同时或或依次施用给同一患者的组 合。
[0066] 天冬酰胺酶本身的CAS编号为9015-68-3。其常用名称为天冬酰胺酶;其它常用名 称为左旋天冬酰胺酶、L-天冬酰胺酶和L-天冬酰胺氨基水解酶。
[0067] 在本发明的意义上，术语天冬酰胺酶涵盖任何来源的天冬酰胺酶，其尤其可以是 天然来源或重组来源，以及任何结合天冬酰胺酶的衍生物(例如PEG形式)或保持L-天冬酰 胺酶活性的片段。其还涵盖其细菌来源的任何天冬酰胺酶。因此，天冬酰胺酶可以是大肠杆 菌型的（特别是大肠杆菌HAP-A-L-3型的）、菊欧文菌型的或产琥珀酸沃廉菌(Wolinella succinogenes)型的。"型"应理解为意指其可由所述细菌培养物获得，或者其可以是重组 的，换言之，其为通过遗传工程获得之细菌的天冬酰胺酶形式。在一个优选的实施方式中， 其为大肠杆菌HAP-A-1-3型的。
[0068]术语天冬酰胺酶还涵盖天冬酰胺酶样物质，其在本发明的意义上为具有L-天冬酰 胺氨基水解酶活性的细菌酶类。举例来说，可以引用不动杆菌属谷氨酰胺酶天冬酰胺酶 (AGA)〇
[0069] 能够将有效成分包封在红细胞中的技术是已知的，本领域技术人员能够参考的裂 解-再封的基本技术为本发明优选的，其描述于专利EP-A-101 341和EP-A-679 101中。根据 该技术，给透析单元(例如透析袋或透析筒）的主要隔室连续进料红细胞混悬剂，而第二隔 室包含相对于红细胞混悬剂低渗的水溶液，以便裂解所述红细胞;接着，在再封单元中，在 天冬酰胺酶存在下通过升高渗透压和/或血液渗透压促使红细胞再封，然后，收集包含天冬 酰胺酶之红细胞的混悬剂。
[0070] 在迄今所描述的变化形式中，在W0-A-2006/016247中描述的方法是优选的，所述 方法使得可以有效、可再现、可靠和稳定的方式包封天冬酰胺酶。该方法包括下述步骤： [0071 ] 1-使血细胞沉淀（corpuscle pellet)悬浮在红细胞压积水平大于或等于65%的 等渗溶液中，并冷藏在+1至+8°C，
[0072] 2-使用来自同一血细胞的红细胞样品测量渗透性脆性，可按照任何顺序进行步骤 1和2(包括平行顺序），
[0073] 3-裂解和天冬酰胺酶内化步骤，其在同一室(enclosure)内，温度恒定地保持在+1 至+8°C，所述步骤包括将红细胞压积水平大于或等于65%的红细胞混悬剂和冷藏在+1至+8 °C的低渗裂解溶液转移到透析器中，基于之前测量的渗透性脆性调节裂解参数;和
[0074] 4-在内部温度为+30至+40°C的第二个室内，在高渗溶液的存在下进行再封步骤。
[0075] "内化"理解为指天冬酰胺酶穿透进入红细胞内部。
[0076] 特别地，对于透析，将血细胞沉淀悬浮在大于或等于65 %、优选地大于或等于70 % 的高红细胞压积水平的等渗溶液中，将该混悬剂冷藏在+1至+8°c，优选+2至+6°C，通常为约 +4°C。根据一个特定的方式，所述红细胞压积水平为65至80 %，优选为70至80 %。
[0077]所述渗透压脆性有利地恰在裂解步骤之前，在混悬剂中存在或不存在天冬酰胺酶 的情况下测量。红细胞或包含其的混悬剂有利地处在接近或等于选定裂解温度的温度下。 根据本发明的另一个有利的特征，快速进行渗透压脆性的测量，换言之，在采集样品后不久 进行裂解步骤。优选地，采样和开始裂解之间的时间间隔小于或等于30分钟，更优选小于或 等于25分钟，甚至为20分钟。
[0078]对于有关进行裂解-再封步骤的方式、渗透压脆性的测量和容差(allowance)的更 详细内容，本领域技术人员可参照W0-A-2006/016247。
[0079] 现在，通过作为非限定性实例的实施方式对本发明进行更详细地描述。
【附图说明】
[0080] 图1和2为图解天冬酰胺酶或经包封天冬酰胺酶之半衰期计算方法的图。
[0081] 图3为图解根据不同方案处理的小鼠中作为时间之函数的肿瘤生长抑制的图。 [0082 ]图4图解了在异种移植物模型中各组小鼠的相对肿瘤体积对时间的作图。
[0083]图5为表示在异种移植物模型中每个处理组小鼠的小鼠存活率的图。
【具体实施方式】
[0084] 实施例1:将L-天冬酰胺酶包封在鼠科动物红细胞中的方法 [0085]通过在透析袋中低渗透析的方法，将L-天冬酰胺酶（Kidro丨ase?，:〇Pi-EusA Limonest France)包封在鼠科动物红细胞(0F1小鼠）中。将血液预先离心以除去血浆，然后 用0.9 %的NaCl洗涤三次。在天冬酰胺酶存在下，调节红细胞压积至70%，将其加入到 400 IU/ml的红细胞(RBC)最终浓度中，之后开始透析。在4 °C下，用低渗裂解缓冲液透析持续 50分钟。然后，通过加入高渗溶液并在37°C下孵育30分钟而将小鼠红细胞再封。在用0.9% NaCl洗涤两次和用补充有牛血清白蛋白BSA(6% )的Sag-甘露醇洗涤一次之后，将所述红细 胞调节至红细胞压积为50%。包封L-天冬酰胺酶的红细胞被称为L-Aspa RBC。包封产生浓 度为40IU天冬酰胺酶/ml RC的L-Aspa RBC，红细胞压积为50%。
