另一个目的是提供产物，产物含有：
[0144] -如上定义的作为致耐受载体的非致病活细菌;和
[0145] -如上定义的具有一个或多个来自HIV Gag和/或Pol蛋白的表位的颗粒抗原或抗 原，
[0146] 作为用于同时的、分开的或相继使用的组合药物组合物，用于预防和/或治疗有需 要的人中HIV疾病。通过粘膜地或皮内地或上皮内地向所述人施用所述组合的药物组合物 实现所述预防和/或治疗。为了该目的，可以同时地、或分开地、或相继地施用致耐受载体和 抗原。
[0147] 作为实例，非致病活细菌可以口服(例如，作为口服药物或食物补充剂），而抗原是 粘膜地、或皮内地或上皮内地施用。
[0148] 当然，为了保证每次适当的递送至预期位点（例如，粘膜表面），可以使用适当的药 物载体。技术人员将轻易调整施用各致耐受载体和抗原的时间和剂量。
[0149] 优选地，根据本发明的药物组合物是粘膜或皮内或上皮内的药物组合物。但是优 选地，其是口服的药物组合物。
[0150] 如文中使用的，"粘膜或皮内或上皮内的药物组合物"是用于粘膜或皮内或上皮内 施用的药物组合物，这意味着其被配制用于这样的施用。
[0151] 特别地，药物组合物可进一步包括用于粘膜或皮内或上皮内递送所述抗原和所述 细菌的一个或多个适当的药物载体(或支持物）。
[0152] 优选地，文中的"粘膜递送"选自鼻、口、舌下、气管、咽、支气管、食管、胃、十二指 肠、小肠、直肠、包皮和阴道递送。"粘膜递送"是递送到粘膜表面，如鼻、口、舌下、气管、支气 管、咽、食管、胃、和十二指肠、小和大肠的粘膜、包括直肠粘膜，以及包皮和阴道粘膜。在本 上下文中，粘膜表面还包括眼睛的外表面，即，眼睛及其周围的粘膜。然而，优选地，粘膜表 面是指阴道和消化道粘膜，更优选消化道粘膜。然而优选的是，粘膜递送是口服递送。
[0153] 因而，药物组合物还可以包含一个或多个取决于施用途径的药物载体。药学领域 的普通技术人员熟知，或能容易确定用于药物递送至粘膜表面的载体，或用于皮内或上皮 内递送的载体。关于这方面，有用的参考是Chien(Novel Drug delivery system,第三章从 6至9,Marcel Dekker，1992) ,Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry,第六 版（多位编辑，1989-1998，Marcel Dekker);以及Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(ANSEL等人，1994，WILLIAMS&WILKINS) 〇
[0154] 对于本发明中有用的药物递送的示例性方法和途径在以下简述。
[0155] 至支气管、细支气管、气管、鼻、口、包皮或咽粘膜的施用可通过将药物组合物配制 成吸入、喷雾等(例如，喷鼻、气雾喷雾或栗喷雾等）、溶液、凝胶等而获得。适用于将药物组 合物递送至鼻粘膜、气管和支气管的喷雾器装置是本领域已知的，因此在这里将不进行详 细说明。那么，药物组合物可包括选自溶液、乳液、微乳液、水包油型乳液、无水脂质和水包 油型乳液、以及其它类型的乳液的载体。
[0156] 至阴道粘膜的施用可通过将药物组合物配制成溶液、灌肠剂、泡沫、栓剂、阴道片 剂或局部凝胶而获得。优选用于阴道递送的载体包括亲水的和疏水的载体，例如常用在配 制乳液或凝胶制剂中的那些(例如，油/水乳液凝胶）。
[0157] 至消化道粘膜的施用可通过将药物组合物配制成胶囊、微胶囊获得。用于消化道 递送的优选载体对应着通常经口给药的胶囊和微胶囊(例如，果胶和/或藻酸盐的胶囊和微 胶囊），如通常用于配制消化道递送制剂的那些（例如，公开于国际专利申请WO 2007/ 140613中的微胶囊）。或者，可通过消化或施用适当的液体和/或食品，例如饮料、酸奶等获 得消化道递送。
[0158] 皮内或上皮内施用是技术人员公知的。例如可以使用针装置进行皮内施用(例如， 注射），例如专利US 6，933,319和国际专利申请WO 2004/101025中公开的，或者用适当的无 针装置进行。
