化合物aszonalenin和acetylaszonalenin在制备抗糖尿病药物中的应用
【专利摘要】本发明公开了化合物aszonalenin和acetylaszonalenin在制备糖苷酶抑制剂药物中的应用，尤其是制备抗糖尿病药物的应用。aszonalenin和acetylaszonalenin单体化合物稳定、易存放，能够显著的抑制α-糖苷酶，且发明人经实验验证，发现其活性明显优于上市药物阿卡波糖，效果显著；此外，化合物aszonalenin和acetylaszonalenin的分子量均小于阿卡波糖，具有服用量少的优点；综上，化合物aszonalenin和acetylaszonalenin具有开发成抗糖尿病候选药物的潜在价值。
【专利说明】
化合物aszona I en i η和acety I aszona I en i η在制备抗糖尿 病药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于天然药物化学领域，具体涉及化合物aszonalenin和 acetylaszonalenin在制备抗糖尿病药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是一种临床常见的由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用障碍引起的以高血 糖为特征的代谢性疾病，是人类健康的重要杀手，随着社会的进步和人们生活水平的提高， 在全球范围内糖尿病的发病率正在提高，根据世界著名医学杂志Lancet统计，全球糖尿病 人数目前有近4亿，在我国更是有近1亿人的患病率，并呈现逐年增加的趋势。糖尿病正给 我国任命健康和国民经济造成越来越大的损失。糖尿病在目前的医疗水平下尚无法根治， 但是控制血糖在一个良好的水平可以有效的减少糖尿病患者的并发症。
[0003] α -葡萄糖苷酶存在于小肠粘膜绒毛的刷装缘。食物中的碳水化合物进入小肠后， 在该酶的作用下水解为单糖后被吸收，继而表现为餐后血糖的一个上升峰值。糖尿病患者 机体糖代谢紊乱，餐后血糖的异常升高不能迅速被胰岛素作用进行消除，长此以往会给机 体带来一些列严重的后果。α -糖苷酶抑制剂可以抑制碳水化合物的水解，降低糖尿病患者 在进食后的血糖水平，是目前比较公认的一种糖尿病治疗手段。
[0004]目前，市场上以α -糖苷酶为靶点的糖尿病治疗药物主要有阿卡波糖、米格列醇、 伏格列波糖等。阿卡波糖是第一个上市的α-糖苷酶抑制剂，但活性不强，日服用量大。米 格列醇的α-糖苷酶抑制活性较阿卡波糖强，但胃肠道不良反应发生率较高。目前国内应 用的α -糖苷酶抑制剂主要是进口或专利期药，价格相对较高，对多数长期服药的糖尿病 患者经济压力较大。
[0005] 化合物aszonalenin (1)和acetylaszonalenin (2)同为异戊烯基化的二肽类生物 碱，该类化合物主要来自费希新萨托菌的代谢产物，两者的分子结构颇为相似，存在如下共 性特征：即一分子色氨酸与一分子邻氨基苯甲酸，脱去两分子水，缩合成环后，在色氨酸分 子上对2-methylbut-3-en-2_yl取代基进行结构修饰。两个化合物的化学结构式分别如下 所示：
[0006]
[0007] 目前，关十前述购个化合物是贪具有α -糖苷酶抑制沽性的研％，尚禾见相关文 献报道；也就是说，能否将这两个化合物开发成糖苷酶抑制剂药物（重点是抗糖尿病药 物），在本领域中尚属研究空白地带。
【发明内容】
[0008] 本发明旨在提供化合物aszonalenin (1)和acetylaszonalenin (2)在制备糖苷酶 抑制剂药物（尤其是抗糖尿病药物）中的应用。
[0009] 本发明的技术方案具体如下：
[0010] 化合物aszonalenin和acetylaszonalenin在制备糖苷酶抑制剂药物中的应用， 所述化合物aszonalenin的结构式如式1所示，化合物acetylaszonalenin的结构式如式 2所示：
[0011]
[0012] 优选的，前述的糖苷酶抑制剂药物为抗糖尿病药物。
[0013] 药物组合物在制备糖苷酶抑制剂药物中的应用，所述药物组合物中含有有效量的 如前所述的化合物或其药用盐（即含有式1和/或式2的化合物或其药用盐）。本发明所 指的药用盐，是指具有药学上可接受的盐，有一定的药用价值。
[0014] 优选的，前述的糖苷酶抑制剂药物为抗糖尿病药物。
[0015] 优选的，药物组合物的剂型包括片剂、粉剂、混悬剂、胶囊剂、丸剂或糖浆。
[0016] 本发明的有益效果如下：
