用于预防和治疗神经退行性疾病的方法
【专利摘要】本发明提供了一种采用葡萄籽提取物或来源于葡萄籽提取物的一种或多种化合物来预防和治疗包括阿尔茨海默病、亨廷顿病和帕金森病等神经退行性疾病的方法。特别是，本发明提供了一种对诊断患有神经退行性疾病或具有发生神经退行性疾病风险的患者进行治疗的方法，通过给予患者治疗量的含有葡萄籽提取物或来源于葡萄籽提取物的一种或多种化合物的药物组合物，以减少β淀粉样蛋白或其低聚体的积累、聚集或沉积，和/或减少tau蛋白或其他蛋白的错误折叠、积累和/或聚集。
【专利说明】用于预防和治疗神经退行性疾病的方法
[0001 ]优先权
[0002] 本申请主张对2008年5月9日递交的美国专利申请第61/051，866号享有美国专利 法35U.S.C第119条的优先权，其内容在此整体引用作为参考。
[0003] 资金信息
[0004] 本发明是在国立卫生研究院提供的资金NIH 1 P01 AT004511-02号的政府资助下 产生的。美国政府对本发明享有一定的权利。 发明领域
[0005] 本发明设及采用葡萄巧提取物来预防和治疗神经退行性疾病。特别是，本发明提 供了对诊断患有神经退行性疾病或具有患神经退行性疾病风险的患者进行治疗的方法，通 过给予患者有效量的含有葡萄巧提取物或来源于葡萄巧提取物的一种或多种化合物的药 物组合物，W减少β淀粉样蛋白或其低聚体的积累、聚集或沉积，和/或减少tau蛋白或其他 蛋白的错误折叠、积累和/或聚集。
[0006] 发明背景
[0007] 神经退行性疾病是与神经细胞退化、丧失功能和常常死亡相关的的病症。由于他 们一般是进行性的，神经退行性疾病的结果往往是灾难性的。患有神经退行性疾病的患者 可能会认知或运动机能严重退化。因此，他们的生活质量和预期寿命可能会大大降低。在人 类中，运些疾病包括但不限于阿尔茨海默病，帕金森病，肌萎缩性脊髓侧索硬化症，亨廷顿 病，额颠痴呆症，皮质基底丑状核退化症，等等。
[000引帕金森病是一种影响控制肌肉运动的脑神经细胞的进行性疾病。运些神经细胞制 造多己胺，运是细胞之间传递信息W促进身体运动的一种重要化学物质。因此，缺失运些神 经元会导致运动失调，例如帕金森病患者通常表现出的颤抖和语言障碍。根据国立神经疾 病和中风研究院所说，美国至少100万人患有帕金森病，并且每年报告约5万个新病例。
[0009] 已经知道，帕金森病的机理设及一种高度保守的突触前蛋白，α-突触核蛋白（α- synuclein)。认为α-突触核蛋白的构象变化会导致疾病特征性的蛋白质积累和纤维形成。 参见美国专利第7,045,290号化indquist等）。现有的治疗选择包括左旋多己胺和多己胺括 抗剂。然而，运些药物只能暂时性缓解症状，并且如果大量使用会产生严重的副作用。丙烘 苯丙胺，一种单胺氧化酶B抑制剂，是第一种提示能提供针对帕金森病病因进行治疗、通过 减轻症状并且减缓疾病发展的药物，但是丙烘苯丙胺的治疗效果是有争议的。参见美国专 利第 6,417,177 号(Nelson)。
[0010] 亨廷顿病化D)是一种遗传性神经系统疾病，具有身体运动异常和智力下降的症 状。亨廷顿病是由于亨廷顿基因化tt)的Ξ核巧酸重复延伸造成的，而运依次又产生了一种 带有多聚谷氨酷胺(polyQ)串的病理延伸的突变形式htt蛋白。突变的htt蛋白错误折叠并 且在脑和其他受到影响的组织中形成聚集物，导致神经细胞死亡(Wolf gang等，Proc Nat Acad Sci 2005:102:11563-11568)。用于治疗亨廷顿病的症状的多数药物具有副作用，如 疲劳、烦躁、或过度兴奋。
[0011] 阿尔茨海默病(AD)是一种进行性脑疾病，一般称为老年性痴呆。超过450万美国人 已经被诊断患有AD，并且预计在未来40-50年运个数字将增加到Ξ倍化yketsos等，Am J Geriatr Psychiatry 2006；14(7):561-72)〇
[0012] 认为AD的病理生理学根源，部分在于淀粉样前体蛋白的错误加工或突变。运种错 误加工的蛋白会使得的定粉样肤(Αβ)或其变体形式的量增加。Αβ的累积导致不可溶的Αβ斑 块沉积，并且最终导致突触失灵、神经损伤、形成过度憐酸化tau蛋白的缠结、W及调亡性神 经元死亡。神经元的损伤或死亡导致缺失多种神经递质，从而导致出现该疾病的认知和功 能症状。
[0013] 目前可用的药物对于一些患者的症状改善相当小，并且不减缓病情的发展。因此， 正在研究治疗或预防AD的各种症状的策略。例如，已经发现AD与脑部炎症相关，因此非类固 醇消炎药物例如布洛芬和巧甲新等已经用于降低发生AD的风险。然而，长期使用运些药物 具有胃肠出血或肾病的风险，并且与罕见的屯、血管毒性相关。氧自由基与AD的相关性也提 出了抗氧化治疗的可能性。美国精神病学协会和美国神经学学会AD治疗指导方针都建议采 用高剂量的维生素 E作为治疗选择。然而，运一建议是缓和性的，最近发现维生素 E治疗不 会延缓AD相关的轻度认知障碍的发展，并且相当高剂量的维生素 E提高了老年人的死亡率。 参见Lyketsos等，2006，见上。
[0014] AD的另一种治疗选择是减少通过一种称为乙酷胆碱醋酶(A化E)的酶天然发生的 乙酷胆碱降解。抑制A化E导致乙酷胆碱水平升高。美国食品和药品管理局有4种已经批准用 于治疗AD的胆碱醋酶抑制剂药物:他克林（tacrine)、多奈赃齐(donepezil)、利凡斯的明 (!'；[￥曰31：1旨111；[]16)和加兰他敏(旨曰1曰]11：11曰111；[]16)。胆碱醋酶抑制剂的短期（最多6个月）临床试 验表明，运些药物改善或减缓了AD相关的认知丧失，但是它们的长期功效的临床试验结果 不明确。在非常轻度或更严重的AD中，胆碱醋酶抑制剂的功效没有被证实。参见Lyketsos 等，2006,见上文。
[001引针对从脑中去除Αβ的AD治疗正在开发中。例如，美国专利第7,262,223号(Kong等） 描述了采用脉化合物来治疗淀粉样蛋白相关疾病;美国专利第7,279,501号化im)描述了采 用从植物中分离的天然产物化合物(如姜黄、银杏和生姜)及其合成的化学类似物来治疗Αβ 诱导的疾病。最近的证据表明，适量饮用红酒可W降低AD的发病率，并且可W减弱AD类认知 功能减退和淀粉样神经病理症状(Dartigues等，Therapie 1993;48:185-187;Do;rozynski， BMJ 1997;314:997;Luchsinger等，JAm Geriatr Soc 2004;52:540-546)。脑中可溶性胞外 高分子量化MW)低聚Αβ物质的积累被认为是认知功能减退发生和发展的主要风险因素 化lyubin等，化t Med2005;ll:556-561;Se化oe，J Alzheimer's Dis 2001;3:75-80)。也已 经表明，来源于葡萄的多酪类化合物可W在体外抑制Αβ的低聚化（Porat等，畑em Biol Drug Des2006:67:27-37)。然而，目前的研究还限于体外测试。
[0016]多种神经退行性疾病与异常的蛋白折叠、蛋白积累、聚集和/或沉积相关。例如，阿 尔茨海默病患者脑中有两种异常的蛋白沉积。由β淀粉样肤构成的淀粉样蛋白斑块在脑实 质中核脑血管壁周围发生细胞外沉积，由过憐酸化的tau蛋白聚集构成的神经原纤维缠结 位于退化神经元的细胞质中。在帕金森病患者中，在黑质的神经元的细胞质中发现了路易 小体。路易小体的主要成分是一种叫做α-突触核蛋白的蛋白的片段。在亨廷顿病的患者中， 脑中的典型特征是富含多聚谷氨酷胺的突变亨廷顿蛋白的核内沉积。遗传性肌萎缩性脊髓 侧索硬化症患者，在运动神经元的细胞体和轴突中具有主要由超氧化物歧化酶构成的聚 集物。此外，各种形式的传染性海绵状脑病的特征在于抗蛋白酶的航蛋白聚集物的积累。 [0017]生化、遗传、神经病理学研究的证据表明，在神经退行性疾病的病理学中，蛋白错 误折叠和/或聚集发挥了积极作用。例如，异常聚集物通常发生在被疾病大部分损伤的大脑 区域。编码错误折叠蛋白的基因突变产生了疾病的遗传形式，其通常比零星形式的疾病发 生更早且表型更为严重。表达错误折叠蛋白的人突变基因的转基因动物会产生人类疾病的 一些典型神经病理学和临床特性。而且，在体外产生的错误折叠的蛋白聚集是神经毒性的， 并且诱导细胞死亡。
[0018] tau蛋白病（taupathy)是一种神经退行性疾病的类型，设及tau蛋白（一种密切相 关的细胞内微管相关蛋白家族）的功能异常。运些神经退行性疾病包括，例如，阿尔茨海默 病、进行性核上性麻搏、皮质基底变性、嗜银颗粒病，皮克病W及其他疾病。tau蛋白病的共 同特征是tau蛋白的异常过度憐酸化W及tau蛋白积累，在脑中的神经元或胶质细胞之间形 成称为"神经原纤维缠结"（NFT)的抗去垢剂的细胞内内含物。异常过憐酸化的tau蛋白很容 易从微管上解离下来，并且聚集形成主要是沉积为细胞内NFT的低聚化U配对螺旋纤丝(Mi, K.等，Curr Alzheimer Res 2006;3:449-463)。低聚体的形成作为成核位置，使得其它过憐 酸化tauW及正常的非憐酸化tau形成纤维聚集物（Sorrentino等，Neurol Sci 2007; 28: 63-71)。因此，tau介导的神经退化的原理是基于一个"毒性功能获得"模型，其中异常憐酸 化的tau蛋白促进从微管上去除过憐酸化和正常的tau蛋白。运导致了微管不稳定性W及例 如轴突传送等微管介导过程的改变，运从而导致了脑中神经细胞和胶质细胞的功能受损和 成活力降低（Sorrentino等，2007,见上文）。
[0019] 美国专利申请公报第2007/0122504号(Moon等)公开了葡萄巧提取物的制造过程， W及采用运样的葡萄巧提取物来治疗包括AD等神经退行性疾病的方法。提取物的制备是通 过（1)在抑8-10的碱性溶液中提取葡萄巧，优选在20-50°C，W获得碱性可溶的物质；（2)用 酸性溶液中和，将P的周节到2-4,并且离屯、所得的溶液，获得沉淀层；（3)加入低碳醇并且获 得上清层，然后浓缩上清层;并且(4)加入非极性溶剂，且去除非极性溶剂可溶层，W获取纯 化的馈分，再进行重复纯化和冻干，W获得干燥的葡萄巧提取物（参见Moon,第[0030]-
[0035]段）。
[0020] 因为神经退行性疾病流行并且缺乏已证实有效的治疗与神经退行性疾病相关症 状的药物组合物和方法，还需要有改良的药物组合物和方法来治疗和预防神经退行性疾 病。
[0021] 发明简述
[0022] 本发明设及一种通过给予有需要的对象一种药物组合物来治疗对象的神经退行 性疾病的方法，其中药物组合物包含葡萄巧提取物或来源于葡萄巧提取物的一种或多种化 合物。在一些实施方式中，药物组合物还可包含选自下组的活性成分:抗氧化剂、乙酷胆碱 醋酶抑制剂W及上述物质的组合。在一个特定实施方式中，葡萄巧提取物中没食子酷原花 色素占原花色素的总重量的重量比低于约12%。
[0023] 本发明的方法用于治疗、改善、降低风险或预防神经退行性疾病，例如阿尔茨海默 病、帕金森病、亨廷顿病和/或tau蛋白病。本发明考虑的各种tau蛋白病包括阿尔茨海默病， 进行性核上性麻搏，皮质基底变性，嗜银颗粒病，皮克病W及家族性额颠痴呆症。
[0024] 在一个实施方式中，药物组合物是通过口服给药的。口服剂型包括粉末、片剂、胶 囊、口腔分散片、软胶囊、水性药物、糖浆、馳剂或药囊。在另一个实施方式中，药物组合物是 经皮给药的。在一个不同实施方式中，药物组合物是经鼻给药的。
[0025] 在特定实施方式中，对象为人类对象。给药频率为每月、每两周、每周或每天，并且 可W为单剂给药或分多剂给药。葡萄巧提取物的化合物的有效量为每天约100-1000毫克的 剂量，优选为每天约200-600毫克。
[0026] 附图简述
[0027] 图1A-1F.图1显示了葡萄巧提取物(GSE)产品McjgaNa山r[d:i;《-AZ (或MNG-AZ)的组 分分析结果。图1A显示了典型的异源多聚原花色素的分子结构。图1B呈现了 MNG-AZ的正相 HPLC分析。图1C显示了由表儿茶素没食子酸醋构成的同源四聚原花色素(左图）和所得的去 没食子酷原花色素加上一个独立的没食子酸结构(右图）。图1D显示了 MNG-AZ中没食子酷原 花色素（占总原花色素）的百分比，与四种其它市售G沈制剂相比：Μ巧aNa山抽篡-Goid、A品 牌GSE、B品牌GSE和C品牌GSE(图1DKA品牌为"Activin"，一种从圣华金河浓缩物公司（San Joaquin Valley Concentrates)获得的GSE;B品牌为''MasqucIL'成0PC'，来自法国的GSE; 并且C品牌为来自意大利英德纳公司（Indena S.P.A.，Italy)的GSE)。图1E和1F呈现了MNG- AZ和一些其他市售GSE中的没食子酷原花色素的水平。
