Egf配体靶向纳米载药体系及其抗肿瘤治疗应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物纳米载药材料及药物靶向运输领域，具体涉及一种表皮生长因子配体靶向纳米载药体系及其抗肿瘤治疗应用。
【背景技术】
[0002]恶性肿瘤(癌症)是危害人类健康、威胁人类生命的第一杀手，具有发病率高、死亡率高、治疗困难及易复发等特点。据世界卫生组织最新《世界癌症报告》，2012年全球有1400万新增癌症病例，癌症死亡人数达820万。我国新诊断癌症病例为307万，占全球总数的21.8%，癌症死亡人数约220万，占全球癌症死亡人数的26.9%。而且根据目前的癌症发病趋势，到2020年全世界癌症发病率将比现在增加50%。因此，肿瘤治疗面临更加艰巨的任务，而目前化疗作为肿瘤主要治疗手段之一，由于缺乏对肿瘤细胞的选择性，在杀死肿瘤细胞的同时，也破坏了正常组织细胞，进而产生一系列的毒副作用。因此，发展一种引导抗肿瘤药物靶向输送至“病灶”部位、并提高靶区药物浓度的药物载体显得尤为迫切。
[0003]随着纳米技术在肿瘤生物学研究中的不断深入，磁性纳米颗粒(MNPs)因具有良好的生物相容性、低毒性、表面易功能化以及独特的超顺磁性等特点，为肿瘤研究提供了一种新颖、颇具前景的研究材料，以功能化磁性纳米颗粒作为载体、靶向输送抗肿瘤药物成为肿瘤治疗研究的热点。羧甲基壳聚糖(CMC)是壳聚糖经过羧基化反应后生成的一种水溶性衍生物，具有良好的稳定性、组织及血液相容性、可降解性以及有效的膜穿透性等特性。由于它是一种含有活性氨基、羧基的两亲性可降解性多糖，可与多种生物活性物偶联，因而成为新一代药物载体优选的包被材料。通过在磁性纳米颗粒(MNPs)表面包被羧甲基壳聚糖(CMC)可以提高载体的分散稳定性、相容性及水溶性。
[0004]功能化磁性纳米颗粒作为给药载体可克服传统给药方式所带来的缺陷，如药物随着载体被输送至靶区(肿瘤部位)周围使靶区很快达到所需浓度，因此可降低给药剂量，减少药物降解，提高药物稳定性及生物利用度、延长药物的体内循环时间、实现药物的缓释和控释等，将成为肿瘤治疗的主导。但是，目前该领域仍然存在许多技术瓶颈问题尚待解决:治疗性药物面临着如何被特异和有效地转运到靶(肿瘤)细胞的难题;载体能否将药物安全有效地运输到指定部位、转入靶细胞并在胞质中发挥作用;如何改善载体表面性质，以避免载体被肝、脾、肺、骨髓等网状内皮系统吞噬；如何提高载体的载药量等。针对上述问题，靶向功能化磁纳米载体为抗肿瘤药物的靶向运输提供了一个新的方向。
【发明内容】
[0005]本发明目的是提供本发明的目的在于针对目前抗肿瘤药物靶向输送困难、易降解及体内循环时间短等肿瘤治疗中迫切需要解决的问题，构建一种具有配体特异性靶向功能的纳米药物输送体系。
[0006]本发明的技术方案为:EGF配体革El向纳米载药体系，载药体系以超顺磁性纳米颗粒作为磁核，以羧甲基壳聚糖为包被材料，其中装载抗肿瘤药物，并在其表面修饰表皮生长因子 EGF。
[0007 ]进一步地，所述磁核为超顺磁性能的四氧化三铁纳米颗粒。
[0008]进一步地，所述抗肿瘤药物为长春新碱VCR。
[0009 ] EGF配体靶向纳米载药体系的制备方法，包括以下步骤:
①磁核的制备:利用部分还原三氯化铁溶液共沉淀法制备四氧化三铁纳米颗粒；
②磁核包被及药物装载:通过反相微乳液法在四氧化三铁纳米颗粒表面包被羧甲基壳聚糖及装载抗肿瘤药物制备药物-CMC/MNPs;
③EGF修饰药物-CMC/MNPs:采用EDC活化羧基偶联表皮生长因子EGF的方法制备EGF-药物-CMC/ MNPs0
[0010]进一步地，EGF配体靶向纳米载药体系的制备方法，包括以下步骤:
①利用部分还原三氯化铁(FeCl3)溶液共沉淀法，磁力搅拌条件下制备载体核四氧化三铁纳米颗粒溶液，脱氧水洗涤、真空干燥、研磨过滤即得四氧化三铁纳米颗粒；
②采用生物相容性的羧甲基壳聚糖(CMC)作为磁核包被材料，利用反相微乳液法在氮气保护的条件下，机械搅拌进行包被和装载抗肿瘤药物，所得产物在外加磁场的条件下进行磁分离洗涤，真空干燥，收集即为药物-CMC/MNPs;
③反应在MES溶液中进行，加入EDC混匀后，加入EGF，振荡反应，所得产物用I3BS磁分离洗涤，即得EGF-药物-CMC/MNPs。
[0011]进一步地，步骤③的具体方法为:
将药物-CMC/MNPs超声分散于MES溶液中，pH 4.5-7.4，加入I mg/mL EDC混匀后，加入
0.5-2 mg/mL表皮生长因子，高速振荡反应2 h，所得产物用磷酸缓冲盐溶液(PBS)磁分离洗涤，制备得到表皮生长因子配体靶向的载药复合物EGF-药物-CMC/ MNPs。
[0012]主动革E向磁性纳米颗粒通过其表面偶联特定的配体(或抗体)与革E细胞表面相应受体特异性地结合，促进靶细胞对治疗药物的摄入，避免被肝、脾、肺、骨髓等网状内皮系统巨噬细胞的吞噬，大大提高载体的特异性、靶向性及选择性，提高药物在肿瘤组织中的浓度。
