EGCG含量变化，最后以不同时段溶出的EGCG量总和与加入总量的比值求出溶 出率。
[0033]结果为：
[0034]按照上述方法所得处理空白溶出介质中EGCG在0. l-200mg/L浓度范围内标准曲线 为Y=11979x+2192.4(r>0.999)，在标准曲线范围内高、中、低浓度儿茶素 EGCG回收率均大 于90%以上，日内精密度和日间精密度均小于10%，见表1。
[0035]表1.小肠模拟液中儿茶素 EGCG的回收率和精密度(n = 5)
[0038]根据上述结果，我们能得知:本发明所设置的上述检测方法能满足本发明的儿茶 素和原花青素保健品(复方肠溶保健片)溶出度检测的要求。
[0039]方法三、Beagle犬血液吸收和粪便排泄实验
[0040] (1)采用向0.3mL空白实验犬血清和空白粪便匀浆液中加入儿茶素 EGCG标准品的 方法，配制浓度范围为0.5-200mg/L的儿茶素 EGCG标准样品，其余方法步骤同"方法二的（1) 部分"，计算血清和粪便中EGCG标准曲线方程以及方法学考察(包括回收率、日内和日间变 异系数RSD等）。
[0041] (2)本实验所用5只雄性Beagle犬由浙江省医学科学院实验动物中心提供，体重 6000 ± 500g，自身前后对照，于实验前适应性养殖一周，口灌前12h禁食、不禁水。开始实验 前，胫前静脉采集空白血液，分离制备血清；同时收集动物空白粪便，干燥后保存备用。然后 按照100mg/kg体重给实验犬灌服配制的儿茶素和原花青素复方肠溶片，实验犬分别于灌服 后5min、lOmin、15min、30min、60min、120min、180min 和 240min 静脉米血，然后将所取血液于 肝素化离心管中，6000r/min离心后，取0.3mL血浆于IOmL离心管中。同时收集0-12h和12-24h时间段内的实验犬粪便。参照上述"(1)中的方法"处理后进HPLC分析。将所测血清和粪 便中儿茶素 EGCG峰面积代入上述标准曲线方程，计算血清和粪便中儿茶素 EGCG浓度，绘制 血药浓度一一时间曲线，计算曲线下面积(AUC)，计算不同时间段实验犬粪便中儿茶素排泄 量。同时制备普通复方片剂，待实验犬代谢消除7天之后，再按照100mg/kg体重给实验犬灌 服配制的儿茶素和原花青素普通复方片剂，按照上述方法开展相关实验。最后，根据计算结 果比较儿茶素复方肠溶片剂(本发明）和普通复方片剂血药浓度以及粪便排泄量，以此来评 价复方肠溶片剂(本发明）与普通片剂在机体内生物利用度和肠道排泄规律。
[0042]备注说明：上述普通复方片剂的制备方法为：
[0043] 1)、准确称取等量混合的儿茶素和原花青素共计12g，加入1.5g羧甲基纤维素钠 (CMC-Na)和80g微晶纤维素(MCC)，粉碎并均匀混合；
[0044] 2)、向步骤1)所得的混合均匀的粉末中0.5g硬脂酸镁，最后用填充剂MCC加至 l〇〇g，充分混匀，然后于压片机中压制，即为普通复方片剂。
[0045] 结果为：
[0046] 按照上述方法所得处理空白实验犬血清和粪便中EGCG在0.5-500mg/L浓度范围内 标准曲线分别为为Y= 12010x+1566.7(r>0.999)和Y= 12037x+560.33(r>0.999)，在标准 曲线范围内高、中、低浓度儿茶素 EGCG回收率均大于80%以上，日内精密度和日间精密度均 小于10%，见表2。
[0047]表2.实验犬血清和粪便中儿茶素 EGCG的回收率和精密度(η = 5)
[0049] 即，本发明利用实验动物整体小肠吸收模型，通过定量检测儿茶素与原花青素复 方肠溶片剂在体内生物利用度和粪便排泄特征，制备一种能够发挥儿茶素和原花青素以及 相关辅料发挥协同功效的新型制剂，以利于在治疗心脑血管疾病中的应用。