[002引图2A-2D.图2呈现了在体外MNG-AZ GSE对于将A削太转化成它们的可溶低聚体形式 的影响。图2A和2B显示了 Αβι-42(2Α)和Αβι-40(2Β)与各种量的MNG-AZGSE的解育产物的十二烧 基横酸钢聚丙締酷胺凝胶电泳（SDS-PAGE)。图2C和2D显示了在有或无 MNG-AZ GSE时Αβι-42 (2C)和Αβι-40 (2D)的未修饰蛋白光致交联(PI CUP)反应后的SDS-PAGE结果。
[0029] 图3A-3D.图3显示了圆二色谱(CD)观测的MNG-AZ的A巧审制作用。图3A和3C分别显 示了未处理的Αβι-4〇和Αβι-42的CD谱；图3B和3D分别显示了MNG-AZ处理的Αβι-4〇和Αβι-42的CD 谱。光谱分别是在解育期开始时立即获得的…):，W及在2天后…'~);，3天后…、、),6天后 C---'····)和7天后{获得的。在每个时间点的光谱代表了在Ξ个独立实验中每一个获得的 光谱。
[0030] 图4A-4D.图4呈现了用化T结合测试测得的MNG-AZ的A巧Φ制作用。图4A和4C分别显 示了在不同浓度的对照化合物Medl下未处理的Αβι-4〇和A01-42的巧光光谱。图4B和4D分别显 示了MNG-AZ处理的Αβι-4〇和Αβι-42的巧光光谱。在图4A-4D中，Medl (或MNG-AZ)的浓度为0 (?)、5(·)或 25(^)μΜ。
[00川图5A-5F.图5显示了用电子显微镜测得的MNG-AZ的A巧审制作用。图5Α和5Β分别显 示了未处理的施-40和族-42的示例性形态。图5C和祀分别显示了在较低浓度(5μΜ)和较高浓 度(25μΜ)的MNG-AZ存在下Αβι-40的形态。图加和5F分别显示了在较低浓度(5μΜ)和较高浓度 (25μΜ)的MNG-AZ存在下Αβι-42的形态。
[0032] 图6A-6D.图6显示了ΜΤΤ代谢测得的MNG-AZ的A巧审制作用。图6Α(和6C)显示了低分 子量A0i-4q (和A01-42)的毒性和MNG-AZ对于降低运一毒性的效果。图她(和抓)显不了 Αβι-4〇聚 集(和Α&-42聚集)的毒性，W及MNG-AZ对于降低运一毒性的效果。
[0033] 图7A-7G.图7显示了MNG-AG G沈对于Tg2576小鼠的神经病理学作用。图7A-7B显示 了MNG-AZ GSE对体重(7A)或液体消耗(7B)的效果。图7C-7D显示了在Tg2576小鼠的脑中可 溶的胞外HMW-A朗太量的评估结果。图7E显示了在MNG-AZ GSE治疗小鼠和对照小鼠的脑中A 01-42和Αβι-4〇肤浓度的评估结果。图7F显示了在MNG-AZ GSE治疗小鼠和对照小鼠的脑中大 脑皮层和海马体形成Αβ-淀粉样蛋白斑块负担的体视学评估结果。图7G显示了在 MegaNatural?-(Md治疗小鼠和对照小鼠的脑中Αβι-4沸Αβι-4〇肤浓度的评估结果。
[0034] 图8A-8F.图8显示了阐明MNG-AZ GSE的有利作用的潜在机制的各种实验结果。图 8Α显示了用MNG-AZ治疗约5个月的Tg2576小鼠中总ΑΡΡ表达的蛋白免疫印迹分析。图8Β显示 了α-、β-和丫-分泌酶活力的评估结果。图8C显示了在用MNG-AZ GSE治疗的Tg2576小鼠与对 照组中可溶ΑΡΡα和APPe表达的蛋白免疫印迹分析。图8D和8E显示了在用MNG-AZ GSE治疗的 Tg2576小鼠相比对照小鼠的脑中A郎華解酶脑啡肤酶和膜岛素降解酶的表达。图8F显示了用 酶联免疫吸附测试化LISA)进行的血清施-40化图)和族-42化图)量的评估结果。
[0035] 图9A-9C.图9显示了用MNG-AZ GSE治疗的Tg2576小鼠中的认知功能退化减轻。图 9A和9B显示了莫里斯水迷宫(Morris water maze)测试测得的MNG-AZG沈对于Tg2576小鼠 中Αβ相关的空间记忆的效果。图9C呈现了 Tg2576小鼠的脑中可溶性胞外高分子量A朗太量的 评估结果。
[0036] 图10A-10B.图10A和10B显示了用莫里斯水迷宫测试测得的品系-、年龄-和性别- 匹配的野生型动物中MNG-AZ GSE治疗对于认知功能的影响。
[0037] 图11A-11B.图11显示了在缺乏MNG-AZ GSE存在的情况下tau肤聚集的动力学。图 11A显示了在不同浓度的MNG-AZ下聚集的tau蛋白的时间依赖的化S-巧光光谱；图11B显示 了在不同浓度的MNG-AZ下化U聚集物的最大累积。
[003引图12A-12B.图12显示了MNG-AZ GSE对于解离预先形成的tau肤聚集物的影响。图 12A显示了在不同浓度的MNG-AZ下聚集的tau蛋白的时间依赖的化S-巧光光谱；图12B显示 了化U聚集物的解离速度与MNG-AZ浓度的关系。
[0039] 图13A-13D.图13显示了MNG-AZ G沈在果蛹模型上的作用。图13A显示了在缺乏GSE 时果蛹眼发育的结果；图13B显示了在存在G沈时果蛹眼发育的结果；图13C显示了在一个代 表性实验中（在存在和缺乏GSE时）雄性果蛹眼睛的视觉评分；图13D显示了在与图13C相同 的测试中缺失眼睛的数量。
[0040] 图14.图14显示了在亨廷顿病的果蛹模型中存活百分比随天数的变化。空屯、圆代 表来自葡萄巧提取物治疗组的结果;而实屯、圆代表来自对照组的结果。
[0041 ] 图15A-15C.图15显示了MNG-AZ GSE对于Αβ低聚化的影响。图15A显示了对Αβι-4〇的 结果；图15显示了对Α&-42的结果；图15C显示了对于谷脫甘肤琉基转移酶的结果。第1道:分 子量标记物;第2道：只有蛋白，没有交联;第3道：只有蛋白；第4道:蛋白加 Medl (25μΜ);第5 道:蛋白加 Medl (250μΜ);第6道:蛋白加 MNG-AZ(25μΜ);第7道:蛋白加 MNG-AZ(250μΜ)。胶代 表Ξ次独立试验中每一次。
[0042] 图16.图16显示了采用PICUP测试得到的MNG-AZ GSE对于tau肤聚集的影响。胶显 示了在存在(第2、4、6、8道)或不存在(第1、3、5、7道)等摩尔（25μΜ)的G沈时25μΜ tau肤交联 的代表性分析。因为预期对于小肤的染色效果欠佳，在运个实验中单体tau肤是检测不到 的。~2.1和~3.化化条带分别对应于Ξ聚体和五聚体化U肤聚集物。CTR:未交联的tau肤； 第1-8道:tau肤和过硫酸锭W及lx(第1、2道）、2x(第3,4道）、3x(第5、6道)和4义(第7、8道)咖 (Bpy)o
[0043] 图17A和17B.图17显示了采用圆二色谱测得的MNG-AZ GSE对于化U肤聚集的影响。 图17A显示了在缺乏MNG-AZ时的tau肤聚集;而图17B显示了当MNG-AZ对tau肤的摩尔比为1: 1时的tau肤聚集。图17A和17B中标有注释d0、dl、d2和d3的曲线分别代表在解育过程(37°C) 中合成的tau肤在第0、1、2、3天获得的光谱。箭头指示有序的构象异构体的特征性光谱。
[0044] 图18A和18B.图18显示了用电子显微镜测得的MNG-AZ GSE对化U纤维形态的影响。 图18A显示了缺乏MNG-AZ时的化U纤维形态；图18B显示了在存在MNG-AZ时的tau纤维形态。 比例尺表示lOOnm。
[0045] 图19A-19D.图19显示了MNG-AZ GSE对于从AD脑标本中分离的天然成对螺旋纤维 (PHF)的超微结构特征的影响。图19A显示了在没有MNG-AZ GSE时纯化的PHF的电子微观图； 图19B和19C显示了在存在100μΜ MNG-AZ GSE5秒（图19B)或1小时（图19C)时纯化的PHF的电 子微观图。在图19A和19C中，电子致密颗粒代表pSer214tau标记(C中的箭头）。图19D显示了 GSE处理对PHF的定量分析与处理时间（5到60分钟）的关系，其中柱状图表示带有标准差的 平均最大宽度;测得的PHF数量在括号内呈现。统计学分析用单因素方差分析(P<0.0001)， 接着用邦弗朗尼多重比较试验，与未处理PHF (0-时间）比较，**p<0.001。
[0046] 图20A-20D.图20显示了MNG-AZ GSE对PHF的膜酶消化的影响。图20A显示了从没有 与膜酶解育的AD脑中分离的天然PHF的电子微观图；图20B显示了没有与膜酶解育的预先用 MNG-AZ(100μΜ，1小时）处理的PHF的电子微观图；图20C显示与膜酶（1 μg/ml，10分钟)解育的 天然PHF的电子微观图；图20D显示了与膜酶（lμg/ml，10分钟）解育的预先用MNG-AZ(100μΜ， 1小时)处理的PHF的电子微观图。
[0047] 图21A-21G.图21显示了丽G-AZ GSE对于tau突变的果蛹模型的异常眼表型的影 响。图21A和21D显示了野生型果蛹中的代表性眼表型；图21B和2化显示了在没有G沈处理时 R406W突变tau的果蛹的眼，图21C和21F显示了用MNG-AZ处理的R406W突变tau的果蛹的眼； 图21G显示了成年眼形态的定量分析，在Ξ个独立测试中在雄性和雌性果蛹中采用4分制评 分系统（其中0 =无眼且4 =正常眼）。标出了每个测试中评分的果蛹的数量。柱状图代表平 均值+沈M。
[004引图22A-22D.图22显示了采用后腿伸展测试对tau蛋白病的转基因 JNPL3小鼠模型 的评估方案。采用4分制评分系统评估当小鼠被拉着尾己倒挂起来时横向伸展后腿的天然 倾向：4 =天然功能（图22A)，3 =轻微障碍（图22B)，2=中度障碍（图22C)，和1 =严重障碍 (图 22D)。
[0049]图23A和23B.图23显示了G沈治疗在tau蛋白病的转基因 JNPL3小鼠模型上的作用。 图23A分别显示了与没有用GSE治疗的小鼠相比，用G沈治疗的5月龄和13月龄的JNPL3小鼠 的运动障碍。图23B显示了用和不用GSE治疗的JNPL3小鼠之间死亡率的比较，其中线形图表 示了存活百分比随时间的变化。
[0化0] 图24A和24B.图24显示了采用巧光显微镜观察到的MNG-AZ GSE对于减少htt蛋白 聚集物的影响。图24A显示了用赋形剂处理的对照细胞(Chi)和用12.5μΜ和25μΜ GSE处理 的细胞在用米乐酱酬A诱导后的图片。图24Β显示了在缺乏(Ctrl)或存在12.5μΜ和25μΜ GSE 处理的情况下，GFP-Htt融合蛋白聚集形成高分子量聚集物的蛋白免疫印迹分析(左图：用 抗-GFP抗体做探针的蛋白免疫印迹来识别GFP-Htt融合蛋白聚集形成较高分子量的物质； 右图：显示GFP-化t蛋白和较高分子量的htt聚集物的分布的蛋白免疫印迹的光密度分析）。 [0051 ] 图25A和25B.图25显示了用攀登测试评估GSE治疗对于果蛹皿模型中运动机能障 碍的影响。图25A和25B分别显示了第9天和第16天的攀登测试结果。每个测试日进行3次独 立的攀登试验。柱状图代表了成功完成攀登任务的果蛹的百分比的平均值+SEM。统计学测 试采用学生t检验，**G沈-治疗组与未治疗组相比於0.001。
[0052] 图26显示了果蛹皿模型中存活百分比随时间的变化。实屯、的倒Ξ角代表了来自用 MNG-AZ GSE治疗组的结果，并且实屯、的菱形代表了来自对照组的结果。数据代表了来自4个 独立测试的结果。
[0053] 图27.图27显示了G沈治疗对于皿小鼠模型中运动机能障碍的影响，用旋转杆测试 在不同周龄进行评估。数据代表了从3个独立测试获得的结果。
[0054] 图28.图28显示了GSE治疗对于皿小鼠模型的死亡率的影响。线形图代表了存活百 分比随时间的变化。
[0化5] 发明详述
[0056] 本发明提供了一种用于减少Αβ、低聚Ai3、tau蛋白或与神经退行性疾病相关的其他 蛋白的错误折叠、积累、聚集或沉积的方法。方法设及给予有效量的含有葡萄巧提取物或来 源于葡萄巧提取物的一种或多种化合物的药物组合物。本发明的运些和其他方面在下文提 供的介绍和实施例中详细描述。
