还可以指细菌或其它宿主细胞，其包 含、生产或在其表面暴露一个或多个含有或衍生自HIV Gag和/或Pol的病毒蛋白或肽或表 位。
[0076] 事实上，重组病毒颗粒的大多数是其中原始结构蛋白（即，主要包膜蛋白和核心蛋 白）的一部分被来自另一病毒的对应(count erpart)蛋白取代的病毒颗粒。作为例子，包膜 蛋白可互换。在这样的情况中，重组病毒颗粒包含存在于病毒基因组中的"嵌合"基因组，其 具有与编码来自另一病毒的包膜蛋白的序列互换的编码包膜蛋白的序列。大多数重组病毒 颗粒是可复制的、且有感染性的。
[0077] 如文中所使用的，包含来自另一病毒的蛋白的重组病毒指，在内部或呈现在其表 面，含有一个或多个含有或衍生自HIV Gag和/或Pol的病毒蛋白或肽或表位的重组病毒颗 粒。描述了用于生产重组病毒颗粒的方法的非限制例子：
[0078] *甲病毒(Alphavirus)=WO 02/053757中，公开了表达HIV(ENV蛋白）的重组甲病 毒。
[0079] *逆转录病毒:EP 1499736中，公开了表达嵌合糖蛋白的慢病毒（Ientiviral)载 体。
[0080] *腺病毒（例如5、7或35型）：US 2007/077257、US 2007/054395、JP 2007037402、W0 2006/120034、US 2004/253210、US 2004/170647、US 2005/070017、US 2003/228329、US 2004/101957、US 2003/219458、US 2004/009936、US 2004/028652、W0 03/050238、W0 03/ 038057、W0 03/020893、W0 02/31168、W0 02/22080、W0 01/02607和US6716823中，公开了表 达HIV蛋白的重组腺病毒。
[0081 ] *痘病毒(金丝雀痘(canarypox)、牛痘、Ankara牛痘和禽痘病毒）：US 5,766,598、 EP 0592546、US 2007/048861、US 2006/188961、US 2006/134133、EP 1789438、W0 2005/ 017208、W0 2004/035006、US 2004/146528、JP 2003321391、EP 1378516、W0 95/07099、JP 7170982、DE 4141741、EP 0449116、JP 1148183、JP 1085072、EP 0592546、EP 0243029、US 2005/287162、JP 2004105187、JP 2004089185、W0 03/095656、EP 0592546、W0 96/40880、 US 6，136,318、US 5,670,367中，其公开了表达包含HIV蛋白的病毒蛋白的重组痘病毒。 [0082] *含有、生产或在其表面暴露至少一个来自病毒的蛋白的细菌:US 7，189,402和TO 96/11708中，其公开了表达HIV糖蛋白（即，包膜蛋白）的沙门菌属(Salmonella)或大肠杆菌 (E.coli) 〇
[0083]优选地，重组病毒颗粒对应于痘病毒，该痘病毒优选选自金丝雀痘(例如，ALVAC病 毒载体，如描述于专利US 5,766,598和EP 0592546中的）、牛痘(例如牛痘病毒，如公开于国 际专利申请WO 95/07099中的）、Ankara牛痘（如，NYVAC病毒载体，如公开于专利申请EP 1789438中的）和禽痘病毒（如，TROVAC病毒载体，如公开于国际专利申请WO 03/095656中 的)。
[0084] 更优选地，所述痘病毒是金丝雀痘病毒。作为对应于金丝雀痘病毒且表达HIV肽/ 蛋白的重组病毒颗粒的一个例子，可以引用公开于专利US 5,766,598(从第6栏第18行至第 82栏第36行在此引入作参考）中的ALVAC病毒载体，其中该ALVAC载体作为例子表达HIV-I gpl20、HIV-l gpl60、HIV-l env非切割的分泌形式、用跨膜序列锚定的HIV-I gpl20、HIV-l gag/pol、HIV_l gag/pol和env(gpl20)、HIV_l gag/pol和env(gpl60)、以及HIV-1 gag/pol 和env (带有跨膜锚定的gp120)。优选地，所述ALVAC载体表达HIV-Igag/po I和env (gp 120)， 最优选地所述ALVAC载体是ALVAC vCP1521。
