专利名称：一种定量数字显微相衬成像的方法
技术领域：
本发明涉及一种定量数字显微相衬成像的方法，具体地说，是一种在普通数字光学显微镜平台上，不需要增加复杂的光学部件，基于数值算法实现相衬成像，提高透明或半透明样本成像的衬度，属于显微光学成像技术领域。
背景技术：
生物学及医学研究中，经常需要观察一些很重要的透明生物体或组织(如细胞)，由于光通过这类物体以后强度不发生显著变化，而相位会发生偏移，用普通透射显微镜成像时，生物体的结构将消失在其周围的介质中。为了在光学显微镜下观察与研究这类生物体，研究人员一般采用染色的办法，但是这种办法会给有机体的生命力带来有害的影响，而且多数沾染程序都需要对细胞或组织进行固定，这通常是比较复杂和困难的。相衬显微镜能够把光通过透明生物体后相位的变化转换为强度信息，从而方便观察透明组织的结构信息，因此在生物学、医学、材料学和晶体学等领域得到广泛应用。
但是，相衬显微镜需要昂贵、复杂的光学部件，且不同倍数的物镜需要不同相衬器件，调整困难；另外，利用相衬显微镜虽可以观察相位样本，却不能直接从观测样本图像定量地分析出相位信息。一种更好的方法就是把光通过透明生物体后相位的变化转换为强度信息来观察透明生物体的结构信息，这就是光学显微镜应用中的相位恢复问题。
相位恢复是数字显微相衬成像的关键技术。根据获取方式，显微相位恢复方法可以分为直接法和间接法。直接法是经典的、传统的相位恢复方法，如M.弗朗松著(张炳勋译)“相衬显微镜与干涉显微镜”文中所介绍的泽尔尼克相衬法。直接法是在显微镜上安装特定的光学部件，把相位样本结构所引起的相差信息转化为光强度信息，直接显示出来。该方法的缺点是这些光学部件昂贵、复杂，且不同倍数的物镜需要不同相衬器件，调整困难；另外，直接法虽可以提供好的相位样本的观察图像，但是不能直接地从观测样本图像定量地分析出相位信息。随着信息光学技术的发展，由光强度来恢复光相位的间接方法受到研究人员的重视，与直接相位恢复方法相比较，该类方法不需要复杂的光学部件，一般也不需要强的光源相干性。由光强度分布恢复相位的方法大体可分为两类迭代相位恢复算法体系和基于光强度传输方程(Transport of Intensity Equation，TIE)的相位恢复方法。由于迭代算法存在收敛性、解的存在性和唯一性等问题，在定量显微相位恢复及相衬成像领域，一般采用基于光强度传播方程的方法来恢复光的相位信息，如C.J.，贝拉尔、C.L.柯尔、B.E.阿尔曼等所著的“定量相位幅值显微镜IV厚样本成像.”文中通过建立并求解光强度传送方程恢复相位信息。基于光强度传输方程(Transport of Intensity Equation，TIE)的方法通过引入一个辅助函数，可以把光强度传输方程转化为一个二维Poisson方程。由于二维相位恢复问题的边界区域为矩形区域，离散化后的Poisson方程的块结构非常有规则，因此可用T.E.古热逸夫，K.A.纽根特.“利用光强度传播方程实现快速定量相位成像”中所描述的离散的Fourier分析方法或薛斌党、郑世玲、姜志国所著的“完全多重网格法求解光强度传播方程的相位恢复方法”文中所描述的多重网格方法(Multigrid method，MG)求解光强度传输方程。但是，如L.J.阿雷恩，M.P.奥克雷所著的.“基于错焦图像序列的相位恢复.”文中所分析的Fourier变换方法求解TIE实现相位恢复是一种近似数值解法，对复杂分布相位，该方法可能无法得到正确的结果。一般多重网格法求解光强度传输方程时，在每层网格上都需要给定初值，然后用Jacobi迭代法或者Gauss-Seidel迭代法解此层网格上的线性方程组，初值的选择影响光滑迭代的效率。初值接近真实解，算法迭代收敛速度会越快，否则，需要足够的循环后，才能达到所需收敛的收敛状态。