[0057] 本发明基于一个发现，即来自葡萄巧提取物的化合物作为针对Ai3、tau蛋白或与神 经退行性疾病相关的其他蛋白的错误折叠、积累、聚集或沉积的有效抑制剂发挥作用。特定 地，本发明部分基于一项发现，即特定类型的葡萄巧提取物（1)在体外减少或抑制合成的A βι-4〇(ΑΜΟ)和Αβι-42(ΑΜ2)形成低聚体；（2)减少或抑制Tg2576小鼠（表达突变的淀粉样蛋白 前体蛋白并且表现出AD型认知功能退化的转基因小鼠）脑中低聚Αβ的量，并且(与未处理小 鼠相比）Tg2576小鼠的认知功能丧失略有改善或减缓；（3)在体外抑制成核现象的发生，该 成核现象使得tau聚集物形成在各种tau蛋白病中发现的配对螺旋纤丝的特征性结构，并且 降低tau聚集物的稳定性；（4)在体内，减轻化U蛋白在转基因 R406W果蛹表型中的有害作用， W及减轻tau蛋白在转基因 JNPL3小鼠模型中的有害作用；（5)在体外抑制带有多聚谷氨酷 胺的htt蛋白物质的聚集；（6)在体内，减轻突变的htt蛋白在转基因 elav〉Q93httexonl果蛹 表型中的有害作用，W及减轻突变的htt蛋白在转基因 R6/2小鼠模型中的有害作用。运些 发现表明，葡萄巧提取物或来源于葡萄巧提取物的化合物可用于减轻淀粉样蛋白、htt和 化U-相关的神经病理学。
[0058] 因此，本发明提供了包含葡萄巧提取物或来源于葡萄巧提取物的一种或多种化合 物的药物组合物，W及使用运样的药物组合物来治疗或预防神经退行性疾病的神经病理学 特征的方法，所述神经病理学特征例如神经退化、细胞毒性、认知功能障碍或退化、运动机 能退化。优选地，葡萄巧提取物的特征在于，其中没食子酷原花色素占原花色素的总重量的 重量比低于约12%。
[0059] 在本发明的内容中W及在每个术语使用的特定上下文中，本说明书所用术语一般 具有它们在本领域的普通含义。某些术语在下文中定义，W提供描述本发明的组合物和方 法的附加说明。
[0060] 定义
[0061] 术语"痴呆症"指与记忆和其他认知领域的整体认知能力下降相关的临床综合征。
[0062] 术语"退行性疾病"指与传染病相反，一种受影响的组织或器官的功能或结构随着 时间逐步退化的疾病。
[0063] 术语"神经退行性疾病"指一种由于细胞死亡导致神经细胞丢失的疾病或病症。
[0064] 术语"阿尔茨海默病"（或"老年性痴呆"）指与特定退行性脑病相关的智力退化，其 特征在于老年斑、神经炎性缠结和进行性神经元丢失。
[0065] 术语"帕金森病"是一种中央神经系统的慢性和进行性退化病症，通常运动机能和 语言出现障碍。帕金森病属于一种称为运动障碍的疾病类型，其特征在于肌肉强直、颤抖、 身体运动迟缓，W及在极端情况下，身体不能运动。
[0066] 术语"亨廷顿病"指一种由于编码亨廷顿蛋白的Ξ核巧酸重复延伸导致的遗传性 神经疾病。亨廷顿病的症状包括身体运动异常和缺乏协调能力。
[0067] 术语"tau蛋白病"指设及tau蛋白（一个密切相关的细胞内微管相关蛋白家族)功 能异常的一类神经退行性疾病。运些神经退行性疾病（tau蛋白病)包括，例如阿尔茨海默 病，进行性核上性麻搏，皮质基底变性，嗜银颗粒病，皮克病W及家族性额颠痴呆症。
[0068] 术语"β淀粉样蛋白"（Αβ)指由于β淀粉样蛋白前体蛋白（APP)切割产生的一种肤， 它的积累和沉积在对象的脑中形成斑块。Αβ最常见的异构体为Αβι-4〇( ΑΜ0)和Α&-42 (ΑΜ2)。 短语"Αβ的低聚体"指一种由化学键连接的带有一个W上Αβ单位的肤，或是由化学键和/或 由物理作用力相连的大量的A朗太。术语"低聚化"指多个例如Αβ等较小化学或生物分子通过 化学键和/或物理结合而结合或组装成为
[0069] 术语"减少"指减少或降低化学或生物物质的量或浓度，或是减缓或逆转正在进行 的化学或物理过程。
[0070] 术语"积累"指在特定的区域或空间内例如肤等化学或生物物质的浓度或量上升。
[0071] 术语"聚集"指多个较小化学或生物分子或其集合通过化学键和/或物理结合而结 合或组装成一个较大的集合。
[0072] 术语"沉积"指化学或生物物质粘附到生物表面，例如细胞膜或血管壁。
[0073] 术语"多酪"或"多酪化合物"指一种特征在于每个分子存在一个W上酪基团的化 合物。
[0074] 术语"治疗有效剂量"或"治疗有效量"，或"有效量"指葡萄巧提取物或葡萄巧提取 物中含有的化合物的量足W导致治疗应答。治疗应答可为用户（如临床医生)会将其识别为 对治疗的有效应答的任何应答，例如通过评估症状和替代临床标记物。因此，治疗应答通常 为疾病或病症的一种或多种症状的改善。
[0075] 短语"药学可接受的"指生理可耐受的并且当给予人时通常不产生不良反应的分 子实体和组合物。优选地，如本发明所用，术语"药学可接受的"指由联邦或州政府的监管机 构批准的、或是美国药典或其他普遍认同的药典中列出的、可用于动物，并更为特定的可用 于人。
[0076] 短语"药学可接收的盐"指通过制成其酸性或碱性盐修饰的化合物衍生物。药学上 可接受的盐包括例如胺等碱性残基的矿物盐或有机酸盐;和例如簇酸等酸性残基的碱性或 有机盐。药学可接受的盐包括亲本化合物形成的传统无毒性盐或季锭盐，例如从无毒性的 无机酸或有机酸。运种传统的无毒性盐包括来源于无机酸的盐，例如盐酸，氨漠酸，硫酸，氨 基横酸，憐酸，硝酸等；W及由有机酸制备的盐，例如醋酸，丙酸，班巧酸，甘醇酸，硬脂酸，乳 酸，苹果酸，酒石酸，削i酸，抗坏血酸，栋桐酸，马来酸，径基马来酸，苯乙酸，谷氨酸，苯甲 酸，水杨酸，对氨基苯横酸，2-乙酷氧基苯甲酸，富马酸，对甲基苯横酸，甲横酸，乙烧二横 酸，草酸，和径乙基横酸等。药学可接受的盐可W通过传统化学方法从包含碱性或酸性基团 的亲本化合物合成。通常，运样的盐是通过运些化合物的游离酸或碱形式与化学当量的合 适的碱或酸在水或有机溶剂或在两者的混合物中反应来制备的。
[0077] 术语"运载体"或"药学运载体"指与化合物一起给予的稀释剂、佐剂、赋形剂或载 体。运样的药学运载体可为无菌液体，例如水和油。优选采用水或水性溶液、盐溶液W及水 性右旋糖和甘油溶液作为运载体。合适的药学运载体在E.W.Madin的《雷明顿药典》第18版 ("Remington's 陆armaceutical Sciences"by E.W.Ma;rtin，18thEdition)或其他版本中有 描述。
[0078] 术语"抗氧化剂"指一系列能够抑制或中和对象体内有害自由基的化学物质。
[0079] 术语"对象"包括会发生β淀粉样蛋白、β淀粉样蛋白低聚体、tau蛋白或其他蛋白的 错误折叠、积累、聚集或沉积的生物活体。术语"哺乳动物"指通过乳腺分泌的乳汁来哺育幼 体的高等脊椎动物的哺乳动物纲的生物体。术语"人"指智人化omo Sapiens)种的成员。术 语"患者"指接受本发明提供的组合物治疗的人对象。
[0080] 术语"治疗"指给予对象本发明的组合物，用于减轻、减缓进程、延迟或逆转病情， 和/或与神经退行性疾病相关的一种或多种症状，和/或蛋白的错误折叠、积累、聚集或沉 积，所述蛋白包括但不限于β淀粉样蛋白、β淀粉样蛋白低聚体、tau蛋白、α-突触核蛋白等。
[0081] 术语"预防"指在与的定粉样蛋白、的定粉样蛋白低聚体、tau蛋白或其他蛋白的错误 折叠、积累、聚集或沉积相关的疾病或症状发生前，给予对象本发明的组合物，W避免疾病 或症状的发生。
[0082] 术语"降低对象中疾病或症状发生的风险"指对象发生疾病或症状的可能性低于 同等对照个体的可能性，例如对象给予了本发明的药物组合物并且对照没有治疗或接受了 安慰剂。
[0083] 术语"约"或"大约"指相对于本领域的普通技术人员确定的特定值在一个可接受 的误差范围内，其部分取决于该值是如何检测或确定的，即检测系统的局限性。例如，"约" 可表示在本领域的每个测试中在3个或大于3个标准差范围内。任选地，"约"可表示在给定 值的20%范围内，优选在10%范围内，更优选在5%范围内，或更优选在1 %范围内。任选 地，尤其是对于生物系统或过程，术语可表示在数值的一个数量级内，优选在5倍内，且更优 选在2倍内。
[0084] 药物组合物
[0085] 葡萄巧提取物
[0086] 本发明的一个方面设及使用来源于葡萄巧提取物的药物组合物来治疗或预防与 蛋白的错误折叠、积累、聚集和/或沉积相关的神经退行性疾病。如本发明所用，术语"葡萄 巧提取物(GSE)"指从葡萄巧、皮或果渣提取的物质或一种或多种化合物。
[0087] 葡萄巧提取物可W从各种来源获得。例如，普利芬尼公司(Polyphenolics，美国星 座酒业有限公司(Constellation Wines U.S.，Inc)的一个分支）W商标MegaNatura憾销售 一系列的葡萄巧提取物产品。商品化的紐ega触tural?产品的例子包括Mega]舶tural愈G SKE 葡萄果渣提取物，MegaNatura赔-班和MegaNataral?-谷old。葡萄巧提取物也可W根据一些 特殊的提取和/或纯化过程来制备。例如，葡萄巧提取物可W采用如美国专利第6,544,581 号（Shri化ande等，'581专利）或美国专利申请公报2007/0071871(S虹化hande等）中描述的 方法来获得，其内容在此整体引用作为参考。
[008引 Meg抑atoa換-AZ (或MNG-AZ)是实验性的且市场上没有销售，因为从多酪组分上 去除了没食子酷基团，其具有可通过肠道黏膜被吸收的独特性质。在MNG-AZ的制造过程中， 粗多酪提取物与酵母发酵物混合培养一段时间，使得没食子酸从没食子酷单体和原花色素 低聚体上水解下来。提取物进一步处理成含有超过90%重量的多酪和超过3%重量的没食 子酸的粉末形式(参见'581专利）。选择酵母培养物的单宁酶活力，使得没食子酸从葡萄巧 单体和聚合物上释放出来。任选地，粗单宁酶可W通过酵母和霉菌的发酵过程来制备，并且 可W加入到粗葡萄巧提取物中使没食子酸释放出来。所得的MNG-AZ的特征在于没食子酷原 花色素占原花色素的总重量的重量比低于约12%。虽然没有联系到任何特定的理论，但相 信去除没食子酸侧基团能显著提高MNG-AZ的生物利用度。
[0089] 多酪，葡萄巧提取物中的一类重要的化合物，被认为是有效的抗氧化剂。原花色 素，一种多酪亚类，是来源于儿茶素和表儿茶素基础单元及其各自的衍生物的多聚化合物 (如表儿茶素被修饰加上了没食子酸的表儿茶素没食子酸醋）。葡萄巧提取物MNG-AZ的组分 分析结果显示在图1中。典型的异源多聚原花色素的分子结构包含儿茶素、表儿茶素、表没 食子儿茶素及其衍生物(表没食子儿茶素和表儿茶素没食子酸醋）（图1AKMNG-AZ的正相 HPLC分析也表明存在单体和多聚单元的原花色素（图1B)。
[0090] 含有表儿茶素没食子酸醋的原花色素可W通过微生物或酶转化来进行去没食子 酷化（图1C)。去除没食子酸侧链是MNG-AZ与其它市售葡萄巧提取物质间的主要区别。与四 种其它市售GSE制剂相比，如MNG-AZ中没食子酷原花色素（占总原花色素）的百分比所示， MNG-AZ包含极少或没有没食子酸侧链（图化和1F)。在本发明中，MNG-AZ在动物疾病模型的 与Αβ和tau蛋白相关的神经退行性疾病中表现出惊人的体内生物活性。
[0091] 在本发明的一个特定实施方式中，药物组合物包含特定的葡萄巧提取物，称为 Μ巧aNalural:i;(-AZ.本发明的药物组合物也可包含来源于葡萄巧提取物的一种或多种化合 物。一种或多种化合物可包括但不限于，一种或多种多酪，一种或多种原花色素，或其混合 物。示例性的多酪包括但不限于单体儿茶素和表儿茶素基本单元。
[0092] 在其他实施方式中，本发明的组合物还包含运载体。优选所述运载体用作相对于 使用和应用方法而言合适的物质。例如，对于口服给药，本发明的合适药物运载体包括但不 限于，乳糖，右旋糖，薦糖，山梨醇，甘露醇，淀粉，阿拉伯胶，木糖醇，赤薛醇，藻酸盐，明胶， 憐酸巧，娃酸巧，纤维素，甲基纤维素，聚乙締化咯烧酬，水，径苯甲醋，径苯丙醋，硬脂酸儀 和矿物油。组合物还可包含填充剂，抗粘着剂，润滑剂，润湿剂，调味剂，乳化剂，防腐剂等 等。
[0093] 本发明的药物组合可配制成口服剂型，包括但不限于，粉末，片剂，胶囊，口腔分散 片，软胶囊，水性药物，糖浆，馳剂和药囊。
[0094] 任选地，药物组合物可W经皮给药。本发明的组合物可W直接施用到皮肤或是通 过透皮装置间接给药。本发明的组合物可W配制成直接透皮剂型，例如凝胶、乳霜、洗剂、乳 剂、油、药膏、分散剂、气雾剂，喷雾剂等等。本发明的组合物可W配制成间接透皮剂型，作为 包括胶布、細带、胶带、或其它封闭敷料等透皮装置的组分。另外，药物组合物可W经鼻给 药，例如作为经鼻喷雾剂。用于通过皮肤或粘膜表面吸附的其他被动或主动透皮装置也包 括在内。
[00%]用于本发明组合物透皮给药的合适的药物运载体可为适合于透皮给药的任何药 学可接受的运载体材料。运样的运载体包括本领域已知的材料，例如液体、凝胶溶剂、液体 稀释剂、增溶剂等等。合适的运载体是无毒的并且不与组合物的其他组分发生有害的相互 作用。用于本发明的合适运载体的例子包括水、硅胶、液体糖、蜡、凡±林油。运载体还可包 括稳定剂、佐剂、增渗剂或用于促进药物透皮递送的其他类型的添加剂。