[0085] "病毒颗粒"优选是SIV或HIV颗粒，如含有突变的病毒基因组（例如，通过核酸突 变、取代或插入)导致产生非感染的病毒颗粒的SIV或HIV病毒颗粒。
[0086] 包含突变的病毒基因组的病毒颗粒公开于US 7,229,625、US 6，121，021、US 6， 923,970、US 6,544,527、US 6,451,322和US 6,080,408。
[0087] 有利地，为了使病毒颗粒或重组病毒颗粒安全施用于人，所述病毒颗粒或重组病 毒颗粒在施用前是失活的。这样的失活对重组病毒颗粒、甚至对非复制的那些，可能是必要 的。
[0088] 如文中使用的"失活的病毒颗粒"，所述病毒颗粒是重组或非重组的，指不再感染 的，优选不再复制的病毒颗粒。
[0089] 用于失活病毒颗粒或重组病毒颗粒的方法对本领域技术人员是公知的。病毒失活 的非限制的例子包括化学失活例如福尔马林、牛磺酸氯胺、甲醛、多聚甲醛、丙内酯、β丙内 酯(REMUNE)或aldrithiol-2(无对应中译文）(ΑΤ-2,参见US 6,001，155)处理、热失活、物理 失活如U. V或γ辐射或微波暴露、及其组合。对于HIV失活的参照，参见RAVIV等人 (J.Virol.，vol.79(19)，p:12394-12400,2005)〇
[0090] 根据一个实施方式，所述失活是化学失活，其选自福尔马林、牛磺酸氯胺、甲醛、多 聚甲醛、丙内酯、β丙内酯(REMUNE)或aldrithiol-2失活。
[0091] 或者，或额外地，所述失活是热失活。这样的失活是技术人员公知的，作为该方法 的例子，可以引用实施例中公开的。实际上，发明人令人惊奇地在猕猴中建立了化学地（即， AT-2)和/或热失活的病毒，当与非致病活性菌联合时，其诱导保护性免疫耐受。
[0092]有利地，为了施用于人的目的，病毒颗粒至少失活两次，典型地使用至少以上提及 的两种失活方法。
[0093]优选地，如以上提及的，用作本发明的药物组合物中的抗原的病毒颗粒(重组或非 重组的，VLP或非VLP)是核酸（即，DNA或RNA)非依赖的，这意味着病毒颗粒不含有任何病毒 DNA或RNA，或者如果其含有DNA或RNA，其在免疫原性中没有作用。
[0094]或者，多种结构的聚合微颗粒（以微胶囊、微球等的形式)且在其表面提呈一个或 多个含有或衍生自HIV Gag和/或Pol的病毒蛋白或肽或表位，可用作根据本发明的药物组 合物中的抗原。这样的微颗粒可由适当的生物或化学的聚合物形成，例如，甲基丙烯酸葡聚 糖、甲基丙烯酸聚乙二醇酯和/或明胶，含有或衍生自HIV Gag和/或Pol的HIV病毒或病毒蛋 白或肽或表位可粘附于其上。聚合微颗粒的例子可见于文献中（例如Wei Li Lee等人， (2010) ,Sandri等人（2007) ,Goldberg等人（2003) ,Delie F. (1998) ,Ponchel等人（1998)， Mathiowitz等人（1997) ,Fasano等人（1997) ,Chickering等人（1997))。
[0095]在一个优选的实施方式，根据本发明的HIV-I药物组合物中的抗原是能够表达一 个或多个含有或衍生自HIV-I Gag和/或Pol的病毒蛋白或肽或表位的一个或多个病毒颗 粒。或者，根据本发明的HIV-I药物组合物中的抗原是在其表面提呈一个或多个含有或衍生 自HIV-I Gag和/或Pol的病毒蛋白或肽或表位的一个或多个聚合微颗粒。
[0096]优选地，用于根据本发明的药物组合物中的抗原是至少大约I IOkDa大小。优选，至 少大约 120、130、140、150、160、170、180、190、200kDa 大小，甚至更大。