[0017] 本发明提供的化合物aszonalenin(l)和acetylaszonalenin(2)，属于异戊稀 基化的二肽类化合物，能够显著的抑制α -糖苷酶，且发明人经实验验证，发现其活性明 显优于上市药物阿卡波糖，效果显著；此外，化合物aszonalenin和acetylaszonalenin 的分子量均小于阿卡波糖，具有服用量少的优点；综上，化合物aszonalenin和 acetylaszonalenin具有开发成抗糖尿病候选药物的潜在价值。
【具体实施方式】
[0018] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但不限定本发明。下列实施例中的实验方 法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常 规生化试剂商店购买得到。
[0019] 实施例1 :化合物1和2的制备方法
[0020] I. 1发酵培养制备费希新萨托菌发酵物
[0021] 1)、菌种：费希新萨托菌购自德国生物资源保藏中心（DSMZ)，菌株编号为DSM 3700〇
[0022] 2)、菌种保存及活化
[0023] 斜面菌种制备：蔗糖 30. 0g，NaN033. 0g，MgSO4 · 7H20 0· 5g，KCl 0· 5g，FeSO4 · 7H20 10.0 mg，K2HPO4L Og，琼脂13. Og，蒸馏水lOOOmL，调节pH至7. 2。高温灭菌后制成斜面，将 所购买的菌种接入固体培养基斜面上，28°C下培养2-5天.结束后放置4°C冷藏备用。
[0024] 平板活化：马铃薯200g，葡萄糖（或蔗糖）20g，琼脂15-20g，自来水1000mL，pH值 自然，灭菌后制作平板。将斜面中的费希新萨托菌接入平板中，放置28°C下培养2-4天，待 用。
[0025] 3)、种子液制作及大规模发酵
[0026] 种子液制作：葡萄糖20g、麦芽提取物10g、酵母提取物4g、蒸馏水加至1L，以HCl 和NaOH调整培养基的酸碱值为pH 5. 5,分装于500ml的锥形瓶中，每瓶150ml，121°C高温 灭菌20min，冷却后接入上述平板中的费希新萨托菌，于28°C、150rpm条件下摇床震动培养 2-3天，作为种子液待用。
[0027] 大规模发酵培养基为潮湿的小麦麸，按重量比小麦麸：水1:0. 8-1:1.5,温度 25-30 °C，培养 15-30 天。
[0028] 接种量：小麦麸培养基体积的1 % -4 %。
[0029] 1. 2化合物1和2的提取分离方法
[0030] 将Neosartorya fischeri NRRL 181小麦鼓固体发酵后的80瓶培养基合并，捣碎 倒入渗漉桶内，95%乙醇渗漉7天，共收集提取液50L，50°C加热减压浓缩后得油状深黄色 浸膏（432. Og)。加蒸馏水溶解至3L，用1.0 L氯仿萃取，重复5次，有机相浓缩得到油状浸 膏（95. Og)。油状浸膏（95. Og)加适量氯仿和甲醇混合溶液溶解，加入柱层析硅胶混匀， 减压浓缩至干粉状，经硅胶柱层析粗分以石油醚：丙酮=20:1-1:1梯度洗脱得11个部位 Fr. I-Fr. 11。Fr. 8经MCI柱层析以甲醇：水=50:50-100:0梯度洗脱分离，得到7个部位 8A-8G。8E经硅胶柱回收氯仿：甲醇=500:2-500:5分离得到8E1-8E6,8E3经制备液相分 离（液相条件为头3011^11内甲醇的比例维持60%不变，30-601^11内甲醇比例从60%慢慢提 高到100%，流速为17ml/min，检测波长293nm)，45min出来的峰即化合物I (34mg)。Fr9经 MCI柱层析以甲醇：水=50:50-100:0梯度洗脱分离后，得到9个部分9A-9I。对9G用制 备液相进行分离得到832 1^化合物2(液相条件为2〇1^11内甲醇的比例从60%到63.3%， 流速为17ml/min，检测波长254nm，化合物2在18min出峰）。
[0031] 实施例2 :化合物1的理化性质和波谱数据