[0096] 在一些实施方式中，当应用时，本发明的化合物可W它们药学可接受的盐的形式 使用，而且也可W单独使用或是与合适的其他药物活性化合物联合或组合使用。在特定实 施方式中，本发明的组合物还可包含抗氧化剂和/或胆碱醋酶抑制剂。
[0097] 治疗方法
[0098] 本发明的药物组合物可W给予具有神经退行性疾病相关的风险因素或病症的对 象。对象可为人，或低等哺乳动物，包括但不限于，猫、狗、大鼠、小鼠、绵羊、山羊、牛、猴、黑 猩猩，及其转基因种类。药物组合物W治疗有效量给予对象，在运样的量和运样的时间是达 到预期效果所必需的。本发明包括的神经退行性疾病通常特征在于对象的脑中一种或多种 蛋白或肤的水平升高，包括它们的错误折叠、积累、聚集和/或沉积。运些疾病，包括但不限 于，阿尔茨海默病，帕金森病，肌萎缩性脊髓侧索硬化症，亨廷顿病，额颠痴呆症，皮质基底 豆状核退化症和/或tau蛋白病。tau蛋白病可为阿尔茨海默病，进行性核上性麻搏，皮质基 底变性，嗜银颗粒病，皮克病W及家族性额颠痴呆症等等。
[0099] 如本发明所用，本发明的治疗方法中攻击的一种或多种蛋白（或者可与1太"互换 使用）指由肤键连接的多个氨基酸单元构成的分子，其中分子与所述一种或多种神经退行 性疾病相关。蛋白包括野生型、突变的、转基因的和合成的蛋白。例如，它们可包括但不限 于，与特定的神经退行性疾病相关的特定蛋白。例如β淀粉样蛋白（如A01-4O，A01-42 )和/或神 经原纤维缠结是阿尔茨海默病患者中的祀蛋白。另外，突变的htt蛋白是亨廷顿病患者中的 革己蛋白。α-突触核蛋白是帕金森病患者中的祀蛋白，且tau蛋白是tau蛋白病患者中的祀标。
[0100] 此外，根据本发明进行治疗的方法包括治疗对象，所述对象中正在发生与蛋白水 平升高或错误折叠相关的疾病，但是对象还没有表现出有害症状。另外，本发明的治疗方法 包括治疗已有疾病的症状，其中对象表现出外部症状。
[0101] 本发明的组合物的剂量可W根据对象的体重和病情、组合物的剂型、给药的方式 和时间而变化，并且可由本领域的技术人员来确定。可W根据在脑的特定区域中最大程度 降低不需要的或错误折叠的蛋白浓度所需要的量，来确定化合物的最佳剂量。例如，剂量范 围可为每天约100-1000毫克。优选地，剂量范围为每天约200-600毫克。组合物可W每月、每 两周、每周、每天或每天几次W单剂量或分多个剂量给药。 实施例
[0102] 下列实施例只用于说明本发明，而不应理解为W任何形式限制本发明的范围。
[0103] 实施例1.葡萄巧提取物对于合成的Αβ的低聚体形成的影响的体外证据
[0104] 本实施例提供了如本发明的一种实施方式所述的组合物对于减少Αβ低聚化的影 响的体外证据。
[0105] 材料与方法
[0106] 体外Αβι-4〇和Αβι-42聚集测试。葡萄巧提取物产品MegaNatural?-AZ从公司费罗利 公司（马德拉，加利福尼亚州（Phenolics，（Madera，CA))获得。体外A01-4日和A01-42聚集测试的 Αβι-4日和Αβι-42肤是从美国肤公司（森尼韦尔，加利福尼亚州）（American Peptide (Sunnyvale，CA))购得的。肤溶解在HFIP(西格玛公司，Sigma)中，室溫干燥过夜，并且真空 抽吸10分钟。肤在去离子水中溶解成Img/ml，并且将MNG-AZ GSE原料在水中溶解成400μΜ。 将Αβι-40和Αβι-42 (100μg/ml)与不同浓度的MNG-AZ GSE按照体积比1:1混合并且在37 °C解育3 天。采用6E10抗体的蛋白免疫印迹分析来研究MNG-AZ对Αβ聚集的影响。
[0107] 未修饰蛋白的光致交联(PICUP)测试。在存在或不存在50μΜ MNG-AZ GSE的lOmM憐 酸盐溶液(pH 7.4)下，新鲜分离的低分子量(LMW)Αβι-42或Αβι-4〇肤与1 μ1的1 (X1)、2(x2)、5 (x5)或 10(xl0)mMS(2,2'-联化晚基）二氯化钉（II)(Ru(bpy))和 1山的 20(xl)、40(x2)、100 (x5)或200(Χ?ο)mM过硫酸锭(APS)混合。混合物照射1秒钟，然后立即用10山含有5%β-琉基 乙醇的化icine样品缓冲液（英杰公司，加利福尼亚州（1]1￥；[付0旨日]1，〔4))泽灭。然后反应物 进行SDS-PAGE电泳，并且用银染显色（加利福尼亚州英杰公司的SilverXpress (Invitrogen，CA))。在相似的条件下交联谷脫甘肤琉基转移酶，并且用作对照肤。
[0刪结果与讨论
[0109] 图2中显示了MNG-AZ抑制Αβ低聚化的作用。MNG-AZW浓度依赖的形式抑制合成的A βι-42 (2A)和 Αβι-4〇 (2B)的低聚化，如在SDS-PAGE (图 2A 和 2B中的第1-6 道:0、0.2、1、5、25和100 μΜ Αβ; CTR是没有解育的样品）中所示。在PICUP反应处理后的Αβι-42 (图2C)和Αβι-4〇(图2D)的 SDS-PAGE结果中观察到相似的结果（图2C和2D中的第1和2道:分别为存在和不存在MNG-AZ 时Αβ肤与lx Ru(Bpy)和APS的结果;第3和4道:分别为存在和不存在MNG-AZ时Αβ肤与2x Ru (^y)和APS的结果;CTR:未交联的Αβι-42 (2C)或Αβι-4〇 (2D)用作单体对照。
[0110] 上述结果一致表明MNG-ZA能够在体外有效地抑制Αβ的低聚化。此夕hMNG-AZ的抑 制效果表现为浓度或剂量依赖的。运些结果表明MNG-AZ GSE能预防或治疗与Αβ的积累、聚 集或沉积相关的疾病。
[0111] 实施例2.评估TG2576小鼠的AD型神经病理学
[0112] 本实施例显示了给予如本发明的一个实施方式所述的组合物对于转基因小鼠的A 0神经病理学的体内效果。
[0…]材料与方法
[0114] Tg2576小鼠和MNG-AZ GSE治疗。成年雌性Tg2576小鼠（泰克尼有限公司，日耳曼城 (Taconic，Germantown Inc.))分成2个不同的组:MNG-AZ GSE治疗组和水对照组。MNG-AZ GSE在它们的饮水中W浓度1.2g/L递送，使得最终摄入量为200毫克/公斤/天。运等于采用 FDA的药物等价剂量跨物种转换标准得到的人1克/天的剂量，根据体表面积(人等价剂量 (毫克/公斤）=动物剂量（毫克/公斤^(动物体重（公斤）/人体重（公斤）*^'33)化**9:// www.fda.gov/cber/gdlns/dose.htm)。动物可W自由饮水和食用标准饲料。饮用溶液每3天 更换一次。在研究过程中每周监测液体消耗和动物体重。在治疗5个月后，小鼠采用全身麻 醉的氯胺酬和甲苯嚷嗦（富道动物保健公司，道奇堡，爱荷华州（Fort Dodge Animal 化alth，Fort Dodge，Iowa))进行麻醉并且断颈处死。收取脑部并且对切。一个半球在4%多 聚甲醒中固定24小时用于形态学研究。从对应的半球上切下海马体和新皮层，快速冷冻， 在液氮中研磨并且存储在-80°C用于生化研究。
[0115] AD-型淀粉样蛋白神经病理学的评估。为了对脑中的A朗太进行定量评估，冷冻研磨 的组织在5mol/L脈缓冲液中匀浆，并且1:10稀释在含有0.05% (体积/体积）Tween愈-20和 Immol/L Pefabloc蛋白酶抑制剂（罗氏应用科学，印第安纳波利斯，印第安纳州（Roche Applied Science，Indianapolis，IN))的憐酸盐缓冲液中，在4°C离屯、20分钟。总A01-4日或A βι-42用夹屯屯LISA(BioSource，Camarillo，CA)进行定量。为了对Tg2576小鼠中的AD型淀粉 样蛋白负担进行体视学评估，新鲜收取的脑半球浸没在4%多聚甲醒中固定过夜，并且沿冠 状面用切片机切成名义厚度50皿的切片。从随机起始位置选择每第15个切片，并且用硫横 素 S染色。所有的体视学分析采用蔡司Axiphot显微照相机进行，该显微照相机配有蔡司运 动平台和MSP65平台控制器，高分辨率的蔡司ZVS-47E数码照相机和一个运行定制软件 NeuroZoom的Macintosh G3电脑。淀粉样蛋白负担的评估采用卡瓦列利原则用小尺寸的网 格(50X50皿)进行点计数;运种方法提供了对于淀粉样蛋白斑块所占的部分体积无偏差的 评估-用新皮层或海马体体积的百分比表示。斑块体积的评估采用x40放大倍数下的系统随 机抽样方法获得。
[0116] 脑中可溶Αβ低聚体分析。可溶Αβ低聚体的水平采用斑点杂交测试和蛋白免疫印迹 分析来测量。具体地说，通过将研磨成粉的皮层组织溶解在加有蛋白酶抑制剂混合物(罗氏 应用科学，印第安纳波利斯，印第安纳州(Roche Applied Science，Indianapolis, IN))的 PBS中，提取可溶淀粉样蛋白肤。在4°C 78，500g离屯、1小时后，分析上清。5yg总蛋白点在硝 酸纤维素膜上，用10 %脱脂牛奶封闭，并且与抗体All (英杰公司，加利福尼亚州 (Invitrogen，CA))解育，该抗体特异性的识别Αβ的低聚形式。在室溫下解育2小时后，膜与 HRP偶联的羊抗兔抗体一起解育，免疫反应信号用增强化学发光检测(强信号化学发光检测 试剂盒，皮尔斯公司，罗克福德，伊利诺斯州（SuperSi即al Qiemiluminescent Detection Kit，Pierce，Rockford，IL))来显色，并且通过光密度定量（如antity One，伯乐公司（Bio- Rad)) 。相同 的样品也用于蛋白免疫印迹分析。75yg 总蛋 白用 10-20 %T;ris-T;ricine 凝胶分 离，并且转到硝酸纤维素膜上，用10 %脱脂奶粉封闭1小时。膜与6E10 (西格纳公司 (Signet))或All解育。免疫反应信号用增强化学发光检测来显色，并且通过光密度定量。
[0117] APP加工和α-、β-、丫 -分泌酶活力。用C8抗体(针对人APP胞内结构域的AA676-696 产生）的蛋白免疫印迹分析来检测全-ΑΡΡ的表达。如前所述(Wang等，FASEB J 2005; 19: 659-661)，进行免疫沉淀来检测34??-〇、34??-0。〇-、0-和丫-分泌酶活力采用市售试剂盒 (安迪生物公司（R&D Systems))进行评估。脑啡肤酶和膜岛素降解酶的表达采用市售抗体 用蛋白免疫印迹测试进行分析。
[0118] 统计学分析。运些实施例中的所有数据和值用平均值和平均值的标准差（SEM)表 示。采用双因素重复测量的方差分析或学生双尾t检验来分析平均值之间的差异。在所有分 析中，零假设为在0.05水平被弃去。采用Prism Stat程序(Gra地化d软件有限公司，圣地亚 哥，加州（Gra地Pad Software，Inc.，San Diego CA))进行所有的统计学分析。
[0119] 结果与讨论
[0120] 图7中显示了MNG-AZ GSE对于Tg2576小鼠的神经病理学作用。图7A和7B显示了在 治疗5个月的Tg2576小鼠中MNG-AZ GSE对于体重(7A)和液体消耗(7B)的影响。图7C呈现了 采用特异性针对HMW低聚Αβ肤的抗体在斑点杂交分析中对可溶性胞外HMW-Αβ肤含量的评 估。图7D描述了 Tg2576小鼠脑中可溶性胞外HMW低聚A削太(抗体Α11)和单体A削太(抗体6Ε10) 的蛋白免疫印迹分析。图7E显示了对于MNG-AZ GSE治疗和对照小鼠脑中的Αβι-42和Αβι-4〇肤 浓度评估。图7F显示了在MNG-AZ GSE治疗和对照小鼠中的大脑皮层和海马体形成Αβ-淀粉 样蛋白斑块负担的体视学评估，用硫横素 S阳性体积占区域体积的百分比来表示。图7F显示 了在未治疗对照（上图）和MNG-AZ治疗Tg2576小鼠（下图）的新皮层（CTX)和海马体结构 化ippo)中硫横素 S阳性Αβ淀粉样蛋白斑块神经病理学的代表性照片。值用组平均值±561 表示，η =每组5-6个小鼠。学生双尾t检验分析的*ρ<0.05，**ρ<0.01。图7G显示了研究 Μ確aNatuml⑥-CMd的体内功效的平行研究中评估脑中的Αβι-4沸Αβι-4〇肤浓度。
[0121] 运些结果表明MNG-AZ GSE不会导致可检测到的副作用，包括体重（图7Α)或水消耗 (图7Β)的变化。在治疗5个月后的Tg2576小鼠的神经病理学显示内源Αβ肤转化成HMW Αβ的 低聚化降低约2-3倍，如采用特异性针对Αβ低聚体的抗体的免疫斑点杂交测试(ρ<0.05,图 7C)和采用All-抗体的蛋白免疫印迹(ρ<0.01，图7D)来评估所示。发现Tg2576小鼠脑中HMW All-免疫反应的低聚Αβ物质的减少，与单体Αβ肤的相应升高(p<0.05,图7D)相一致，表明 MNG-AZ GSE通过预防Αβ低聚化对AD产生有益影响。