[0086]在包封步骤期间，检验全血、洗涤的RBC、与L-天冬酰胺酶混合的RBC(透析之前)和 负载有L-天冬酰胺酶的RBC(透析之后）的以下项目：
[0087]-红细胞压积(Ht)
[0088]-平均血细胞容积(ACV)
[0089]-平均血细胞血红蛋白浓度(ACHC)
[0090] -总血红蛋白浓度，和
[0091] -细胞计数。
[0092] 在低渗透析之前和之后吸取细胞混悬剂的等分试样，以测量L-天冬酰胺酶的酶活 性。根据在下述文献中公开的方案进行L-天冬酰胺酶的估测：Orsonneau等，"Dosage automatique en cinetique de V activite L-Asparaginase plasmatique en suivi therapeutique des leucemies aigues lymphoblastiques〃，Ann Biol Clin,62:568-572。
[0093] 实施例2:小鼠中L-Aspa RBC的药代动力学和药效学参数的测定
[0094] 将小鼠 L-Aspa RBC注射到0F1小鼠中，以测定L-Aspa RBC在小鼠循环中的半衰期 和证实小鼠血浆中L-天冬酰胺的消耗。通过静脉内途径，将200IU/kg的单剂量注射到每只 小鼠中。
[0095] L-Aspa RBC的半衰期为12.39±0.74天（基于酶活性计算）。当通过细胞标记 (CFSE-L-Aspa RBC)计算小鼠 L-Aspa RBC的半衰期时，该值为16 · 52±3 · 13天，仅用CFDA-SE 标记的RBC(CFSE RBC)的半衰期值为15.83±3.31天。
[0096]血浆L-天冬酰胺全部耗尽（<2μΜ)，其在注射L-Aspa RBC后15分钟达到，并且持续 至少20天。
[0097] 表1:对于L-Aspa RBC和用CFDA-SE标记的小鼠 RBC(CFSE RBC)获得的药代动力学 数据
[0098]
[0099]如下计算半衰期：
[0100] 将由绘图等式（plot equation)得到的截点（intercept point)除以2。然后通过 图形对应关系(tank to the plot)来计算对应的横坐标值。
[0101] 一个计算的实例显示在图1中，其中计算的截点为2,8461。
[0102] 截点的一半：1，42
[0103] 计算对应的横坐标值1·42 = (-0，1145*Χ)+2·8
[0104] X=(l .42-2.8)/-0.1145 = -1.38/-0.1145 = 12天。
[0105] 可以用第二种方法计算更真实的半衰期，其中纵坐标标度为对数标度，横坐标标 度为线性标度，如图2所示。
[0106] 如下计算半衰期：
[0107] Ln(2)/曲线的图形系数。
[0108] 在图2的实例(其为与如图1中相同的实例）中，半衰期为：
[0109] Ln(2)/0,083 = 8,3天。
[0110] 表2:L-Aspa RBC和游离L-天冬酰胺酶的残留L-天冬酰胺酶活性(作为时间函数） 的测量
[0111]
[0112] 此外，对循环血浆L-天冬酰胺酶的估测表明，在向小鼠注射L-Aspa RBC之后超过 24小时，得到的值为测定检测限（1至3IU/升）。
[0113] 实施例3:小鼠中应答于注射L-Aspa RBC的人胰腺肿瘤的生长抑制
[0114] 该实验目的是将L-Aspa RBC注射到载荷人胰腺肿瘤的小鼠中，并观察肿瘤的生长 抑制。选择体外对L-天冬酰胺酶敏感但L-天冬酰胺合酶缺乏的细胞系:Mia Paca-2。
[0115] 为研究注射L-Aspa RBC后的肿瘤生长抑制，建立了4组(每组12只）小鼠的体内实 验方案。将胰腺癌的参比治疗吉西他滨纳入该方案中。
[0116] 试验物质和对照的制备
[0117] 试验物质1:将L-天冬酰胺酶载荷到小鼠红细胞中（称为L-Aspa RBC) 〇L-Aspa RBC 的制备方法如上所述(参见实施例1)。
[0118] 试验物质2:吉西他滨
[0119] 对照物质2: PBS (吉西他滨摄取缓冲液)
[0120] Mia Paca-2细胞的培养
[0121] 使指数生长期的人胰腺肿瘤细胞(Mia Paca-2)(来源ATCC:美国典型培养物保藏 中心(American Type Culture Collection))进行胰蛋白酶消化，然后计数和洗涤，最后将 其再悬浮于无血清的DMEM培养基中，以便