[0159] 药物组合物可进一步包含至少一个吸收剂。"吸收剂"是本领域技术人员熟知的。 例如，可以举例表面活性剂，例如山梨糖醇酐脂肪酸偏酯的聚氧乙烯衍生物(例如，吐温? 80、硬脂酸聚烃氧40酯、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯-9-月桂基醚和辛苯聚醇）、胆汁盐 如甘氨胆酸钠、混合胶束、烯胺、一氧化氮供体（如，S-亚硝基-N-乙酰基-DL-青霉胺、NORl、 N0R4-其优选与NO清除剂如羧基PITO或双氯芬酸钠联合施用）、水杨酸钠、乙酰乙酸的甘油 酯（例如，甘油基-I，3_二乙酰乙酸酯或I，2_异亚丙基甘油-3-乙酰乙酸酯）、环糊精或β-环 糊精衍生物(例如，2-羟丙基-β-环糊精和七(2，6-二-O-甲基-β-环糊精））、中链脂肪酸，如 单-和二甘油酯（例如，椰子油的癸酸钠提取物，Capmul)、或甘油三酸酯（如，淀粉糊精、 Estaram 299、Miglyol 810)、聚合物如羧甲基纤维素、卡波姆、聚卡波非、黄蓍胶和藻酸钠、 以及其它适合于粘膜或皮内或上皮内的递送的吸收剂。关于已经成功用于粘膜或皮内或上 皮内药物递送的吸收剂的一般原则的参考，参见Chien,Novel Drug Delivery Systems Ch.4(Marcel Dekker,1992)〇
[0160] 药物组合物可进一步包含一个或多个添加剂(例如，稀释剂、赋形剂、稳定剂、防腐 剂等）。一般地，参见，Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry,第六版（多位 编辑，1989-1998,Marcel Dekker);和Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (ANSEL等人，1994 ,WILLIAMS&WILKINS) 〇
[0161] 如以下公开的，将被施用于人受试者的根据本发明的药物组合物的适当剂量可以 根据所述受试者的一个或多个特征确定，如性别、年龄、体重、健康等。
[0162] 作为例子，当抗原是颗粒时，更特别地，当其是病毒颗粒时，可以每天向所述人施 用大约IO8至大约1〇 14个病毒颗粒的剂量。作为另一个例子，可以每天向所述人施用大约IO6 至大约IO16CFU的非致病活细菌的剂量。
[0163] 本发明药物组合物的应用
[0164] 本发明的一个目的是提供如上所述的药物组合物，作为药物，优选作为疫苗的用 途。
[0165] 本发明还涉及用于预防和/或治疗有需要的人中HIV疾病的方法，包括至少向所述 人粘膜地或皮内地或上皮内地施用有效量的如上定义的药物组合物的步骤。
[0166] 根据本发明，为了预防的目的，"有需要的人"可以是任何人，优选至少大约2岁的 人。为了治疗的目的，"有需要的人"是由于他/她患有HIV疾病将被治疗的人。
[0167] "HIV疾病"指任何与HIV相关的免疫疾病，包括AIDS以及疾病进展的早期阶段，包 括血清转化(慢性感染的建立）。
[0168] 本发明进一步涉及保护人免受HIV的方法，包括至少向所述人粘膜地或皮内地或 上皮内地施用有效量的如上定义的药物组合物的步骤。
[0169] 特别地，如果粘膜地暴露于HIV，该方法能够保护人免受HIV感染，和/或如果静脉 暴露于HIV，该方法能够保护人免于HIV复制。
[0170] 本发明还进一步地涉及保护人免受HIV血清转化的方法，包括至少向所述人粘膜 地或皮内地或上皮内地施用有效量的如上定义的药物组合物的步骤。从而，所述人将不会 变成血清阳性，并不会表现出显著的HIV抗体水平。
[0171] 术语"接种"指采取的预防和/或治疗人HIV疾病的行动(特别地，施用本发明的药 物组合物）。优选地，本发明的药物组合物对于诱导和，优选地，维持人对含有或衍生自HIV 病毒的Gag和/或Pol的抗原的免疫耐受是有用的，即，换言之，对接种(或"致耐受"）所述人 是有用的。因而，使用本发明的药物接种人被认为是"致耐受接种"（或"耐受作用"或"耐 受"）。