[0122] 图7G显示了在平行研究中，用另一种叫做MegaNat耻a條-Gold的市售GSE制剂对 Tg2576小鼠进行治疗，与对照Tg2576小鼠相比，没有调控Tg2576小鼠海马结构内Αβι-42和A βι-4〇肤的积累。图7G中的结果表明，MNG-AZ在现有的GSE制剂中唯一具有调控脑中淀粉样蛋 白型神经退化的功效，因为它的没食子酷原花色素含量大大降低。
[0123] 最近的研究表明，预防脑中Αβ低聚化形成HMW物质可使得脑中总Αβ肤W及最终淀 粉样蛋白神经炎性斑块补偿性降低，可能是相对于低聚Αβ物质优先从脑中清除单体A朗太的 结果(Morelli等，Biochem 2005:38:129-145)。与运一假设相一致，本实施例的结果表明， 与年龄和性别匹配的水治疗对照小鼠相比，除了降低HMW低聚Αβ物质的水平（图7C，7D)，长 期MNG-AZ GSE治疗也会显著降低A&- 42(图7E，左图）和Αβι-4日肤（图7E，右图）W及淀粉样蛋 白神经斑块负担（图7巧的量。
[0124] 此外，评估了MNG-AZ GSE对于淀粉样蛋白神经病理学的有益效果的可选潜在机 审IJ。发现全-APP的量没有发生可检测的变化（图8A)，且α-、β-和丫-分泌酶的酶活力或可溶 性ΑΡ阳和可溶性ΑΡΡβ量也没有任何变化（图8Β、8C)。而且，观测到脑啡肤酶（图8D)或膜岛素 降解酶（图8Ε)的量没有可检测的变化，运是负责A郎華解的主要蛋白水解酶。最后，发现在外 周血清中Αβι-42和Αβι-4〇肤的水平没有可检侧的变化(图8F)。
[0125] 运些观察表明，如体外所发现的，MNG-AZ GSE在体内主要通过预防Αβ低聚化形成 可溶的HMW物质来发挥有益作用的。
[01%] 实施例3 Tg2576小鼠中AD型认知功能评估
[0127]该实施例显示了给予如本发明的一些实施方式所述的组合物对于Tg2576转基因 小鼠的认知功能的影响。
[012引材料和方法
[0129] Tg2576小鼠用MNG-AZ GSE治疗5个月，并且在11月龄进行认知功能评估。如前所述 (MorrisJ Neurosci Methods 1984; 11:47-60),用莫里斯水迷宫行为测试来评估空间学 习记忆。空间记忆是通过记录动物从水中逃到浸没的逃生平台的等待时间与学习期内学习 尝试的关系来评估的。在学习期24小时后，通过移走逃生平台而没有改变视觉提示的空间 觅向能力测试对小鼠进行测试。在具有最小刺激的环境(如噪音、移动、或光或溫度的变化） 下，在光循环的最后4小时白天部分，进行行为分析。
[0。0] 结果与讨论
[0131] 图9显示了用MNG-AZ治疗的Tg2576小鼠中认知功能退化减轻，运与胞外HMW低聚Αβ 的降低一致。图9Α和9Β显示了如莫里斯水迷宫测试中所测定的，MNG-AZ对Tg2576小鼠中Αβ 相关的空间记忆的影响。图9Α描述了等待时间评分(代表从水中逃到平台上花的时间）与治 疗时间的关系。图9Β显示了空间觅向能力测试中Tg2576小鼠花在目标象限上时间的百分比 (计算为花在目标象限区域的时间与花在水池其他区域的时间的比例）。图9C呈现了采用特 异性针对HMW低聚Αβ肤的抗体在斑点杂交分析中评估Tg2576小鼠脑中可溶胞外HMW可溶的A 0含量。图9C中显示了曲柳可溶Αβ含量的代表性斑点杂交分析。值代表组平均值±SEM，n =每 组7-9个小鼠；在图9B中，***p<0.0001;在图9C中，*p<0.01，采用学生双尾t检验。
[0132] 11月龄的Tg2576小鼠表现出明显的空间参照记忆功能障碍，表现为在莫里斯水迷 宫测试中，他们不能在学习测试中学会使用空间参照线索来定位隐藏的逃生平台（图9A)。 与此相反，用MNG-AZ GSE治疗的Tg2576小鼠在空间记忆行为功能测试上明显表现得更好， 并且能够学会使用空间参照线索来定位逃生平台，表现为随着学习测试的进行，逃生等待 时间显著减少(双因素重复测量的方差分析;GSPE相对于对照组:Fi,ii = 4.90;GSPE治疗的P =0.049方7,77 = 4.25;时间的口 = 0.0005且。7,77= 1.63;相互作用的口 = 0.140)(图94)。在 Tg2576小鼠中MNG-AZ诱导的认知功能障碍减轻被空间觅向测试中的空间记忆保留分析证 实，表现为MNG-AZ治疗的小鼠在目标象限区域中所花的时间要显著多于用水治疗的对照小 鼠（图9B)。运种认识功能改善，与MNG-AZ治疗的Tg2576小鼠比对照小鼠的脑中HMW低聚Αβ 物质的显著降低相一致(图5C)。
[0133] 在对照研究中，MNG-AZ GSE治疗没有影响品系、年龄和性别匹配的野生型小鼠的 认知功能（图10A和10B)。上述结果表明通过减弱脑中的AD型Αβ介导的应答，MNG-AZ GSE选 择性地有助于Tg2576小鼠中的空间记忆参照缺陷。
[0134] 实施例4在体外MNG-AZ对于化U蛋白聚集的影响
[0135] 本实施例显示了如本发明的一个实施方式所述的组合物对于tau肤聚集、解离预 先形成的tau聚集物、W及从AD脑标本中获得的天然tau纤维的稳定性的影响。
[01化]材料与方法
[0137] 评估MNG-AZ在体外抗tau聚集的生物活力。6氨基酸的N-乙酷化肤（Ac- w6VQiVYK3ii)tau肤，对应于tau的306-311残基，是购买获得的。运个合成的化U肤是在tau蛋 白的微管结合区发现的短肤片段。证据表明运种短肤片段是tau多聚化所必需的(Goux等， J.Biol .Chem. 2004; 279 :26868-26875 )。在体外生理观察中发现在盐存在下短Ac- 3d6VQIVYK"i肤自发聚集成纤丝结构，也支持了运一观点（Goux等，2004，见上）。如Goux等， 2004,见上文中所述，Ac-W6vqivyk3ii肤的低聚化是非常重要的。简要地说，合成的tau肤溶 解在20mM M0PS，pH 7.2中。了曰11肤的多聚化在75山含有2.241肤和1〇41硫横素5(化5)的2〇111]\1 MOPS(pH 7.2)溶液中进行。反应通过加入盐到终浓度为0.15M来起始。在存在或不存在不同 浓度的MNG-AZ下评估化U肤聚集的动力学1小时，通过跟踪ThS结合到聚集的肤物质上后化S 巧光升高;在436nm诱导巧光激发并且在470nm检测巧光发射。
[0138] 此外，PICUP、圆二色谱(CD)和电子显微镜方法也用于研究MNG-AZ对于形成tau肤 聚集物所需的蛋白-蛋白相互作用的影响。
[0139] 对于PICUP测试，在存在或不存在等摩尔浓度(25yM)MNG-AZ，的情况下，交联25μΜ tau肤，并且多体的化U肤用SDS-PAGE重新分开，并且用银染显色。
[0140] 对于CD光谱，在lOmM憐酸盐，pH 7.4存在下，*日11肤在37°(：解育1-3天，并且在解育 开始时(第0天）W及后面Ξ天的每一天获取CD光谱。
[0141] 对于电子显微镜，在存在或不存在与tau肤的摩尔比为1:1的GSE下，tau肤在lOmM 憐酸钢，pH 7.4中37°C解育3天。解育后，溶液16,000X g离屯、5分钟，然后用尺寸排阻柱来分 离200山上清液。通过在254nm的紫外吸收在洗脱~12分钟时检测并且回收化U纤维。
[0142] 评估MNG-AZ在体外解离预先形成的tau聚集物的能力。在不存在MNG-AZGSE时，合 成的Ac-W6VQiVYK3iitau肤聚集。在形成tau聚集物后，向反应中加入不同浓度的MNG-AZ，并 且通过跟踪化S巧光来监测随着G沈加入化U聚集物量的变化。
[0143] 评估MNG-AZ破坏AD脑样本中获得的天然tau纤维稳定性的能力。PHF是从AD患者死 后的脑标本中分离和纯化的，并且一些PHF样品使用MNG-AZ(100μΜ)处理5秒或1小时。运些 结果是用电子显微镜观察到的（日立H700，Hitachi)。
[0144] 评估丽G-AZ GSE对于tau纤丝的膜酶消化的影响。PHF是从AD脑样本中分离出来 的。一些PHF样品用100μΜ MNG-AZ处理10分钟。一些PHF样品（无论是否预先用MNG-AZ处理） 还与1 yg膜酶解育10分钟。结果是用'电子显微镜观察到的（日立H700，Hitachi)。
[0145] 结果与讨论
[0146] MNG-AZ抑制tau的聚集。图11中显示了MNG-AZ GSE抑制tau聚集的结果(注意在图 11中MNG-AZ表示为MegN)。在盐存在下，合成的Ac-W6VQiVYK3iitau肤容易随时间形成聚集 物。表现为化S巧光随着反应时间而升高（图11A，其中聚集的tau的积累与时间的关系用化S 巧光进行评估;GSE浓度0.22μΜ、2.2μΜ和22μΜ，分别对应于G沈与tau肤的摩尔比为1:10、1:1 和 10:1。
[0147] 加入0.22-22μΜ的Μ蝶aNatural寬-AZGSEW剂量依赖的方式显著干预了 tau肤的聚 集(单向方差分析，P<〇.0001);在缺乏GSE时，计算的平均最大巧光发射为122.9±1.3单位， 与存在0.22、2.2和22μΜΜ巧aNaUmil度-AZG沈下的计算平均巧光发射分别为114.2± 1.1、 109.6±0.6和100.6±0.3单位相比较(如图11B中所示，其中tau蛋白聚集物的最大积累计 算为6-10分钟的平均巧光单位）。此外，每次MNG-AZ GSE量的逐步升高导致化S巧光的显著 增幅下降（T址巧事后配对分析，非MNG-AZ对比0.22μMMNG-AZ、0.22对比2.2μMMNG-AZ，W 及2.2对比22μMMNG-AZ，I)<0.001)。有趣地是，在低量的0.22μMMNG-AZG沈下，可W检测到 tau肤聚集物的积累减少，其对应于G沈与tau肤的摩尔比为1:10。在22μΜ GSE下，完全抑制 Tau肤聚集，其对应于G沈与化U肤的摩尔比过量为10:1 (图11A和11Β)。
[0148] 在存在MNG-AZ时tau聚集物显著减少，如PICUP测试结果所示（图16,其中试剂的浓 度如下。对照：没有Ru(Bpy)且没有APS;第1、2道：1山ImM Ru(Bpy)和1μ1 20mM APS;第3、4 道：2山 ImM Ru(Bpy)和化 1 20mM APS;第5、6道：3山 ImM Ru^py)和化1 20mM APS;第7、8 道:4山ImM Ru(Bpy)和4μ1 20mM APS)。运表明MNG-AZ可抑制化U肤聚集，部分通过干预化U 肤自我连接的起始阶段。
[0149] 如圆二色谱结果（图17A和17B)所示，在tau肤的解育过程(1-3天）中，tau肤构象也 表明MNG-AZ影响了tau肤的组装。在缺乏GSE时，在解育2-3天后随机结合的tau肤逐渐转化 成有序的β-折叠异构体，如集中在~198nm的光谱部分的幅度升高（图17A)所示。相反地，在 GSE与tau肤摩尔比为1:1时，tau肤与GSE共同解育防止了 tau肤转化成为有序的二级结构 (图 17B)。
[0150] 如电子显微镜研究所得，在缺乏和存在MNG-AZ时，tau肤异构体的形态表现为tau 肤自发聚集成螺旋原纤维（图18A)。相反地，GSE的存在完全抑制了tau肤原纤维的形成（图 17B)。
[0151] 总的来说，上述结果表明MNG-AZ干预了化U蛋白聚集形成低聚PHF。
[0152] MNG-AZ促进了预先形成的tau聚集物的解离。MNG-AZ能够解离预先形成的Ac- wsyQIVYKSiitau肤聚集物。特别是，加入1. ΙμΜ MNG-AZ，对应于MNG-AZ与化U肤摩尔比为1:1， 能够降低预先形成的tau肤聚集物的量，表现为化S阳性tau聚集物的降低量升高与时间的 关系（图12A作出了在不同MNG-AZ浓度下(0.55-4.4μΜ)，化U聚集物的化S巧光的量的图）。如 同预期，采用较高浓度的MNG-AZ(2.2μΜ和4.4μΜ MNG-AZ)的平行研究也促进了预先形成的 tau肤聚集物的解离。在下面的图12A和12B中，MNG-AZ标注为MegN。通过用化S巧光发射的线 性回归分析来计算在不同浓度的MNG-AZ GSE浓度下化U聚集物的解离速度，研究MNG-AZ对 预先形成的tau聚集物解离的剂量依赖功效（图12B)。加入浓度从1.1增加到4.4μΜ的MNG-AZ 表现为W剂量依赖的方式促进预先形成的tau肤聚集物的解离。换而言之，聚集的tau肤的 解离速度与MNG-AZ GSE的浓度直接相关(皮尔逊相关系数R = 0.96654，^0.05).
