4所致小鼠急性肝损伤模型造模成功；与模型组相比较，俄色叶提取 物的低、中、高剂量组均能明显降低CCl 4致急性肝损伤小鼠的ALT、AST水平（p〈0. 01)。
[0049] 与赶黄草对照组相比，变叶海棠组、花叶海棠组对CCl4致急性肝损伤小鼠的血清 中ALT水平无显著性差异。变叶海棠高剂量组和花叶海棠低、中、高组均能明显降低对CCl 4 致急性肝损伤小鼠血清中AST水平（p〈0. 01)。
[0050] 1. 3. 1. 2俄色叶提取物对CCl4引起的急性肝损伤小鼠肝组织中SOD、MDA的影响
[0051] 表2各组别对对CCl4引起的急性肝损伤小鼠肝组织中SOD活性及MDA含量的影 响（J ±s，η = 10)
[0054] 注：与模型对照组比较：#ρ〈0· 01，*ρ〈0· 05
[0055] 与空白对照组比：##ρ〈0· 01，#ρ〈0· 05
[0056] 与赶黄草对照组：ΛΛ ρ〈0· 01，Λ ρ〈0· 05
[0057] 由表2可知，与空白对照组比较，模型对照组小鼠的肝组织中SOD酶活力明显降低 (p〈0. 01)，MDA含量明显升高（p〈0. 01)，说明0：14所致小鼠急性肝损伤模型造模成功；与模 型组相比较，俄色叶提取物的低、中、高剂量组均能明显升高CCl 4致急性肝损伤小鼠肝组织 中SOD酶活力（ρ〈0· 01)，降低MDA含量（ρ〈0· 01)。
[0058] 与赶黄草对照组相比，变叶海棠组和花叶海棠高、低剂量组均能显著地升高对 〇：14致急性肝损伤小鼠的肝组织中SOD酶活力（ρ〈0. 01)。变叶海棠组、花叶海棠组均能明 显升高对CCl4致急性肝损伤小鼠肝组织中MDA含量（ρ〈0. 01)。
[0059] 实验例2本发明俄色叶不同提取部位的抗氧化活性及成分含量不同提取部位的 抗氧化活性及成分含量
[0060]
[0061] IC5。越低，抗氧化活性越强（侧面反保肝活性）
[0062] 实验例3本发明俄色叶乙醇提取物的保肝功效
[0063] 一、药物制备和实验分组
[0064] 变叶海棠大叶为2014年7月16日采自甘孜州炉霍县，变叶海棠嫩叶为2015年5 月23日采自甘孜州炉霍县，均由由成都中医药大学李敏教授鉴定为蔷薇科植物变叶海棠 Malustoringoides (Rehd. ) Hughes.的干燥叶。
[0065] 取干燥叶，粉碎，每次称取一定质量，提取3次，分别加20倍95%的乙醇加热回流 提取，过滤，收集续滤液，减压回收，得乙醇部位浸膏。将乙醇部位的浸膏加水溶解，然后加 入2倍的石油醚（60~90)萃取至石油醚无色，再加入2倍乙酸乙酯反复萃取直至乙酸乙 酯溶液无色，合并乙酸乙酯溶液，减压回收得溶剂后得部位浸膏。
[0066] 石油醚（60~90)，购自成都市科龙化工试剂厂。
[0067]
[0068] 根皮苷、根皮素：为自制对照品，纯度在99. 0%以上。
[0069] 联苯双酯：由浙江医药股份有限公司新昌制药厂提供。
[0070] 二、俄色叶提取物及其单体对CC14体外诱导肝细胞株HL-7702HL-7702损伤的影 响。
[0071] (l)HL-7702细胞的培养、传代、冻存、复苏、收集足够数量的细胞
[0072] 人肝HL-7702细胞为贴壁细胞。将细胞接种于培养瓶中，加入含10%灭火胎牛血 清（FBS)的RPMI1640培养基5ml，置37°C、5% C02饱和湿度孵育箱内培养（传代、冻存、复 苏）。镜下观察细胞贴壁生长情况。收集对数生长期细胞进行各项实验。
[0073] (2) CC14损伤HL7702细胞模型的建立
[0074] 正交试验设计选择二因素三水平确定细胞损伤模型。A-CC14损伤时间（h); 8-〇：14浓度（111111〇1/1)。根据1^9(34)正交表进行试验设计。在96孔培养板中加入1\10 5 个/mL细胞悬液，每孔100 μ L。待细胞完全贴壁后，试验孔分别加入相应的含CC14mmol/L 无血清培养基，100 μ L，每组4孔，正常对照孔加入含0. 1 % DMSO的无血清培养液100 μ L。 培养箱中孵育相应的时间后，每孔加入5mg/mLMTT20 μ L，培养4h，吸弃上清液，每孔加入 150 μ LDMS0,摇床上振摇lOmin。在酶标仪490nm波长处测定各孔吸光度OD值，并按下式计 算肝细胞的存活率：
[0075] 存活率（％ )=实验组A49ton/正常对照组A49Qnni*100%，以确定CC14对肝细胞的损 伤条件。
[0076] 不同浓度CC14作用不同时间后HL7702细胞存活率（X土s，η = 3)
[0078] 方差分析表
[0080] 最终选择Α3Β2 :10mmol/LCC14作用六小时。
[0081 ] (3)生化仪检测各组肝细胞培养上清液ALT (GPT)、AST (GOT)泄露量、LDH渗出率
[0082] ALT、AST、LDH可以敏感地提示肝细胞损伤及程度，因此本试验中，选择ALT、AST、 LDH作为肝细胞损伤程度的评定指标。