[0172] 如果在粘膜或皮内或上皮内施用本发明的药物组合物后（即，在致耐受接种后）， 在人中成功地诱导了免疫耐受，所述人被认为是"被接种的"（或"被耐受的"或"耐受的"）。 对体内病毒感染挑战的反应，即，如通过"被接种"人的血浆病毒RNA载量所评估的病毒复 制，与对照人(对其单独施用了抗原、或抗原与标准佐剂（如上定义的）、或没有施用药物组 合物或安慰剂)血浆病毒RNA载量相比，降低了至少大约50%、更优选至少大约70%、然而更 优选至少大约75%、或80%或85 %或90 %或95 %或98 %或99%，或甚至更多（99.5%、 99·8%、99·9%、100%)〇
[0173] 根据本发明，致耐受接种可以包括一次或多次药物组合物的连续施用。优选地，致 耐受接种可以包括至少两次或多次连续施用（即，接种），更优选地，两次以上连续施用所述 组合物。
[0174] 有利地，连续致耐受接种之间的间隔是1分钟到3个月之间，优选15分钟到2个月之 间。
[0175] 但是，有利地，本发明的致耐受接种还可以包括第一次粘膜或皮内或上皮内的致 耐受接种之后一年或多年，再次致耐受接种(例如1到1 〇年）。
[0176] 第一次粘膜或皮内或上皮内的致耐受接种之后新的致耐受接种可以选自粘膜、皮 内和上皮内的致耐受接种。明显的，如果新的致耐受接种是上皮内或皮内注射，那么特异性 全身体液和/或细胞毒(产生γ干扰素)反应是可检测的，但是对疾病的预防或治疗没有作 用。
[0177] 根据本发明，药物组合物的有效量施用至有需要的人。术语"有效量"指足以实现 所需生物效果的量，此处的生物效果是通过诱导免疫耐受，优选"Ts"免疫耐受的治愈或保 护作用（换言之，免疫保护效果）。可理解有效剂量将取决于将被治疗的受试者的年龄、性 另IJ、健康和体重、如有的话，同时治疗的种类、治疗的频率和预期效果的性质。以下提供的有 效剂量的范围没有意图限制发明，代表优选的剂量范围。但是，如本领域技术人员理解的且 能够确定的，可调整优选剂量以适应受试者，这不需要过度（undue)实验。参见，例如， Ebadi,Pharmacology,Little1Brown and Co·,Boston,Mass·(1985)〇
[0178] 例如，关于HIV，对于成年人的典型剂量是每剂量大约IO6-IO12HIV病毒颗粒（即， VLP，重组或非重组病毒颗粒），优选108-101()。当然，无论使用多少剂量，其应当是被已知的 方法确定为安全有效的量，如本文所述。
[0179] 而且，本领域技术人员还能够根据他/她的一般知识确定为了实现所需的生物效 果，将被施用于人的致耐受载体的有效量。
[0180] 作为例子，所述致病细菌(例如BCG)的减毒衍生物的有效量是每剂量IO4至1012的 范围，优选IO 5至l〇1()CFU(克隆形成单元），更优选IO6至108CFU。作为其它的例子，所述致病细 菌或失活的致病细菌(例如BCG)的减毒衍生物的有效量是每剂量0.OOlmg至Ig的范围，优选 0.01 至 100mg，更优选 0.1 至 10mg。
[0181] 作为其它的例子，所述非致病细菌（例如乳杆菌属）的有效量是每剂量大约IO6-IO14CFU的范围，更优选大约10 1()-1012CFU。
[0182] 如上所述，本发明的药物组合物适于预防人将来的HIV疾病，或治疗已患HIV疾病 的人。
[0183]对于治疗的目的，如上定义的"抗原，含有或衍生自HIV病毒的Gag和/或ΡοΓ，可以 是自体同源的，也就是说，其可以衍生自感染将被治疗的人的HIV病毒。在这种情况中，例 如，HIV病毒可以分离自人，然后，可以培养病毒并使其失活(优选至少失活两次），最后与致 耐受载体结合从而获得如上所述的药物组合物。