[0153] MNG-AZ影响了 tau纤维的稳定性。图19显示了用电子显微镜观察到的MNG-AZ对于 tau纤维稳定性的影响。图19A显示了来自AD的PHF，其表现为平均宽度为18.9+3.4nm且平均 螺旋扭矩为81.3+10.8nm的典型的有组织的纤维结构，并且用免疫金标记，采用PHF1抗体， 定位接近PHF核屯、的憐酸化丝氨酸396/404表位。有趣地是，分离的PHF与G沈解育，随着接触 GSE的持续时间增加，诱导了PHF逐步展开（图19B-19D);与GSE解育1小时导致纤维宽度增加 67% (达到31.6+3.8nm)而不影响平均螺旋扭矩(GSE-处理的PHF的平均宽度和螺旋扭矩分 别为31.6+3.8和77.4+10.8皿)（图19C，19D)。而且，发现GSE处理掩盖了分离的化U纤维对于 PHF1抗体的免疫反应性(图19B和19C，与图19A相比）。
[0154] 发现用G沈处理分离的化U纤维，也能够促进化U纤维的膜酶消化（图20)。从AD脑中 分离的PHF在有（图20C和20D)或没有（图20A，20B)lμg/ml膜酶的条件下解育10分钟。图20B 和20D中的样品也用GSE预处理（100μΜ GSE，1小时）。在用膜酶处理后，PHF保持了他们的纤 维样外观(参见图20C中的插图）。在膜酶消化前用G沈预处理，使得PHF解离成对AH-1抗tau 抗体有免疫反应性的无定形的tau片段(参见图20D中的箭头和插图）。运些结果表明GSE介 导的对tau纤丝构象的调控可W促进细胞蛋白酶对tau的降解。
[0K5]总的来说，MNG-AZ GSE抑制合成的tau肤聚集成纤丝，并且使预先形成的tau聚集 物解离。运表明MNG-AZ与化U的相互作用可W减少化U聚集物沉积的聚集，运是多种化U相关 的神经退行性疾病的一个关键神经病理学特征。而且，MNG-AZG沈也可通过干预神经毒性的 tau原纤维的形成和/或稳定性，来缓和tau介导的表型。因此，上述结果提供了强有力的证 据表明MNG-AZ或它的组成化合物可W用作预防性手段来减少tau蛋白病的发生，或是作为 治疗方法来治疗tau相关的神经退行性疾病。
[0156] 实施例5葡萄巧提取物对于tau和htt肤的多聚谷氨酷胺延伸形式的体内效果
[0157] 采用诱导型 Gal4/UAS 系统（Brand,等 Development ,1993; 118:401-415)的转基因 过表达疾病相关聚集倾向的蛋白的果蛹模型，已经成功地通过过表达R406W突变的化U建立 了 tau蛋白病模型和过表达Q93httexonl建立了亨廷顿病模型（参见如Sang等， 化uroRx.2005;2:438-446. ;Berger等，Hum Mol Genet 2006;15:433-442)。特别是，在形成 眼的细胞中过表达R406W(ey〉R406W)，导致眼的严重减少或完全缺失;形成的眼表现出形态 异常。而且，在含有UAS-Q9化ttexonl的转基因品系中W泛神经的方式表达Gal4(elav- Gal4)，导致成年时发生神经退化并且寿命缩短。
[0158] 本实施例显示了葡萄巧提取物对于带有突变tau(R406W)或多聚谷氨酷胺延伸形 式的htt(Q9化ttexonl)的果蛹表型具有有益的体内效果，所述果蛹模型分别有某些形式的 tau蛋白病和亨廷顿病。
[0159] 材料与方法
[0160] 巧〉R406W果蛹的眼表型检测。ey〉R406W产卵并且用对照食物（即食苍蛹培养配方 4-24蓝色)或补充有2.8μg/ml MNG-AZ GSE(或GS阳，图13和14中）的食物进行饲养。在显微 镜下观察果蛹的眼睛。
[0161 ] elav〉httQ3果蛹的寿命监测。过表达Q9化ttexonl的雄性果蛹W泛神经的方式表 达elav-Gal4(elav〉Q93httexonl)，在羽化后1天内收集，并且每管10个放置，加入对照食物 或补充有2.8μg/ml MNG-AZ GSE的食物。每天计数存活的果蛹，并且每隔几天转移到新管 仲。
[016。结果与讨论
[0163] GSE抑制果蛹眼中的R406W tau过表达。在眼睛发育早期R406W的过表达导致小眼 或无眼（图13A)，但是GSE治疗抑制了眼睛尺寸的减小（图13B)(显示了雄性的眼睛Key〉 R406W表型的范围在试验和试验之间有差异，所W试验单独进行分析。在一个代表性实验 中，在羽化后3天内收集对于雄性眼睛的视觉评分(0 =无眼，4 =几乎正常眼）（图13C)。在同 一试验中，一旦接受G沈治疗(右），缺失眼睛的数量下降（图13D)。
[0164] G沈治疗延长了 elav〉httQ3果蛹的寿命。发现G沈治疗的elav〉Q93httexonl果蛹的 特征在于，与未治疗的对照相比，整体寿命显著延长（图14)。平均而言，对照食物组在第20 天有50%的elav〉Q93httexonl雄性果蛹死亡，相比之下，G沈组中只有20%死亡。
[0165] 上述结果表明，GSE治疗在体内抑制了两种不同果蛹模型中设及蛋白聚集的神经 退行性疾病。运些发现表明GSE对于预防和/或治疗蛋白聚集倾向的神经退行性疾病具有治 疗价值。
[0166] 实施例6葡萄巧提取物对于Αβ自我组装和细胞毒性的影响
[0167] 本实施例提供了如本发明的一个实施方式所述的组合物对于降低Αβ的自我组装 和细胞毒性的影响的证据。
[01側材料与方法
[0169]化学品和试剂。化学品从西格玛奥德里奇公司（圣路易斯，密苏里州）（51旨111曰- Aldrich Co. (St丄ouis，Μ0))获得，并且为可W获得的最高纯度。Medysin#lr'Medr )购自 奥地利格拉茨的极光精细化工有限公司（Aurora Fine Qiemicals Ltd.，Graz，Aust;ria)。 Mega化tural-AZ(MNG-AZ)购自普利芬尼公司（马德拉，加利福尼亚州，Polyphenol ics (Madera，CA))。（当提到它们与Αβ的混合物时，有时候MNG-AZ和Medl称为"化合物"）。水是用 Mi 11 i-Q系统双蒸且去离子的（密理博公司，贝德福德，马萨诸塞州）（Mi 11 ipore Corp.， Be壯ord，MA)。
[0170] 肤和蛋白。Αβ肤是如前所述进行合成、纯化和鉴定的(Walsh等，J Biol化eml997; 272:22364-22372)。简要地说，合成在自动化肤合成仪(型号433A，应用生物系统公司，福斯 特城，加利福尼亚州(Applied Biosystems Joster City,CA))上采用基于9-巧甲氧幾酷的 方法在预先装载的王树脂上进行。肤采用反相高效液相层析(RP-HPLC)进行纯化。针对每一 个肤，定量氨基酸分析和质谱分别产生预期的组成和分子量。纯化的肤W冷冻干粉的形式 储存在-20°C。谷脫甘肤琉基转移酶（GST;西格玛奥德里奇公司，圣路易斯，密苏里州 (Sigma-Al化ich，St丄ouis，M0))的储液是通过将冷冻干粉在60mM化0H中溶解成250μΜ溶 液配成的。在使用前，等分试样在lOmM憐酸钢抑7.4.中稀释10倍。
[0171] 配制Αβ的储液。不含聚集物的Αβ储夜是采用尺寸排阻层析(SEC)来制备的。名义上 的单体馈分被称为低分子量(LMW)Ai3,因为在实验的肤浓度下，该馈分包含快速平衡的单体 和低分子量低聚体的混合物。为了制备Αβ，200山2mg/ml(名义浓度）的肤二甲亚讽溶液在 超声水浴中超声1分钟（必能信超声公司，丹伯里，（化anson叫trasonics，Danbu;ry，CT))， 然后在16,000Xg离屯、10分钟。所得的上清在S叫erdex75HR柱上用10mM憐酸盐缓冲液pH 7.4W流速0.5ml/分钟进行分离。在Αβ峰的中部收集50秒，并且立即用于所有实验。10山等 分试样用于氨基酸分析，来定量确定每一个制剂中的肤浓度。通常Αβ?-40和Α&-42的浓度分别 为30-40μΜ和10-20μΜ。
[0172] Αβ解育。Αβ样品如上所述进行制备，然后将0.5ml等分试样放入1ml微量离屯、管中。 测试化合物在乙醇中溶解到终浓度为2.5mM，然后用lOmM憐酸盐溶液抑7.4稀释，W产生10 和50μΜ的浓度。然后将0.5ml每种化合物加入到独立管的Αβ中，产生肤终浓度为~20μΜ(Α 01-40)和~10μΜ(Αβι-42)且抑制剂终浓度为5和25μΜ。因此，在化合物浓度较低时化合物:肤的 比例为~1:4(Αβι-4〇)和~1:2(Αβι-42)，且在化合物浓度较高时为5:4(Αβι-4〇)和5:2(Αβι-42)。 只有肤的对照管接受0.5ml缓冲液。管子在37°C静置解育0-7天。
[0173] 化学交联和低聚体的频率分布。在制备后，样品立即采用PICUP技术进行交联。简 单地说，向18山蛋白溶液中加入1μ1 ImM Ru(bpy)和1μ1 20mM过硫酸锭(APS)dA&-4〇和Αβι-42 的蛋白：Ru (bpy): APS的最终摩尔比分别为0.29:1: 20和0.16:1: 20。混合物用可见光照射1 秒钟，然后反应用10山含有5%琉基乙醇的化icine样品缓冲液(英杰公司，卡尔斯己德，加 利福尼亚州（111￥；[化0旨日]1，化1'136日(1，〔4))泽灭。单体和低聚体的频率分布采用505斗466和 银染来确定。简单地说，20山每种交联的样品采用10-20%梯度tricine凝胶电泳，并且用银 染显色(Silve巧press,英杰公司Invitrogen)。在每个实验中未交联的样品用作对照。为了 得到强度分布谱和计算每种低聚体类型的相对量，进行光密度分析，并且用化e-Dscan软件 (V. 2.2.2;抓生命科学生物成像公司，罗克韦尔，马里兰州（BD Biosciences Bioimaging， Rockville,MD))来确定基线校正值的峰面积。在一些实验中，相对于肤，提高Ru(bpy)和APS 的摩尔量，系数为2，5,10和20。
[0174] CD光谱。在样品刚制备后或解育2、3、6、7天后获取Αβ溶液的CD光谱。CD检测通过从 反应混合物中取出200化等分试样，将等分试样加到1mm光径长度的CD比色皿(豪玛公司，森 林小丘，纽约化elIma，Forest化11S，NY))中，并用J-810分光偏振仪(JASC0公司，东京，日 本)来获取光谱。在插入分光光度计前，CD比色皿保存在冰上。在溫度平衡后，在22 °C从~ 190-260皿0.2皿分辨率W扫描速度为100皿/分钟记录CD光谱。进行10次扫描，并且针对每 个样品对数据进行平均。根据制造商的说明，通过平滑和减去缓冲液光谱对原始数据进行 处理。
[0175] 硫横素 Τ(化Τ)结合测试。10化样品加至Ij 190化溶解在lOmM憐酸盐缓冲液(pH 7.4) 的化T中，混合物用縱满震荡器短暂震荡。采用日立F-4500巧光光度计WlO秒间隔Ξ次测定 巧光。激发和发射波长分别为450和48化m。将Ξ次读数平均并且减去化T空白的巧光，来确 定样品的巧光。
[0176] 电子显微镜化M)。每种样品的10山等分试样点到辉光放电的、碳涂层的化rmvar网 格上（电子显微镜科学公司，哈特菲尔德，宾夕法尼亚州巧lectron Microscopy Sciences， 化tfielcUPA))并且解育20分钟。然后液滴用等体积的2.5% (体积/体积)戊二醒水溶液置 换掉，并且再解育5分钟。最后，肤用8μ1 1% (体积/体积）（0.2皿)过滤的醋酸轴水溶液（电 子显微镜科学公司，哈特菲尔德，宾夕法尼亚州化lectron Microscopy Sciences, 化tfielcUPA))染色。吸走溶液并且空气干燥网格。样品用巧化CXIOO透射电子显微镜来观 测。
[0177] 3-(4,5-二甲基-2-嚷挫）-2,5-二苯基漠化四氮挫（MTT)代谢。大鼠嗜铭细胞瘤 PC12细胞培养在75cm2细胞培养瓶中（#430641，康宁有限公司，康宁，纽约州（Corning Inc .，Corning，NY))，采用含有15% (体积/体积）马血清、2.5% (体积/体积)胎牛血清、100 单位/毫升青霉素、O.lmg/ml链霉素、和25μg/ml两性霉素 B的F-12K培养基，37°C且空气中含 有5 % (体积/体积)0)2。为了准备测试用的细胞，去掉培养基，细胞用含有0.5 % (体积/体 积)胎牛血清、100单位/毫升青霉素、〇.>1 mg/ml链霉素、和25μg/ml两性霉素 B的F-l^培养 基轻轻洗一次。然后细胞悬液制备通过加入后一种培养基，但含有100微克/毫升的神经生 长因子（英杰公司，加利福尼亚州（Invitrogen，CA))，接着振荡细胞培养瓶。采用台吩蓝细 胞计数后，细胞W30,000细胞/孔（90μ1总体积/孔）的密度铺到96孔测试板中（Costar# 3610,康宁有限公司，康宁，纽约州（Corning Inc.，Corning,NY))。允许神经生长因子诱导 的细胞分化进行48小时，在运个时间点进行毒性测试。