[0032] 化合物1 :无色透明结晶；分子式为C23H23N3O2，旋光[a ]2°D= +41. 538 (c =0. 26, CHCl3),其1H-匪R 和 13C-匪R 数据如下：?-匪R (500MHz, DMS〇-d6) δ H 10. 62(1H, s),7. 67(1H, dd, 7. 9, 1.4),7.45 - 7. 54 (1H, m), 7. 19 (1H, dd, 11.2,4.0),7. 13 (1H, d, 7. 4), 7. 08 (1H, d, 7. 8), 6. 95 - 7. 00 (1H, m), 6. 68 (1H, s), 6. 63 (2H, dd, 16. 0, 7. 9-),6. 11 (1H, dd, 17. 3, 10. 8), 5. 47 (1H, s), 4. 99 - 5. 18 (2H, m), 3. 99 (1H, dd, 8. 8, 7. 4), 3. 31 (1H, dd, 13. 9, 7. 2), 2. 30 (1H, dd, 13. 9, 9. I), I. 06 (3H, s), 0. 96 (3H, s) ； 1H 匪R (500MHz, CDCl3) δ η 7. 92 (1H, s)，7. 84 (1H, d, 7. 8)，7. 45 (1H, m)，7. 22 (1H, t, 7. 6)， 7. 16 (1H, d, 7. 5), 7. 09 (1H, t, 7. 4), 6. 90 (1H, d, 8. 2), 6. 72 (1H, t, 7. 4), 6. 62 (1H, d, 7. 9 ),6. 12 (1H, dd, 17. 6, 10. 6), 5. 59 (1H, s), 5. 14 (1H, d, 10. 5), 5. 11 (1H, d, 17. 6), 3. 99 (I H, t, 8. I), 3. 47 (1H, dd, 14. 2, 7. 6), 2. 42 (1H, dd, 14. 0, 9. 0), I. 13 (3H, s), I. 06 (3H, s)； 13C-匪R(125MHz, DMS0-d6) δ c 169. 3, 165. 9, 149. 2, 144. 2, 135. 4，132. 3, 131. I, 130.1 ,128. I, 126. 3, 124. 7, 124. 0, 121. 0, 117. 5, 113. 7, 108. 8, 80. 7, 60. 0, 56. 6, 41. 2, 33. 0, 22. 4,22. 3.以上波谱数据与文献报道[1]的化合物aszonalenin数据一致，为此化合 物 1 被确定为是 aszonalenin，参考文献为：[l]Yin W.B·，Grundmann A·, Cheng J·，Li S.M. :Acetylaszonalenin biosynthesis in Neosartorya fischeri. Identification of the biosynthetic gene cluster by genomic mining and functional proof of the genes by biochemical investigation.The Journal of biological chemistry 2009, 284(1) :100-109.
[0033] 结构式如下式所示：
[0034]
[0035] 实施例3 :化合物2的理化性质和波谱数据
[0036] 化合物2 :无色透明结晶；分子式为C25H25N3O3,旋光[a] 2°D= -335.71 ° (c = 0· 28, MeOH)，其1H-NMR 和 13C-NMR 数据如下,H-NMR (500MHz, DMS0-d6) δ η 10. 68 (1H, s) ,7. 81 (1Η, d, 7. 9), 7. 45 (2H, m), 7. 35 (1H, d, 7. 4), 7. 23 (1H, t, 7. 5), 7. 09 (3H, m), 6. 06 ( 1H, s), 5. 87(1H, dd, 17. 3, 10. 8), 5. 06 (2H, m), 3. 84(1H, t, 8. 3), 3. 20(1H, dd, 13. 7, 8. 3 ),2. 47 (3H, s), 2. 42 (1H, dd, 13. 7, 8. 4), I. 25 (1H, d, 12. 2), I. 10 (3H, s), 0. 92 (3H, s) !1H NMR (500MHz, CDCl3) δ η 8. 02 (1H, d, 7. 9)，7. 72 (1H, d, 7. 8)，7. 64 (1H, s)，7. 41 (1H, t, 7. 5), 7. 28 (1H, t, 7. 6), 7. 24 (1H, d, 7. 6), 7. 19 (1H, t, 7. 6), 7. 07 (1H, t, 7. 5), 6. 86 (1H, d, 8. 2), 5. 93 (1H, s), 5. 89 (1H, dd, 17. 5, 10. 4), 5. 15 (1H, d, 10. 4), 5. 12 (1H, d, 17. 5), 3. 