[0184] 然而，例如，含有自体同源或非自体同源的含有或衍生自HIV Gag和/或Pol的抗原 的药物组合物可以在常规的抗病毒治疗期间施用给人，其将首先导致检测不到的病毒载 量。然后，只要通过自体同源病毒特异性CD8细胞实现了非自体同源急性感染的CD4细胞的 适当离体病毒复制抑制，或者只要实现了由CD8 T细胞诱导的CD4 T细胞激活的适当抑制， 就在一次或多次使用药物组合物的致耐受接种后，停止常规抗病毒治疗。
[0185] 特别地，为了治疗目的，药物组合物可以在被治疗人的生命期间仅施用一次。或 者，其可以在被治疗人的生命期间施用两次或多次，在同一天或者隔开一定期间的不同天， 所述期间的范围例如从大约1天到大约1年，或更长。更特别地，其可以每天或定期地施用， 期间的范围例如从大约1天到大约1年，或更长。如果有必要，药物组合物可以在被治疗的人 的终生施用。
[0186] 本发明进一步提供了用于体外确定人是否被保护免受HIV病毒的方法，包括：
[0187] a)从所述被接种人的血液样品中分离外周血⑶8 T细胞；
[0188] b)在适当的条件下培养：
[0189] (i)所述分离的CD8 T细胞和同种异体或自体同源的CD4+T细胞，CD4+T细胞在体外 急性地被与所述HIV病毒等同的病毒株感染;和
[0190] (i i)所述体外急性感染的同种异体或自体同源的CD4+T细胞；
[0191] c)回收培养上清；
[0192] d)测量所述上清中的病毒载量;和
[0193] e)确定所述人是否被保护免受所述HIV病毒。
[0194]通过"等同于待测试HIV病毒的病毒株"，其意味着所述病毒株源于野生病毒，并具 有与待测试HIV病毒相似的本质特征（例如，可以例举源于个体HIV-I的病毒株HTLVIIIB: HTLVIIIB可被认为是"等同于HIV-I的病毒株"）。优选地，所述病毒株源自是待测试HIV病毒 的野生病毒。因而，所述病毒株代表了研究包括HIV病毒，特别是野生HIV病毒的适当模型。 当然，病毒株被很好地调整以适应这样的研究，特别是在安全性方面。
[0195] 以上所有的步骤能够使用本领域技术人员熟知的标准技术进行。特别是，对于步 骤b)的适当培养条件是本发明领域中普通知识的一部分（如以下实施例中描述的常规方 法)。
[0196] 通过如以下实施例中描述的那些常规方法能测量步骤d)中的病毒载量。
[0197] 从根据亚步骤b)(ii)的所述体外急性感染的同种异体或自体同源的CD4+T细胞培 养物回收的上清中的病毒载量将被用作步骤e)中的确定的参照。通过例如比较仅含有来自 体外急性感染的同种异体或自体同源的CD4+T细胞的一式两份(或一式三份或一式四份或 更多）的孔的上清中的病毒浓度的几何平均值，与含有CD8 T细胞和来自体外急性感染的同 种异体或自体同源的CD4+T细胞的一式两份(或一式三份或一式四份或更多）的孔的上清中 的病毒浓度的几何平均值，将有利地计算"抑制百分比（％ )"或"抑制率"或"抗病毒效果"。 [0198]那么，步骤e)中的所述确定优选如下进行：
[0199]-如果抑制率高于大约100,可以得出结论所述人是被保护的。典型地，这将是如下 情况:如果HIV非感染的人被施用了有效的预防性抗病毒治疗，或者如果HIV感染的人被施 用了有效的治疗性治疗，所述有效的预防性或治疗性治疗包含优选根据本发明的药物组合 物，因而，只要其仍然被保护，则没有必要进一步向人施用任何预防性或治疗性治疗。
[0200] -如果抑制率低于大约100,可以得出结论所述人没有被保护免受所述病毒。那么， 人，HIV非感染的人或HIV感染的人，将有利地分别被施用包含根据本发明的药物组合物的 预防性或治疗性治疗，而且，以适当的时间间隔，将进行一次或多次以上的体外方法，来确 保人成为被保护的。
[0201] 而且，本发明提供了用于体外确定人是否被保护免受HIV病毒的试剂盒，其包含能 够被病毒株感染的同种异体或自体同源的CD4+T细胞，所述病毒株如上所定义的，等同于待 测试所述HIV病毒。试剂盒还可以含有适当浓度的足够的病毒株，以感染上述同种异体或自 体同源的CD4+T细胞，和/或适当的试剂和/或对照和/或介质（如用于细胞悬浮、细胞培养、 细胞储存等的介质）。本发明的试剂盒可特异于HIV病毒特定型，或者其可被调整以适用于 病毒的多种型，所述病毒的型是接近的(特别是，系统发生上接近的）。