[0097]使用常规的一般知识，以及在以下公开的实施例的基础上，结合SIV或HIV病毒，技 术人员很容易确定用于本发明上下文中的病毒抗原的有效量。
[0098]作为实例，当所述抗原是颗粒抗原、且更特别地是病毒颗粒时，病毒颗粒的量是大 约IO6至大约IO12每mL所述混合物。
[0099] 非致病细菌
[0100] 如本发明人用猕猴中的SIV所示的，当通过粘膜或皮内或上皮内的途径与如上所 定义的适当的抗原一起施用时，包含在药物组合物中的非致病活细菌能够诱导并优选地维 持对上述抗原的免疫耐受的状态。在人中，这使得可能预防和/或治疗HIV疾病。
[0101] 因而，所述细菌可被认为是特定的佐剂，其在文中可被指定为"致耐受的佐剂"或 "致耐受载体（carrier)"或"致耐受载体（vehicle)"或"耐受性载体"或"耐受作用 (tolerization)载体"或"用于耐受的载体"，这些术语是同义的。
[0102] 优选地，所有这些等同的术语指，为了获得对抗原的特异性免疫保护(优选，免疫 耐受），从而预防和/或治疗人中的HIV疾病，与如上定义的HIV抗原组合使用的非致病活细 菌。
[0103] 更优选地，"致耐受载体"是非致病活细菌，其与如上定义的HIV抗原混合施用，以 实现下述免疫保护的效果的一个或多个、优选2或多个、更优选3或多个：
[0104] 1)"致耐受载体"不诱导全身HIV抗原特异性抗体的显著产生：
[0105]特别地，没有观察到全身抗HIV IgM和/或IgG抗体的显著产生。例如，没有显著的 全身体液反应，就是说通过经典临床实验室方法如ELISA没有检测到特异性可检测的全身 抗体反应，或者如果检测到全身抗体，对于抗HIV病毒感染也不是保护性的。
[0106] 2) "致耐受载体"不诱导显著的HIV抗原特异性⑶4+T细胞增殖：
[0107] 特别地，通过例如所附实施例中描述的标准分析测量的，在体外HIV抗原刺激时， 没有观察到显著的HIV抗原特异性CD4细胞增殖。
[0108] 3) "致耐受载体"在体外HIV抗原刺激时，不诱导显著的由⑶8+T细胞产生的γ干扰 素：
[0109] 特别地，在体外HIV抗原刺激时，观察到的由⑶8+Τ细胞分泌的γ干扰素水平在 ELI spot分析的阈值水平以下。
[0110] 4) "致耐受载体"诱导抑制HIV抗原提呈⑶4+T细胞激活的显著⑶8+T细胞反应：
[0111] 特别地，如随附实施例所示，可通过测量由CD8+T细胞抑制的病毒复制水平(指示 "显著的" CD8+T细胞反应）的体外测试确定该反应。这些⑶8+T细胞还称为⑶8+"调节" T细 胞。但是，特别地，考虑到，例如该反应不诱导γ干扰素的显著产生，该反应是非细胞毒性 的。但是，特别地，该反应是MHC-lb/E限制的。但是，特别地，TCRap看起来参与抑制病毒复制 的CD8+T细胞反应。但是，特别地，与去除CD8+T细胞的相同细胞群相比，该反应抑制HIV抗原 提呈CD4+T细胞的激活。优选地，所述反应抑制HI V抗原提呈CD4+T细胞的早期激活，其中所 述"早期"激活是通过Ki67+标记物测量的（Scholzen和Gerdes .J.Cell Physiol · 182,311-322(2000三月））。
[0112] 通过以上在1)、2)和3)中使用的术语"不诱导"，意指对于适当的定量检测分析，低 于阈值水平的结果，其中所述"阈值水平"是依据阴性对照在分析中确定的值:在该值以下， 结果是阴性结果。该值可根据分析不同而不同，以及检测方法不同而不同。
[0113] 有利地，致耐受载体选自活的：
[0114] -非致病细菌，特别是益生菌(probiotics)和共生细菌；
[0115] -减毒的致病细菌;和
[0116] -失活(可选地，也是上述减毒的）致病细菌。
[0117] 致耐受载体可以是重组或非重组的。
[0118] 在本发明的上下文中用作致耐受载体的"非致病细菌"通常在人中不诱导任何病 理。这也是其通常被认为安全(GRAS)的原因。当然，这样的细菌应当是可施用于人的。