[0178] 用两种方式来评估Αβ细胞毒性。肤预先与0或25μΜ丽G-AZ的lOmM憐酸钢溶液pH 7.4,预先在37°C解育0、2、3或7天，再向孔中加入10山肤溶液。任选地，Αβ如上所述进行解 育，但是没有MNG-AZ。在运种情况下，在加入到细胞中前，肤溶液即时与0或25μΜ MNG-AZ混 合。细胞用终浓度为只含0或~2μΜ Αβ或是包含2.5μΜ MNG-AZ的MNG-AZ处理的Αβ处理24小 时。对于Αβι-4〇和Αβι-42肤，肤/化合物分别比例为0.72和0.39。在实践中，对于每个可选实验 方式，"零时刻"样品是等价的，因为所有组分都在同样的时刻与细胞混合。
[0179] 为了确定毒性，向每孔中加入15山ΜΤΤ溶液(普洛梅格公司，麦迪逊，威斯康星州 (Promega，Madison，WI))并且板子在C〇2培养箱中再放3.5小时。然后通过加入100山增溶溶 液(普洛梅格公司，麦迪逊，威斯康星州。'〇111日肖日，1日扣3〇11，￥1))裂解细胞，接着过夜解育。 采用佛蒙特州宝特仪器公司的宝特Synergy HT酶标仪（BioTek Synergy HT microplate reade;r(Bi〇-Tek Inshuments，Winooski，Ve;rmont))，通过检测570nm的吸光度来评估MTT 减少(对630nm的背景吸光度进行校正）。对照包括含有憐酸钢的培养基Γ阴性"）、纤维（"阳 性"）和ΙμΜ星形抱菌素（"最大阳性"）。纤维状Αβι-4〇和A&-42加入到细胞中，终浓度分别为10μ Μ和5μΜ。同样的纤维制剂用于所有的实验并且用于控制批次之间的变化率。为了能够进行 批次之间的比较，首先确定每个实验内的毒性。每个处理组做6个重复样品，并且将来自Ξ 个独立实验的数据结合起来用平均值±标准差表示。
[0180] 毒性百分比Τ=((Ααρ-Α±纖)/(Asife^-Ai：纖)）X 100;
[0181] 其中Ααρ、細疆、AsMiR为来自含有Αβ的样品、只有培养基、或只有星形抱菌素的吸 光度。
[0182] 统计学分析。单向分数方差分析和多重比较检验用于进行统计学分析，采用 Gra地化d Prism(版本4.0a，Gra地化d软件有限公司，圣地亚哥，加利福尼亚州，San Diego， CA)的统计学程序进行。p-值<0.05被认为有显著性差异。
[018引结果与讨论
[0184] Αβ低聚化。在没有PICUP交联时，只观察到Αβι-4〇单体（图15A，第2道)和Αβι-42单体和 Ξ聚体（图15Β，第2道ΚΑβι-42Ξ聚体条带已经被证明是一种SDS-诱导的人工产物。在交联 后，A&-40W单体和2-4数量级的低聚体的混合物存在（图15Α，第3道），而施-4泡含单体和2- 6数量级的低聚体（图15B，第3道）。
[0185] 当MNG-AZ与施-4〇按照化合物:肤比例为~5:4混合时，低聚化几乎完全被抑制（图 15A，第6道）。立聚体条带刚好能被看见并且二聚体的强度也是最低的。提高化合物:肤的比 例10倍，产生了相似程度的抑制（图15A，第7道）"MNG-AZ对于Αβι-42低聚化的影响同样显著 (图15Β)。在化合物:肤比例为~5:2，MNG-AZ产生的低聚体分布几乎与未处理的Α&-42相同， 与基本完全抑制低聚化一致（比较图15的第6道(处理的）和第2道(未处理的））。提高化合 物:肤的比例10倍，产生了相似程度的抑制（图15A，第7道）。运些数据表明，基本完全抑制Αβ 低聚化可W在化合物:肤比例为~5:2或更低时实现。
[0186] 采用一种结构与MNG不同的无活性的多环分子Medl作为化合物对照。如图15Α和 15B所示，第4道，在Medl存在下Αβι-4〇和Αβι-42产生的低聚体分布与只有每种肤的低聚体分布 是无法区分的。提高化合物:肤比例10倍表现出相似的低聚体分布（图15Α和15Β，第5道）。
[0187] W前认为，强力抑制Αβ低聚化可能是对抑制剂对PICUP反应本身的影响造成的。为 了评估运种可能性，交联反应也可在谷脫甘肤琉基转移酶(GST;~26kDa)上进行，一种交联 反应的阳性对照。没有交联的GST表现为一条强的单体条带和一条相对弱的二聚体条带（图 15C，第2道）。交联产生了一条强的二聚体条带，除了因为GST正常表现为一个同源二聚体， W及更高阶的交联物类型。在测试的两种化合物:肤比例的Medl存在下，分别为1:1(图15C， 第4道)或10:1(第15C，第5道），GST交联没有变化。在MNG-AZ为1:1比例时，也观察到了质量 上相似的分布（图15C，第6道）。只在10:1的比例，观察到了MNG-AZ对GST低聚化的显著影响， 运比在用Αβ的实验中所用的最高浓度要高4-8倍。运种效果可能是由于直接的化合物:GST 效果或是化学效应。然而，化学效应不能解释对Αβ?-40和Αβ?-42低聚化的强烈抑制，W及缺乏 对GST低聚化的强力抑制，参见图15中的第6道(在其他测试中没有抑制活力）。运提供了强 有力的证据，证明MNG-AZ强力抑制Αβι-4〇和Α&-42的低聚化。
[0188] 圆二色光谱。用CD光谱研究MNG-AZ对于Αβ及其低聚体的二级结构的影响（图3)。当 单独解育时，Αβι-4〇和族-42表现出特征为极度无序的构象异构体的初始光谱（图3Α和3C)。运 些光谱的主要特征为集中在~198nm的大幅最小值。在后续的3天解育中，发生大的构象改 变，最终产生混合的α-螺旋和0-折叠特征的群体(参见在~195,~210和~220nm弯曲）。相 反地，在存在MNG-AZ时没有观察到转变（图3B和3D)。MNG-AZ处理的Aβl-4()和Aβl-42的所有光谱 显示了极度无序的构象异构体的群体，表明MNG-AZ成功地阻碍了 Αβ二级结构的形成，尤其 是0-折叠，其设及Αβ的异常聚集。
[0189] ThT结合。采用ThT结合来确定施-4〇和施-42制剂中的β-折叠结构的水平。在缺乏化 合物时，Α&-4质现准S形结合曲线，特征为2天滞后期，和约3天的化Τ结合持续增长期(与纤 维形成相关），W及约5天后的结合平台（图4)。当施-4〇与Medl解育时，化合物:肤比例为1:4 或5:4,结合曲线与未处理的肤的结合曲线相同，在实验误差范围内（图4A)。相反，MNG-AZ产 生了显著差异（图4B)。运些包括MNG-AZ浓度依赖性的滞后时间增加，β-折叠产生速率的减 慢，W及最终0-折叠水平降低(表1)。采用较高浓度(25yM)MNG-AZ时，观察到施-4〇组装几乎 完全抑制。
[0190] 表Ι.Αβ组装的动力学
[0191]
[0192] 未处理的Α&-42和Med 1 -处理的样品与Αβι-4〇的组装相似（图4C)。在测试的时间分辨 率内，观察到巧光发生很少或没有滞后时间，其W准线性的方式增加4天并且然后保持恒 定。MNG-AZ对于Αβι-42组装的影响甚至比对Αβι-4〇组装的影响更大。当Αβι-42与MNG-AZ按照化 合物:肤比例为1:2解育时，观察到1天滞后，并且最大化Τ结合要比未处理的肤低6倍，最大 ThT结合发生在仅1天后（图4D;表1)。然而，在化合物:肤比例为5:2时，没有观察到β-折叠形 成。因此，MNG-AZ W剂量依赖的方式抑制Αβι-4〇和Αβι-42的β-折叠形成，并且抑制要比对Αβι-42 明显有效得多。
[0193] ΕΜ结果。二级结构参数与Αβ组装状态相关，但是他们本身没有建立组装体的四级 结构，运用电子能谱术观察更佳（图5)。在未处理的Αβ?-40和Α&-42样品中观察到经典的淀粉 样蛋白纤维(分别为图5Α和58)。施-4〇纤维是没有分支的螺旋纤丝，直径为~7nm，其表现为 螺旋周期为~220nm"A&-42形成了宽度为~8nm且螺旋程度不一的无分支纤丝。此外，在Αβ42 组装中，也观察到了宽度为~12nm的粗、直、无分支的纤丝。在较低浓度(5μΜ)的MNG-AZ时， 纤维比未处理的Αβ形成的纤维更细(4和8nm)(图5C)。另外，观察到了大量小的、相对无定形 的聚集物。用25yMMNG-AZ处理Αβι-4〇使得纤维数量明显减少，并且短纤维和无定形聚集物的 相对数量增加（图5E)"MNG-AZ对于施-4細装的影响相似，其中纤维数量减少并且无定形聚 集物的频率增高（图5D和5F)。
[0194] MTT代谢(毒性测试）。图6中显示了Αβ的毒性测试结果。在图6A-抓中，左侧的组代 表在0天解育后的毒性结果(对于Αβ?-40和Α01-42肤）；在中间的组代表Α01- 40解育3天后毒性 结果（图6Α和6Β)或Αβι-42解育2天后的毒性结果（图6C和6D);右侧的组代表解育7天后的毒 性结果(对于两种肤）。在一套实验中（图6Α和6C)，肤与Medl或MNG-AZ-起解育。在第二套实 验中（图6B和6D)，在解育后W及混合物刚要加入到分化的PC 12细胞中之前，加入Med 1和 MNG-AZo
[0195] Αβι-4〇表现出对细胞有毒性并且毒性为纤维的~20% (图6A) dA&-4〇和Medl的混合 物也为~20 %毒性。相反地，MNG-AZ使得Αβι-4〇没有毒性。Αβι-4〇解育3天，在此期间形成了低 聚体、原纤维和纤维，产生了明显毒性更强的组合物（~60 %，图6Α的中间组）。用MNG-AZ处 理Αβι-4〇将运种毒性降低到<10% (ρ<0.005)。在7天解育后，Ξ个实验组之间观察到了相同 的质量关系（图6Α的右侧组）：未处理的和Medl-处理的Αβι-4〇都为~35-40%毒性，而MNG- ΑΖ处理的Αβι-4〇为<10%毒性。在用Α&-42进行的实验中得到的相似的结果（图6C)。在所有时 间点，Αβ?-42要比Αβ?-40毒性更大。
[0196] 图6Β中显示了在肤组装进程后MNG-AZ对于Αβι-4〇诱导的毒性的影响。在所有解育 时间，未处理的和Medl-处理的肤产生了相似的毒性水平。相反地，MNG-AZ处理的肤是无毒 的（0天)或明显毒性更低(3或7天）。在Αβι-42的研究中获得了质量相似的结果（图6DKMNG- ΑΖ对Αβ?-42的效果要比对族-40效果更为明显。
[0197] 上述结果一致表明MNG-AZ有效抑制在脑中的Αβ的低聚化及其毒性。运些发现证明 MNG-AZ能预防或治疗与Αβ错误折叠、积累、聚集或沉积相关的疾病。
[0198] 实施例7葡萄巧提取物对于化U蛋白病的转基因果蛹和小鼠模型的体内效果
[0199] 本实施例显示了如本发明一个实施方式所述的组合物在带有突变的tau(R406W) 蛋白的果蛹表型和tau蛋白病的转基因 JNPL3小鼠模型的体内有益效果，所述果蛹模型具有 一定形式的化U蛋白病。
[0200] 材料与方法
[0201] 检查ey〉R406W果蛹的眼睛表型。本研究是实施例5中介绍的研究的延续。简要地 说，巧〉R406W卵产下并且用补充有2.8μg/ml MNG-AZ GSE(或GSPE，图21)的4-24即食苍蛹培 养配方或加有等体积水(GSE溶剂，赋形剂对照）的对照食物进行饲养。果蛹用GSE(或赋形 剂)连续治疗到成年。在显微镜下观察果蛹的眼睛。
[0202] 评估JNPL3小鼠的运动机能障碍和死亡率。JNPL3小鼠模型被工程化改造成表达人 家族性的P301L突变的tau蛋白，其导致年龄相关的神经退化，表现为运动功能障碍。从约7 月龄开始，JNPL3小鼠用150毫克/公斤体重/天的MNG-AZ GSE治疗，运是在通常在12月龄发 生的突变tau-介导的运动障碍开始之前。后腿伸展测试（图22中所示)根据4分制评分系统 用于评估运动机能障碍。
[020引结果与讨论
[0204] GSE治疗抑制了 R406W突变的tau果蛹中的眼睛异常表型。与野生型成年果蛹相比 (图21A和21D)，成年R406W突变的tau果蛹的眼表型的特征在于尺寸减小并且形态异常（图 21B和21E)。相反地，GSE-治疗的突变的化U果蛹眼睛尺寸的异常要大大减少（图21C和21巧。
