和 54.5化1， 结果显示，小白菊内醋对S种肺癌细胞系增殖均具有显著的抑制作用，且NCI-H446更为敏 感。
[0044] 实施例2体外细胞水平检测小白菊内醋对肺癌细胞系NCI-H446、NCI-H460和A549 迁移能力影响
[0045] 实验方法:细胞划痕法
[0046] 具体实验步骤为:将细胞接种于35mm的培养皿中培养单层细胞至100%，使用无菌 枪头尖端制100皿划痕空白区，弃液，1 X PBS洗2次，分别加入浓度为0，4，祉M小白菊内醋细 胞培养液，并设置不加药物的对照孔，置于37°C、0)2(5%)培养箱中培养2地，于化、1化和 24h时，放在光学显微镜上于固定位置取样，拍照，记录划痕两端细胞间距的变化。
[0047] 相对起始位置比值(Ratio to Oh) = Sxh/S〇h;用Excel软件绘制细胞迁移距离-时 间曲线，各指标均用均值±标准差来表示。
[004引实验结果
[0049] 表明了小白菊内醋对NCI-H460 (A)、NCI-H446 (B)和A549 (C)细胞迁移能力的抑制 作用：如附图2所示（从时间与细胞的迁移距离之间的关系或者时间-迁移率曲线可W看 出），小白菊内醋对不同来源肺癌细胞系均有迁移抑制作用，而对NCI-H446的作用最强，结 果与细胞增殖实验一致，表明小白菊内醋倾向于抑制神经外胚叶来源的细胞系。
[0050] 实施例3小白菊内醋对S种细胞系EMT相关标志分子表达水平的影响
[0化1 ] EMT相关标志分子表达包括:上皮标志分子Occludin、claudin3和EMA，间充质标志 分子N-ca化erinCD：M及VEGFRl，Vimentin。
[0052] 实验方法:免疫巧光染色法
[0053] 具体实验步骤为：将细胞接种于96孔培养板上（8 X IO3Cells/孔），置于37°C、0)2 (5 % )培养箱中过夜培养。第二天，弃去培养液，分别加入浓度为0，4，祉M小白菊内醋细胞培 养液，并设置不加药物的对照孔，置于培养箱培养24h后，1 X PBS洗4次，10 %的甲醒(1 X PBS 配制）室溫固定20-30min，1 X PBS洗2次，加入0.1 %的NP-40 (1 X PBS配制）透化2-5min，3 % BSA(1 XPBS配制)封闭30min，加入EMT相关标志分子的抗体(各个抗体间处理为平行操作）， 抗体均用0.1 %BSA 稀释成所需比例，Occludin 抗体比例 1:50，Claudin3、EMA、N-cadhe;rin、 VEGFRl、CD34、Vimentin几种抗体比例均为1:100,室溫比(25°C)，1 XPBS洗3次，加入相应种 属的二抗（用0.1 %BSA稀释，1:200)，室溫30min，闭光。1 X PBS洗3次，Hoechst 33342染料， 室溫30min，l XPBS洗3次，使用高内涵细胞分析系统，对蛋白表达水平进行分析测定。
[0054]实验结果
[0化5] 1、小白菊内醋可抑制NCI-H446和NCI-H460细胞的EMT，且可逆转其EMT。如附图3、4 所不，小白菊内醋干预后，NCI-H446和NCI-H460细胞上皮标志分子的水平，发生上调，且上 调程度与小白菊内醋呈剂量依赖关系，同时间充质标志分子呈下调，且同样存在剂量依赖 关系，证明小白菊内醋可逆转EMT，显著的抑制肺部肿瘤细胞的转移，且抑制程度呈剂量依 赖。
[0056] 2、小白菊内醋可抑制A549细胞的EMT，但无逆转其EMT的作用。如附图3、4所示，小 白菊内醋干预后，A549细胞上皮标志分子的水平上调，且呈剂量依赖，而间充质标志分子表 达量变化无统计学差异，证明小白菊内醋对A549肿瘤细胞的转移抑制效果不明显，其对EMT 仅限于抑制程度。
[0057] 3、小白菊内醋可对波形蛋白Vimentin的胞内分布产生影响。如附图5所示，小白菊 内醋对Vimentin的表达量的影响虽无统计学差异，但可引发其在胞内凝集而使细胞丧失迁 移运动能力，抑制肿瘤细胞的转移。
[0058] 实施例4小白菊内醋对S种细胞系细胞骨架重构的影响
[0059] 实验方法:细胞骨架染色
[0060] 具体实验步骤，仍为实施例3中所使用的细胞固定及细胞膜透化方法，对细胞骨架 进行染色，不同之处在于，选24孔板爬片，细胞密度为（5X IO4CellsAiL)，采用细胞骨架红 色巧光染料ActinRed(l:40)，室溫(25°C)20min，后IXPBS洗2次，使用巧光封片剂，盖上玻 片，在激光共聚焦显微镜下观察。
[0061 ]实验结果
[0062] 小白菊内醋对=种细胞系细胞骨架重构产生影响。如附图6所示，并结合实施例3 中运动细胞特有的Vimentin的胞内分布，小白菊内醋可抑制肿瘤细胞伪足回缩、细胞皱缩 变圆，引发了肿瘤细胞转移的能力的削弱，抑制肿瘤。
[0063] 实施例5小白菊内醋对Lewis肺癌化LC)移植瘤模型的影响