[0202] 可以容易地调整本发明以适用于预防和/或治疗任何慢性感染疾病。这样的疾病 的非限制的例子是:B和C型肝炎、人乳头瘤病毒(HPV)、EBV和其它疱疹病毒、肺结核、麻风、 利什曼病等等。
[0203]全局地，每一次当与上述感染或疾病相关的一个或几个致病抗原参与⑶4+T细胞 (所述CD4+T细胞提呈衍生自上述致病蛋白或肽的表位)特异性激活时，非细胞毒性CD8+T细 胞(所述CD8+T细胞由粘膜或上皮内或皮内的结合上述抗原和文中所述致耐受载体的药物 组合物产生)能够引起对CD4+T细胞激活的特异性抑制/防止。
[0204] 文中表明使用本发明的药物组合物能够预防和/或治疗哺乳动物/人中的病毒感 染和相关疾病。根据这一教导，有可能提供其它的药物组合物，其包含：（i)如文中公开的致 耐受载体;和（i i)任何来自病毒、细菌、真菌、原生动物或寄生虫来源的抗原。这样的药物组 合物被配制用于适当的递送(优选，粘膜或皮内或上皮内）所述致耐受载体和所述抗原。其 对于预防和/或治疗由抗原所衍生自的病毒、细菌、真菌、原生动物或寄生虫所引起的哺乳 动物中的慢性感染是有用的。一个例子是细菌药物组合物，其包含（i)如文中所述的致耐受 载体；和（ii)衍生自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的抗原。该细菌药物组 合物被配制用于适当的递送(优选，粘膜或皮内或上皮内）所述抗原和所述致耐受载体。特 别感兴趣地，用于预防和/或治疗人结核的是这样的细菌药物组合物，其中分枝杆菌抗原衍 生自Koch氏杆菌。
[0205] 通过本发明的药物组合物实现的免疫保护
[0206] 耐受是免疫系统的一种生理能力，以识别通过粘膜系统进入的抗原，以及产生对 再次遭遇相同抗原的无反应性(anergy)(-般地与其它免疫修饰相关）。经常表明耐受诱发 粘膜抗原的粘膜s IgA容许的抗体遏制，而不刺激全身免疫区域。TGF-β，一种调节性细胞因 子，有时也参与耐受的产生。也经常表明CD25+调节性T细胞的活性抑制作为粘膜耐受的潜 在机制(Faria和Weiner，2005 ;Mestecky等人2007)。但是，在本发明描述的药物组合物诱导 的免疫耐受中没有观察到这些免疫修饰，其主要特征在于抑制提呈病毒表位抗原的CD4+T 细胞的激活的CD8+T细胞活性，该免疫反应类型迄今没有认识到，更特别地，其是一种全新 类型的免疫耐受。
[0207]表述"耐受"、"免疫学耐受"、"免疫耐受"、"对病毒的免疫耐受"、"新型病毒特异性 耐受"、"对病毒抗原的免疫耐受"、"对病毒免疫原的免疫耐受"和""Ts"免疫耐受"是同义 的。发明人已经表明这对应着猕猴中活跃诱导的强的非细胞毒性、MHC-lb/E限制的CD8+T细 胞反应，其抑制HIV Gag和/或Pol抗原提呈⑶4+T细胞的早期激活，且与⑶4+T细胞增殖的缺 失相关，以及当失活的SIV抗原刺激时没有CD8+T细胞分泌的γ干扰素，并且没有全身抗SIV IgM和IgG抗体的产生。而且，发明人能表明TCRy δ和νβ8不参与病毒复制的⑶8+Τ细胞抑制， 表明了TCRc^应当在识别感染的⑶4+Τ细胞上MHC-lb/E肽提呈中起主要作用。
[0208]尤其，当用包含含有或衍生自HIV病毒的Gag和/或Pol的抗原的常规预防性疫苗组 合物和标准的或常规的佐剂（即，目的是刺激和/或有助于和/或增加与抗原相关的免疫反 应的物理、化学或生物佐剂的任何形式，如S . Plotkiη等人在"Vaccines〃中标题为〃 Adjuvants〃章中描述的）接种时，可观察到"通常的对衍生自病毒的抗原的免疫反应"。该 "通常的对衍生自病毒的抗原的免疫反应"包括体液的、细胞的、或体液和细胞的免疫反应， 其通常的特征为：
[0209] (i)在特异性体外刺激下，病毒特异性C