[0050] 综上所述，本发明采用了 RP-HPLC方法分析检测了实验犬血清和粪便等生物样品 中儿茶素 EGCG的准确、定量检测手段，检测限达到微克级，完全能够满足实验犬血清和粪便 中儿茶素 EGCG的检测。
[0051] 采用本发明方法制备而得的复方肠溶保健品，具有如下技术优势：
[0052] 该剂型使得主料避开胃中强酸环境的破坏，同时能使作为主料的儿茶素和原花青 素在肠道中崩解、释放，由于两者在分子聚合度上的差异，使得在肠道中释放和运行速率不 同，协同产生功能活性，又能够在肠道中停留更长时间，从而发挥更强的自由基清除能力。
【附图说明】
[0053]下面结合附图对本发明的实施结果作进一步详细说明。
[0054]图1是儿茶素 EGCG的标准色谱图；
[0055]图2是空白血清的色谱图；
[0056] 图3是灌服实施例1所述的儿茶素和原花青素复方肠溶片后实验犬色谱图；
[0057] 图4是灌服实施例1所述的儿茶素+原花青素复方肠溶片与儿茶素+原花青素普通 片剂后血清EGCG浓度--时间曲线对比图；
[0058] 图5是灌服实施例1所述的儿茶素+原花青素复方肠溶片与儿茶素+原花青素普通 片剂后粪便排泄EGCG含量对比图；
[0059] 其中峰1为儿茶素 EGCG色谱峰。
【具体实施方式】
[0060]实施例1、一种复方肠溶保健品（儿茶素+原花青素复方肠溶片）的制备，依次进行 以下步骤：
[0061] 1)、准确称取等量混合的儿茶素和原花青素12g，向其中加入1.5g羧甲基纤维素钠 (CMC-Na)和80g微晶纤维素(MCC)，于粉碎机中粉碎(至过20目的筛)并均匀混合；
[0062] 2)、向步骤I)的所得物中加入3.5g交联聚乙烯吡咯烷酮(交联聚维酮，PVPP)，充分 混合均匀。
[0063] 3)、向步骤2)所得的混合物中准确加入0.5g硬脂酸镁和0.5g食品级海藻酸钠，最 后用填充剂MCC加至100g，充分混匀，然后于压片机中压制得到片芯。
[0064] 4)、准确称取聚丙烯酸树脂(EudragitL-100_55)10g作为肠溶包衣材料，向其中加 入0.5g的PEG-6000作为增塑剂，并用体积浓度80%乙醇定容至100g，得浓度为10%的包衣 液。
[0065] 5)、将片芯放置于旋转包衣机内，吹入50~70°C的热空气，并搅拌;包衣锅转速为 25r/min，包衣增重为5 % ;包衣结束后将肠溶片放入40°C烘箱中热处理3h，包装，即得复方 肠溶保健品(儿茶素+原花青素复方肠溶片）。
[0066]实施例2、一种复方肠溶保健品（儿茶素+原花青素复方肠溶片）的制备，依次进行 以下步骤：
[0067] 1)、准确称取等量混合的儿茶素和原花青素12g，向其中加入0.5g羧甲基纤维素钠 (CMC-Na)和80g微晶纤维素(MCC )，于粉碎机中粉碎，混合均匀。
[0068] 2)、向步骤1)的所得物中加入1.5g交联聚乙烯吡咯烷酮(交联聚维酮，PVPP)，充分 混合均匀。
[0069] 3)、向步骤2)所得的混合物中准确加入0.5g硬脂酸镁和0.2g食品级海藻酸钠，最 后用填充剂MCC加至100g，充分混匀，然后于压片机中压制得到片芯。
[0070] 4)、准确称取聚丙烯酸树脂(EudragitL-100-55)5g作为肠溶包衣材料，向其中加 入0.5g的PEG-6000作为增塑剂，并用体积浓度80%乙醇定容至100g，得浓度为5%的包衣 液。
[0071] 5 )、将片芯放置于旋转包衣机内，吹入50~70°C热空气，并搅拌；包衣锅转速为 15r/min，包衣增重为5 % ;包衣结束后将肠溶片放入40°C烘箱中热处理3h，包装，即得复方 肠