[0064] 小鼠荷瘤模型的建立，选取4-5周巧7BL/6雌性小鼠，皮下注射1 X IO6CelIs(PBS悬 液），建立化C移植瘤模型，肿瘤细胞接种后一天，随机分为S组(n = 10)，直到肿瘤体积达到 约IOOmm3 (约注射后六周），对实验组的小鼠每天分别通过腹腔注射2和8mg/kg小白菊内醋， 而对照组的小鼠注射生理盐水。定期记录小鼠体重，W及肿瘤长径、短径，计算肿瘤体积(V = ab2/2，a为肿瘤长径，b为肿瘤短径）。经过屯周给药后，将所有老鼠处死，解剖取肿瘤，称 瘤重。后将肿瘤组织置于4%多聚甲醒固定，石蜡包埋，切成4皿薄片，放在免疫组化或皿染 色专用载玻片上，烘干待用。
[0(?日]实验方法：免疫组化法与苏木精一伊红染色法化ematoxylin-eosin staining, 肥）
[0066]具体实验步骤为：组织切片于二甲苯中脱蜡，梯度乙醇脱水（无水乙醇，95%酒 精），与3%此化解化15min阻断内源性过氧化物酶活性。后进行抗原修复，巧樣酸缓冲盐水 (抑值6.0)或专用的抓TA抗原修复工作液，在小功率电炉上加热，至似沸微沸。室溫下自然 冷却后取出切片，蒸馈水洗3次，1次3min，血清封闭20min，室溫（25°C)。然后与相应的抗体 在4 °C湿盒中过夜，主要抗体同实施例3。第二天，蒸馈水洗3次/3min，加入二抗增强剂 30min，相应种属二抗30min，DAB和苏木精分别进行染色，后进入下行系统，即梯度乙醇，后 二甲苯，封片待观察评分，进行统计学分析;后者使用德国Leica全自动组织染色机，进行自 动化肥染色
[0067] 实验结果
[0068] 1、小白菊内醋可抑制肿瘤的生长，但对动物体重无明显影响。如附图7所示，在 8mg/kg小白菊内醋的剂量，肿瘤抑制率大于50%。
[0069] 2、小白菊内醋可在组织水平上影响EMT相关标志物表达。如附图8所示，肿瘤组织 免疫组织化学分析显示，上皮标志物表达均增加，而间充质标志分子表达均下调，证明其可 显著的抑制肺部肿瘤细胞的转移；同时CD34下调也提示小白菊内醋具有抗肿瘤血管生成的 作用。
[0070] 3、小白菊内醋增加了肿瘤组织内坏死区面积，且能明显减少肺转移灶的数量。如 附图所9、10示，通过肿瘤截面积坏死区域的比例分析发现，随着小白菊内醋浓度增加，肿瘤 组织内坏死区面积增加，抑制肿瘤转移与发展。
[0071] 综上所述，小白菊内醋可W制备成肺癌治疗药物，其对肺癌细胞系的增殖、迁移均 具有显著的抑制作用，并可通过逆转其EMT，显著的抑制肺部肿瘤细胞的转移，同时可引发 其在胞内凝集而使细胞丧失迁移运动能力，抑制肿瘤细胞的转移，引发了肿瘤细胞转移的 能力的削弱，抑制肿瘤转移的与发展，可在肺癌治疗上发挥显著成效。
[0072] W上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用W限制本发明创造，凡在本 发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造 的保护范围之内。
【主权项】
1. 小白菊内酯的应用，其特征在于:其是在制备治疗肺癌药物中的应用。2. 根据权利要求1所述的小白菊内酯的应用，其特征在于:所述小白菊内酯在制备治疗 肺癌药物中的应用是通过逆转肺癌细胞上皮细胞-间充质转化，从而抑制肺癌细胞的生长、 侵袭或转移。3. 根据权利要求1所述的小白菊内酯的应用，其特征在于:所述肺癌包括小细胞肺癌及 非小细胞肺癌。4. 根据权利要求1所述的小白菊内酯的应用，其特征在于:所述治疗肺癌药物包含小白 菊内酯或其药学上可接受的盐，水合物或其组合及辅料。5. 权利要求1或4所述的小白菊内酯的应用，其特征在于:所述含有小白菊内酯的肺癌 药物可制备成片剂、胶囊、口服液体制剂、喷雾剂、注射液中的任意一种或两种以上的组合。
【专利摘要】本发明公开小白菊内酯在制备治疗肺癌药物中的应用，是通过小白菊内酯逆转肺癌细胞上皮细胞-间充质转化作用，从而抑制肺癌细胞的生长、侵袭或转移。本发明实施例中包括MTT实验、Transwell、划痕实验、免疫荧光等细胞及动物的实验研究，结果表明小白菊内酯可以逆转肺癌细胞上皮细胞-间充质转化(EMT)，从而抑制肺癌细胞(小细胞肺癌及非小细胞肺癌)的侵袭和转移，可在肺癌治疗上发挥显著成效。
【IPC分类】A61P11/00, A61P35/04, A61P35/00, A61K31/365
【公开号】CN105663119
【申请号】CN201610073833
【发明人】杨诚, 孙涛, 周红刚, 刘慧娟, 刘艳荣, 陈双, 秦源, 仲威龙, 王玮, 赵冬, 谷文光, 竞香艳, 孟晶, 荆学双, 胡雪姣
【申请人】南开大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年2月2日