[0083] ①收集对数生长期细胞，接种人肝HL-7702细胞于24孔培养板中，每孔加入300ul 完全培基，使细胞密度为1*1〇~6个/孔，置37°C、5% CO2培养箱内孵育12小时过夜，至接 近长满。
[0084] ②实验孔加入不同浓度药物200 μ L，每组设6个重复孔，并设正常对照组和模型 组。给药24h，后加入lOmmol/L CCl4(注意动作快，防止挥发）于培养板中共同干预细胞6 小时。
[0085] ③收集培养上清液，按试剂盒说明书用酶标仪测定ALT、AST泄露量及LDH渗出率。
[0086] 所有数据均以X 土 S来表示，由SPSS 19. 0统计软件完成。先进行方差齐性检验， 如符合方差齐性，组间比较釆用单因素方差分析，治疗前后两组间比较采用配对样本t检 验方法，确定P〈〇. 05为差异有显著性意义。
[0087] 三、实验结果
[0088] 实验结果如下表所示：
[0093] 由上表可以看出，与模型组相比，本发明俄色叶的乙酸乙酯提取物，无论是变叶海 棠大叶还是变叶海棠嫩叶的提取物，高、中、低剂量组均可以有效降低LDH、AST、ALT的含 量，说明其可以有效保护肝细胞免受CC14的损害。
[0094] 将本发明变叶海棠大叶、变叶海棠嫩叶的提取物的高、中剂量组，与纯的根皮苷、 根皮素的高、中剂量主要相比可知，本发明提取物在给药剂量更小的情况下，对肝细胞的保 护与纯的根皮苷、根皮素却相当。
[0095] 综上，本发明俄色叶及提取物用于保肝药效明确、可控，为临床提供了一种新的选 择，且制备方法简单，成本低廉，工业应用前景良好。
【主权项】
1. 俄色叶及其提取物在制备保肝的药物或保健食品中的用途。2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的俄色叶来源于蔷薇科植物变叶海 棠Malustoringoides(Rehd. )Hughes.或花叶海棠Malustiansitoria(Batal. )Schneid. 的干燥叶芽及叶。3. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述俄色叶为变叶海棠大叶或者变叶海 棠嫩叶。4. 根据权利要求1~3任意一项所述的用途，其特征在于：所述的俄色叶的提取物为 水提取物。5. 根据权利要求1~3任意一项所述的用途，其特征在于：所述的俄色叶的提取物为 乙酸乙酯提取物。6. 根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述的俄色叶的乙酸乙酯提取物是由下 述方法制备：取俄色叶95 %乙醇回流提取；乙醇部位浸膏加水分散，再依次用石油醚、乙酸 乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取溶剂，除去乙酸乙酯即得乙酸乙酯提取物。7. 根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述的俄色叶的乙酸乙酯提取物是由下 述方法制备：取俄色叶，粉碎，每次称取一定质量，提取3次，分别加20倍95%的乙醇加热 回流提取，过滤，收集续滤液，减压回收，得乙醇部位浸膏；将乙醇部位的浸膏加水溶解，然 后加入2倍的石油醚（60~90)萃取至石油醚无色，再加入2倍乙酸乙酯反复萃取直至乙 酸乙酯溶液无色，合并乙酸乙酯溶液，减压回收得溶剂后得乙酸乙酯提取物。8. 根据权利要求1~7任意一项所述的用途，其特征在于：所述保肝的药物或保健食 品是治疗和/或预防化学性肝损伤的药物或保健食品。9. 一种俄色叶提取物，其特征在于：它是俄色叶的乙酸乙酯提取物，由下述方法制备： 取俄色叶95%乙醇回流提取；乙醇部位浸膏加水分散，再依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，取 乙酸乙酯萃取溶剂，除去乙酸乙酯即得乙酸乙酯提取物。10. 根据权利要求9所述的俄色叶提取物，其特征在于：所述的俄色叶的乙酸乙酯提取 物是由下述方法制备：取俄色叶，粉碎，每次称取一定质量，提取3次，分别加20倍95 %的 乙醇加热回流提取，过滤，收集续滤液，减压回收，得乙醇部位浸膏；将乙醇部位的浸膏加水 溶解，然后加入2倍的石油醚（60~90)萃取至石油醚无色，再加入2倍乙酸乙酯反复萃取 直至乙酸乙酯溶液无色，合并乙酸乙酯溶液，减压回收得溶剂后得乙酸乙酯提取物。
【专利摘要】本发明公开了俄色叶的嫩叶或及提取物在制备保肝的药物或保健食品中的用途。本发明俄色叶的嫩叶或及提取物用于保肝药效明确，可控，为临床提供了一种新的选择。
【IPC分类】A61K36/73, A61P1/16, A23L33/10, A23L33/105
【公开号】CN105434575
【申请号】CN201510617831
【发明人】李敏, 夏冬梅, 周海玉
【申请人】李敏
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年9月24日