[0013]表皮生长因子受体(EGFR)是原癌基因c-erbBl在细胞膜上表达的多功能糖蛋白，能与表皮生长因子(EGF)配体特异性结合。在不同分化程度的肿瘤组织中，其表达水平随肿瘤恶性级别的增高而增高，这种表皮生长因子受体差异性表达使得表皮生长因子受体成为一种潜在的肿瘤靶向分子标志物，因此，我们选择表皮生长因子配体作为修饰磁纳米颗粒的靶向分子，通过表皮生长因子受体与其配体表皮生长因子在细胞膜上特异性结合，构建表皮生长因子配体主动革El向的磁纳米颗粒作为抗肿瘤药物输送载体，提高抗肿瘤药物的革巴向性、选择性和聚集性。
[0014]本发明与现有技术相比具有如下优点:
本发明制备的表皮生长因子(EG1靶向纳米载体，具有高度的靶向选择性，相比非靶向的纳米载药体系，显著提高药物的生物利用率，减少对正常组织细胞的毒副作用。
[0015]本发明纳米载体和载药体系的制备方法操作简便、反应条件温和，制备产物可作为抗肿瘤药物的广泛载体，为高效的抗肿瘤药物靶向输送载体研究提供了一种新的发展方向。
【附图说明】
[0016]图1为EGF偶联纳米载药体系的构建及靶向抑制胶质瘤增殖示意图。
[0017]图2为实施例1所构建纳米载药体系的透射电子显微镜(TEM)图。
[0018]图3为实施例1EGF靶向纳米载药体系的红外光谱(FT-1R)图。
[0019]图4为实施例2EGF靶向纳米载药体系的磁响应图。
[0020]图5为实施例3EGF靶向纳米载药体系抑制U251细胞增殖。
[0021]图6为实施例4EGF靶向纳米载药体系引起U251细胞活性降低。
[0022]图7为实施例5EGF靶向纳米载药体系引起U251细胞骨架损伤。
[0023]图8为实施例6EGF靶向纳米载药体系引起U251细胞凋亡。
[0024]图9为实施例7EGF靶向纳米载药体系阻滞U251细胞周期进程。
【具体实施方式】
[0025]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0026]实施例1
一种EGF配体靶向纳米载药体系的构建示意图参见图1，其具体的制备步骤如下:
(I)磁核即超顺磁性纳米颗粒(MNPs)的制备:吸取10.5 mL去离子水于三颈烧瓶中，加入3mL2mol/L的FeCl3溶液，以适当的速度开始磁力搅拌；匀速滴加2 mL的Na2SO3;当颜色由红棕色又还原为黄色时，开始缓慢滴加80 mU^NH3.H2O溶液，并剧烈搅拌，黑色沉淀迅速生成;继续搅拌40 min，以保证反应完全；用脱氧水洗涤黑色沉淀3次，45°C条件下真空干燥，仔细研磨过滤即得Fe3O4粉末。
[0027](2)采用反向微乳液法制备药物-CMC/MNPs:取适量抗肿瘤药物、CMC及MNPs(质量比2:1)溶于5mL的去离子水(DI)中，在氮气(N2)保护下，超声处理30 min，形成悬浮液。同时，在三口烧瓶中加入50mL液体石錯和司盘80，在氮气(N2)保护下55°水浴，600 rpm搅拌至乳状物;然后把上述悬浮液逐滴滴加至三口烧瓶中，高速搅拌2 h，然后低速搅拌10 h，形成油包水微乳液，在外加磁场的条件下进行磁分离沉淀，用石油醚，异丙醇交替洗涤三次，最后至于石油醚中，真空干燥。收集即为药物-CMC/MNPs粉末。
[0028](3)采用EDC活化羧基偶联EGF的方法制备EGF-药物-CMC/MNPs:取5mgCMC/MNPs或药物-CMC/MNPs粉末，紫外照射10 min后加入1.5 mLEP管中，再加入0.5 mLMES溶液，超声5min，使粉末充分溶解；同时，加入20 yL EDC于上述CMC/ MNPs溶液，混合后加入5 yL的EGF，放置于ZDY-1型震荡仪，高速震荡反应。用PBS磁分离洗涤，最后置于PBS，即得EGF-药物-CMC/MNPso
[0029 ]上述实施例中的抗肿瘤药物为长春新碱(VCR )，制备的配体革El向药物磁纳米颗粒复合物为 EGF-VCR-CMC/MNPs。
[0030]将制得的载体CMC/ MNPs采用透射电子显微镜(TEM)进行表征，可观察到图2的现象。图2表明样品的形貌为球形或椭圆形纳米颗粒，平均粒径为±60 nm。
[0031 ] 将制得的载药EGF-VCR-CMC/ MNPs采用红外光谱表征产物的组成，可观察到图3的结果。图3表明成功制备超顺磁性载体核MNPs(Fe-0特征吸收峰在567.7cm—工);羧甲基壳聚糖(CMC)成功包被超顺磁性载体核MNPs，抗肿瘤药物长春新碱(VCR)成功装载、且EGF靶向修饰成功。
[0032]磁响应性能检测:将制备的EGF-VCR-CMC/MNPs分散于DI水中，在外加磁场和自然状态下，每隔一定时间(0、10、20、30、40、50、60 min)利用紫外-可见光分光光度计测量其570 nm处透光率的变化。通过透光率数值的变化，观察纳米颗粒磁响应能力。图4是EGF纳米载药体系EGF-VCR-CMC/ MNPs在自