[0205] 在采用对眼形态学的变化的4分制评分系统的成年眼形态学的定量分析中，0表示 没有眼，且4代表正常眼，在3次独立测试中，GSE治疗表现为在成年雄性和雌性R406W突变的 tau果蛹眼睛表型显著改善（图21G)(方差分析:？<0.0005少=57.29;0。=1，531;冲<0.05， 在独立测试中比较GSE-处理和未处理果蛹）。
[0206] GSE治疗减轻了 JNPL3小鼠中的tau蛋白病临床前表型。持续的GSE治疗在JNPL3小 鼠中没有产生可检测的副作用，包括体重或水消耗的变化(结果未显示KJNPL3小鼠的GSE 治疗减轻了在运个小鼠模型中随着衰老正常会发生的运动障碍的严重程度（图23A)。在减 轻运动障碍的同时，与未治疗的JNPL3对照组相比，GSE治疗还显著降低了 JNPL3小鼠的死亡 率（图23显示了在13月，JNPL3小鼠的死亡率降低~30 % )(对数秩统计，P = 0.05;死亡率:未 治疗小鼠= 27%，GSE治疗小鼠=0% )。
[0207] 总的来说，实施例4、5和7中的体外和体内证据表明MNG-AZ GSE能够通过干预tau 错误折叠形成化U聚集物，有益调节化U介导的神经病理学表型，运支持了潜在应用G沈来预 防和/或治疗tau相关的神经退行性疾病，包括AD，进行性核上性麻搏，皮质基底变性，嗜银 颗粒病，皮克病，FTDP-17等。此外，GSE干预Αβ-介导的（如实施例1-3和6中所示)和化U-介导 的神经病理学机制的证据强有力地支持了 MNG-AZ在预防和/或治疗AD上的潜在应用。
[0208] 实施例8葡萄巧提取物对于多聚谷氨酷胺的htt介导的皿神经退行性表型的体外 效果
[0209] 本发明显示了如本发明的一个实施方式所述的组合物对于含有多聚谷氨酷胺的 htt蛋白物质的聚集的体外效果。
[0210] 材料与方法
[0211] 获得htt蛋白物质，采用含有蚁皮酱酬诱导的带多聚谷氨酷胺化t融合蛋白的PC12 细胞系，该融合蛋白包含htt蛋白的前17个氨基酸加上103谷氨酷胺与增强的GFP融合 化tt 103Q-EGFP)，一旦有蚁皮酱酬类似物米乐酱酬A诱导，它就表达htt融合蛋白，并且形 成巧光的htt聚集物(Apostol等，Proc 化t Acad Sci 2003; 100:5950-5955) oGFP-化t融合 蛋白被0.2μΜ米乐酱酬A诱导，并且用巧光显微镜和蛋白免疫印迹分析来评估在存在或不存 在MNG-AZ GSE(12.5yM和25μΜ)处理下GFP-Htt融合蛋白的聚集。在存在或不存在G沈时，htt 聚集物的积累表现为在GFP-Htt融合蛋白形成聚合物后的巧光发射。
[0212] 结果与讨论
[0213] GSE处理W剂量依赖的方式显著降低了巧光htt聚集物的积累：较高剂量的GSE处 理导致了高分子量的化t聚集物更为明显的减少（图24A)。运一结果也被一个独立的蛋白免 疫印迹分析证实（图24B)。
[0214]上述结果提供了体外证据，证明MNG-AZ可W干预多聚谷氨酷胺htt介导的皿神经 病理学表型。
[0215] 实施例9葡萄巧提取物对于亨廷顿病的转基因果蛹和小鼠模型的体内效果
[0216] 本实施例显示了如本发明的一个实施方式所述的组合物对于elav〉Q93httexonl 果蛹皿模型和R6/2转基因 JNPL3小鼠皿模型的体内有益效果。
[0217] 材料与方法
[0218] 评估皿果蛹的运动机能和死亡率。在运些研究中采用Elav〉Q93httexonl果蛹皿模 型。运一皿模型设及elav-Gal4/UAS调控系统来实现选择性、泛神经过表达由人htt基因的 第一个外显子编码的截短的人突变htt蛋白，其带有一个93-多聚谷氨酷残基（Sang等， 化uroRx，2005; 2:438-446)。运导致成年发生神经退化，包括眼睛的感光细胞破坏，爬行能 力障碍和寿命缩短(Sang等，2005，见上文）。
[0219] 在评估运动障碍中，在羽化（成年果蛹从其蛹中出来）后一天内收集成年elav〉 Q93httexonl果蛹并且每管10个放置，给予对照食物或加有MNG-AZ GSE的食物（每组n = 30)。分别在第9和16天，通过将果蛹轻拍到管子底部并且监测8秒内成功爬到管子上达到或 超过预先确定的高度(例如在第9天达到7cm标记或第16天达到2cm标记）的果蛹的百分比。 在评估死亡率中，在羽化后一天内收集成年elav〉Q93httexonl果蛹并且每管10个放置，给 予标准(对照)食物或加有MNG-AZ GSE的食物。每天计数存活的果蛹。
[0220]评估皿小鼠的运动机能和死亡率。运些研究采用最初由8曰*63博±及其同事生产 的R6/2小鼠皿模型进行(Mangiarini等Cell, 1996;87:493-506)，运是最常用的转基因小鼠 皿模型。R6/2小鼠表达带有148-153多聚谷氨酷胺重复的htt第1外显子片段。突变的htt的 调控是由人htt启动子控制的。R6/2小鼠表现出非常严重的神经表型并且提供了明确的实 验终点，运对于临床前可行性研究是理想的(Ramaswamy等ILAR J，2007; 48:356-73).
[0221 ] 从杰克逊实验室(Jackson' S Laboratories)获得的植入卵巢的雌性小鼠随机分 为2组（100毫克/公斤/天MNG-AZ GSE-治疗和水-治疗对照组)并且与野生型雄性小鼠交配。 断奶的幼鼠继续用同样的GSE或对照治疗方案喂养。
[0222]旋转杆测试用于评估在年龄相关的皿表型的发生和发展中，GSE治疗对于R6/2小 鼠运动协调改变的影响。在6周龄，训练皿转基因小鼠停在一个加速旋转杆装置的细杆上(4 转/分-40转/分，10分钟），从8周龄开始，每周一次监测旋转杆表现。在给定的每次测试进行 Ξ次尝试，并且记录Ξ次尝试的平均值。运动机能丧失表现为动物从装置上跌落的等待时 间缩短。在评估R6/2小鼠的死亡率中，小鼠用100毫克/公斤/天MNG-AZ GSE，或此0 (对照组） 治疗，并且每天记录存活率。
[0巡]结果与讨论
[0224] 果蛹皿模型的运动机能和死亡率。但在果蛹表现出轻度皿表型的第9天评估elav〉 Q93httexonl果蛹的运动表现时，发现GSE治疗改善了在第9天攀登测试中的运动表现（~ 40%的对照未治疗果蛹和~50%的GSE-治疗果蛹成功完成了攀登任务）（图25A)。然而，运 一结果没有达到统计学显著性。当在elav〉Q93httexonl果蛹发生更为严重的运动障碍的第 16天进行评估时，与对照果蛹相比，明显更多百分比的GSE-治疗果蛹成功完成了攀登任务 (~15%的未治疗果蛹和~47%的GSE-治疗果蛹成功完成了攀登任务）（图25B)。运些结果 表明，在运个果蛹皿模型中，GSE在体内发挥了生物活性并且减轻了运动障碍。
[0225] 除了运动障碍，在运个果蛹皿模型中表达突变的htt蛋白导致了寿命缩短。（从实 施例5中所讨论的）继续评估GSE治疗对于在运个果蛹模型中改善寿命的影响。与前面发现 GSE治疗显著减少了突变的化t-介导的运动障碍（图25)相一致，GSE治疗还明显延长了 elav〉Q93httexonl果蛹的寿命(从所有四次测试中果蛹存活的卡普兰-迈尔分析表明GSE- 治疗显著延长了 elav〉Q93httexonl果蛹的寿命:x2 = 21.73,壯=1，9 = 0.0001)(图26)。 [02%] 皿小鼠的运动机能和死亡率。在R6/2小鼠的运动机能研究中，6周龄时没有发现对 照组和GSE-治疗组之间存在行为差异，此时的动物大部分在症状发生前。在运动障碍开始 期的9周龄，W及在皿症状进行到中度运动障碍的11周龄，继续检查小鼠的运动机能。在临 床疾病起始(9周龄)和进行（11周龄)时，GSE治疗都显著改善了R6/2皿小鼠的运动机能，如 图27所示(柱状图代表动物能够留在旋转杆上的时间（秒）的平均值+SEM)。采用学生t检验 的统计分析*P<〇. 05比较GSE-治疗与对照未治疗组）。
[0227]在R6/2小鼠的死亡率研究中，发现G沈治疗显著延长了R6/2皿小鼠的存活。未治疗 R6/2小鼠的中值寿命为90天，而G沈治疗显著延长了皿小鼠的中值寿命到100天(卡普兰-迈 尔分析表明G沈治疗显著延长了皿小鼠的寿命:X2 = 4.018，壯=1，P = 0.045)(图28)。
[022引因此，上述采用独立的、系统发生远的果蛹和小鼠的皿模型的体内研究表明，MNG- AZ GSE具有减轻突变的HTT-介导的病理表型的功效。结合来自体外研究的证据(实施例5和 8中讨论），运些发现支持了采用GSE预防和/或治疗皿的潜在价值。
[0229] 林*
[0230] 本说明书引用的所有专利、专利申请、文献、产品说明和方法在此整体引用作为参 考。万一术语上有冲突，W本说明书为准。
[0231] 虽然很明显，本说明书所述的发明经过了很好的计算来达到上述的效益和优势， 本发明的范围不受本说明书所述的特定实施方式的限制。应当理解，可W对本发明进行修 改、变更和变化，而不超出本发明的主旨。
【主权项】
1. 葡萄籽提取物用于制造治疗或预防对象神经退行性疾病的组合物的用途，所述葡萄 籽提取物中没食子酰原花色素占原花色素的总重量的重量比低于12%，所述组合物适合按 有效量给予来减少Αβ低聚体形成、减少tau蛋白聚集和/或减少htt蛋白聚集。2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述神经退行性疾病为阿尔茨海默病。3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述神经退行性疾病为帕金森病。4. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述神经退行性疾病为亨廷顿病。5. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述神经退行性疾病为tau蛋白病。6. 如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述tau蛋白病选自下组:阿尔茨海默病，进 行性核上性麻痹，皮质基底变性，嗜银颗粒病，皮克病以及家族性额颞痴呆症。7. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物是配制成通过口服给药的药物组 合物。8. 如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述药物组合物配制成口服剂型，所述口服 剂型选自下组:粉末、片剂、胶囊、口腔分散片、软胶囊、水性药物、糖浆、酏剂和药囊。9. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物是配制成经皮给药的药物组合 物。10. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物是配制成经鼻给药的药物组合 物。11. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述对象为人类对象。12. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物是药物组合物且还包含选自下 组的活性成分:抗氧化剂、乙酰胆碱酯酶抑制剂、以及上述物质的组合。13. 如权利要求1所述的用途，所述组合物配制成用于口服给药。14. 如权利要求13所述的用途，所述组合物配制成口服剂型，所述口服剂型选自下组： 粉末、片剂、胶囊、口腔分散片、软胶囊、水性药物、糖浆、酏剂和药囊。15. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物还包含选自下组的活性成分:抗 氧化剂、乙酰胆碱酯酶抑制剂、以及上述物质的组合。
【文档编号】A61P25/28GK105920216SQ201610152670
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2009年5月8日
【发明人】G·M·帕西内特, L·霍, J·王
【申请人】西奈山医学院