90 (t, 8. 4), 3 .37 (1H, dd, 13. 9, 8. 5), 2. 59 (3H, s), 2. 45 (1H, dd, 13. 9, 8. 2), I. 20 (3H, s), 0. 99 (3H, s) ；13C NMR(125MHz, DMS〇-d6) δ c 169. 7, 168. 7, 165. 9, 143. 7, 141. 6, 135. I, 134. I, 132. I, 130. 0, 128. 3, 126. 9, 125. I, 124. 2, 123. 6, 120. 9, 117. 7, 113. 7, 81. 3, 59. 9, 56. 2, 40. 4, 29. 4, 24. 2 ，23. 0, 21. 9.以上波谱数据与前述的参考文献[1]报道的化合物acetylaszonalenin数据 一致，为此化合物2被确定为是acetylaszonalenin，结构式如下式所示：
[0037]
[0038] 实施例4 :化合物1和2的α -糖苷酶抑制活性
[0039] 4. 1仪器与试剂
[0040] 实验仪器：酶标仪（BIO-RAD iMark)。
[0041] 试剂样品：α -葡萄糖苷酶（sigma) ;PNPG(阿拉丁）；阿卡波糖（阿拉丁）；样品 aszonalenin 和 acetylaszonalenin 由实验室自制。
[0042] 4. 2测试方法：将25 μ 1糖苷酶的磷酸钾缓冲溶液（ρΗ6. 8)及100 μ 1含有不同浓 度化合物的磷酸钾缓冲溶液（PH6.8)加入96孔板中，混合均匀后在37°C孵育15min后，再 加入25 μ 1含有底物pNPG的磷酸缓冲溶液（pH6. 8)。在37°C下反应30min后加入1.0 M的 碳酸钠水溶液80 μ 1终止反应，用酶标仪读出405nm下的吸光度并计算抑制率。同时设置 空白组和阳性对照组，阳性对照药为阿卡波糖。根据不同浓度下抑制率计算出半数抑制浓 度（IC 5。)。化合物的IC5。值和阳性对照药阿卡波糖的IC5。值见下表。
[0043] 表1化合物1和2的α -糖苷酶抑制活性
[0046] 从表中数据可知，本发明涉及的化合物1和2属于异戊烯基化的二肽类生物碱，具 有很强的α-糖苷酶抑制活性，明显优于阳性对照药阿卡波糖。如化合物1的活性为阿卡 波糖的11倍多，化合物2的活性为阿卡波糖的2倍多。
[0047] 实施例5 :化合物2的体内降血糖（四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠）作用
[0048] 取健康昆明小鼠若干，适应性培养一周，随机取8只作为空白对照，即空白组。其 余小鼠在禁食12小时后注射200mg/kg的四氧嘧啶，72小时后尾巴取血，测空腹12小时的 血糖，血糖值大于15mmol/L的小鼠被确定为成功建模鼠。将建模成功的小鼠随机分成4组， 每组8只。统一于每天上午8:00-9:00给药一次，连续给药14天。第14天尾静脉取血测 定空腹12h血糖值。
[0049] 表2实验分组及测定结果
[0051] 注：相对于模型组，"*"p < 0· 05
[0052] 从统计结果我们可以看出，模型组、阳性组、高剂量组、低剂量组的血糖水平都显 著高于正常组。阳性组和高剂量组在两周的给药后血糖水平均有明显下降，低剂量组也有 一定的下降。
【主权项】
1. 化合物aszonalenin和acet^aszonalenin在制备糖巧酶抑制剂药物中的应用，所 述化合物aszonalenin的结构式如式1所示，化合物acet^aszonalenin的结构式如式2 所示：2. 根据权利要求1所述的化合物aszonalenin和acet^aszonalenin在制备糖巧酶抑 制剂药物中的应用，其特征在于，所述糖巧酶抑制剂药物为抗糖尿病药物。3. 药物组合物在制备糖巧酶抑制剂药物中的应用，所述药物组合物中含有有效量的如 权利要求1所述的化合物或其药用盐。4. 根据权利要求3所述的药物组合物在制备糖巧酶抑制剂药物中的应用，其特征在 于，所述糖巧酶抑制剂药物为抗糖尿病药物。5. 根据权利要求3所述的药物组合物在制备糖巧酶抑制剂药物中的应用，其特征在 于，所述药物组合物的剂型包括片剂、粉剂、混悬剂、胶囊剂、丸剂或糖浆。
【文档编号】A61K31/5517GK105982902SQ201510096374
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年3月5日
【发明人】单伟光, 王石磊, 占扎君, 应优敏, 马列峰, 陈艳, 吴睿, 唐岚
【申请人】浙江工业大学