[0119] 用作致耐受载体的优选非致病细菌是共生细菌。这样的细菌是技术人员公知的。 非限制的例子包括芽孢杆菌属(1^〇；[11113 8?)(例如，芽泡杆菌13.003〖1113118)、动物双歧杆 菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌 (Bifidobacterium infantis)、长双歧杆菌（Bifidobacterium Iongum)、两歧双歧杆菌 (Bifidobacterium bifidum)、乳双歧杆菌（Bifidobacterium Iactis)、大肠杆菌 (Escherichia coli)、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌 (Lactobacillus bu lgari cus )、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei)、副干酪乳杆菌 (Lactobacillus paracasei )、约氏乳杆菌（LactobaciIIus johnsonii )、植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)、罗伊氏乳杆菌（LactobaciIlus reuteri )、鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus )、短乳杆菌（Lactobacillus brevis)、加氏乳杆菌 (Lactobacillus gasseri)、唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius)、乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis)、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus)等等。
[0120] 用作本发明上下文中的致耐受载体的"共生细菌"有利地是乳酸菌或双歧杆菌，其 更特别地选自以上列表，还包括其组合。一个优选的共生细菌是乳杆菌属(Lactobaci Ilus sp .)，以及更优选地是植物乳杆菌。以下报道的实施例第一次表明植物乳杆菌是致耐受载 体，当与如上定义的抗原一同施用时，导致病毒免疫耐受。
[0121] 有利地，非致病细菌的组合，如两种或多种共生细菌，可用作致耐受载体。
[0122] 如文中使用的，术语"致病细菌"指在人中诱导病理的细菌。这样的细菌对技术人 员是公知的，包括尤其是李斯特菌属(Listeria species)(例如单核细胞增生李斯特氏菌 (Listeria monocytogenes))、棒状杆菌属（Corynebacterium species)、分枝杆菌属 (Mycobacterium species)、红球菌属（Rhococcus species)、真细菌属（Eubacteria species)、博德特氏菌属(Bortadella species)和诺卡氏菌属(Nocardia species)。优选 地，致病细菌选自分枝杆菌属（Mycobacterium species)，更优选为牛分枝杆菌 (Mycobacterium bovis)〇
[0123] 如文中使用的，"减毒致病细菌"是由于一个或多个突变或一种或多种减毒处理 (例如，化学处理和/或在特定介质上的连续传代），与其野生型对应物相比毒性(virulent) 较低的致病细菌。该减毒致病细菌是本领域技术人员公知的。减毒致病细菌非限制的例子 包括减毒的鼠伤寒沙门氏菌（Salmone I la typhimurium)和优选减毒的分枝杆菌的分枝杆 菌。作为减毒分枝杆菌的例子，可以引用"卡介苗(Bacille de Calmette Guerin)"，也被称 为"BCG"，而且，更特别地，其中，六个广泛应用的BCG株-进化早期株BCG Japanese、DU2组 III中的两个进化晚期株（BCG Danish和Glaxo)，和DU2组IV中的三个进化晚期株（BCG Connaught、Pasteur和Tice)。作为减毒分枝杆菌的其它的例子，还可以引用重组BCG，如公 开于HOFT等人(2008)中的株rBCG30，公开于WANG等人(2008)中的重组BCG，以及公开于国际 专利申请WO 2005/111205和WO 02/102409以及公开于专利US 7,122,195和US 6,261,568 中的重组BCG。
[0124] 有利地，不是减毒的或减毒的同时，致病细菌可以被失活以用作本发明上下文的 致耐受载体，但是，减毒致病细菌在被失活后也可以被使用。
[0125] "失活致病细菌"是本领域技术人员公知的。该失活致病细菌的制备方法构成本领 域常规普通知识的一部分。作为这种方法的例子，能举出噬菌体介导的裂解、化学失活如福 尔马林处理(见US 7，393，541 )、热失活、如冷冻干燥(例如，扩展冷冻干燥)或U. V或γ辐射 (参见WO 2008/128065)或微波暴露的物理失活，以及它们的组合。
[0126] 优选地，所述致耐受载体是致病细菌如BCG的减毒衍生物。以下报道的例子第一次 表明BCG是致耐受载体，当与如上定义的抗原一同施用时导致病毒的免疫耐受。
[0127] 当重组时，根据本发明的致耐受载体不表达任何HIV蛋白或肽或表位。
[0128] 优选地，至少用作致耐受载体的活细菌的显著量在对数中期。更优选地，至少大约 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或甚至大约 100% 的细菌细胞总 数在对数中期。
[0129] 技术人员能够容易地确定致耐受载体的有效量，该有效量的例子在以下公开。
[0130] 作为例子，本发明药物组合物中所述细菌的量是大约IO4到大约IO14CFU每ml所述 混合物。
[0131] 药物组合物
[0132] 所述组合物文中还作为"致耐受组合物"或"耐受-免疫原组合物"，这些术语是等 同的。
[0133] 致耐受载体和含有或衍生自HIV病毒的Gag和/或Pol的抗原是两个分别的、不同的 组分，其作为混合物包含在本发明的药物组合物中。这意味着所述致耐受载体和所述抗原 作为不同的组分存在于所述组合物中。
[0134] 有利地，本发明的药物组合物不包含作为佐剂的任何寡核苷酸（例如，C p G或 dsRNA)〇
[0135] 由于致耐受载体是细菌，相同属和/或种的细菌可在重组形式下分别用作抗原的 来源。例如，重组细菌将含有位于适当的调节序列(包括启动子，可诱导的或组成性的)控制 下的编码抗原的核酸，该核酸可以在包含于细胞内的核酸载体上，或者作为整合的核酸序 列整合至细菌染色体。从而，重组细菌将能够表达或产生所述抗原。因而，根据特定的实施 方式，本发明的药物组合物包含是细菌的致耐受载体，以及是一个或多个含有或衍生自HIV Gag和/或Pol的病毒蛋白或肽或表位的抗原，且其分开地由与致耐受载体属于相同的属和/ 或种的重组细菌产生。
[0136] 在根据本发明的药物组合物中，当所述抗原是颗粒抗原且更特别地是病毒颗粒 时，在所述混合物中所述病毒颗粒(表示为每ml所述混合物中的颗粒)对所述细菌(表示为 每ml所述混合物中CFU)的比是大约从1:10到大约1:1000,优选从大约1:25到大约1:750,然 而优选地从大约1:50到大约1:500，甚至更优选地从大约1:75到大约1:250，然而更优选地 为大约1:100。
[0137] 施用本发明的药物组合物
[0138] 有可能同时地、或分开地或相继地施用致耐受载体和抗原。
[0139] 因而，本发明的一个目的是提供用于预防和/或治疗有需要的人中HIV疾病的药物 试剂盒，其含有：
[0140]-在第一容器中，如上定义的抗原;和
[0141] -在第二容器中，如上定义的非致病活细菌，
[0142] 其中所述抗原和所述细菌在用于粘膜或皮内或上皮内施用的药学上可接受的载 体中。
[0143] 本发明的