目前，国内在显微成像领域，定量相位恢复及其成像技术的研究和应用还是空白。在国外，IATIA公司(www.iatia.org.au)2002年推出了一个具有一定的定量相差分析功能的显微成像系统，并申请了专利，如K.A.纽根特，D.帕盖因，Anton，巴尔特.“辐射波场的相位测定”。但是，该系统仍然需要一个结构复杂、价格昂贵的相差管来获取显微图像序列；另外，该系统求解光强度传送方程时需要做严格的先验假设条件，而且定量相位恢复算法对噪声鲁棒性比较差。
发明内容
1、目的本发明的目的是提供一种定量数字显微相衬成像的方法，它克服了现有技术的不足，是一种鲁棒性高且不需要特殊光学部件的定量显微相衬成像技术，在普通光学明场透射光学显微镜平台上，通过本发明的相位恢复数值算法，快速实现定量显微相衬成像和定量相位分析。
2、技术方案 本发明具体实施所需设备条件是①一台普通明场光学透射数码显微镜系统，；②数字相位恢复用计算机为普通的PIV3.4Ghz 1G RAM微机，如附图1所示；③数码显微镜的物理参数为物镜40X，摄像头型号M1500，摄像头CCD芯片像素尺寸4.65微米，三目摄像接头0.65X，图像分辨率为696X520，比例尺为0.35微米/像素。
本发明具体实施所需环境条件是普通明场光学透射数码显微镜成像环境。
本发明在普通光学明场透射光学显微镜平台上，不需要特殊光学部件，用户只需要采集三幅样本的亮背景显微图像，通过本发明即可实现快速定量显微相衬成像和定量相位分析。
本发明是一种定量数字显微相衬成像的方法，该方法的具体步骤如下 步骤一建立光强度传播方程并对其进行离散化处理 在傍轴近似条件下，建立光强度传播方程并将其转化为一个椭圆型偏微分方程；然后，利用五点有限差分法，将转化的光强度传播方程离散化处理。
先定义一些符号λ表示波长；k＝2π/λ是波数；r⊥是平面x-y上的矢量，垂直于光轴Z；I(r⊥，z)为光的强度；φ(r⊥，z)为光的相位；是平面x-y上梯度算子；
为给定z，在由变量r⊥所确定的平面上，在光波传播方向上光强度的导数。
在傍轴近似情况下，光强度传播方程(Transport of Intensity Equation，TIE)可以表示为 设P是平面x-y中具有光滑边界
的一个区域，假设在区域P内，I(r⊥，z)＞0，同时假设
是连续的，那么在给定I(r⊥，z)和
时，TIE具有唯一解，即获取光强度沿光轴的变化率，通过求解TIE可以得到唯一的
由于不能精确测量光强在光轴方向的变化率，通常计算两个输出面上光强差分近似表示光强度变化率。
设输入面和输出面均垂直于光轴z，并设输入面位于z＝0平面上，输出面位于输入面前后平面即z＝±Δz平面上，不同平面上光的强度分布为I(r⊥，z0)、I(r⊥，zΔz)和I(r⊥，z-Δz)。光强度在光轴方向的变化率可以近似表示为 如果将方程(1)的左端扩展为 那末，可以将方程(1)改写为如下形式 利用五点有限差分法，可以将方程(3)离散化处理。同光强变化率计算方法相同，相位的偏导数根据如下公式近似计算 公式(4)中，h为x和y方向上相同的离散化采用间隔，(i，j)表示平面x-y上离散点的坐标位置。离散后的方程形式如下 方程(5)中， 为了描述方便，进一步将方程(5)简化为如下的椭圆型微分方程边值形式
其中，P是平面x-y中具有光滑边界Γ的一个区域，L是椭圆微分算子。已知输入平面和两个输出平面上光强度，就可以用多重网格方法求解方程(6)，实现输入平面上的相位恢复。
步骤二设计离散化后的光强度传播方程数值算法 本发明设计一种集成完全多重网格算法(Full Multigrid method，FMG)和预处理共轭梯度算法(Preconditioned conjugate gradient algorithm，P-CG)优点的混合算法，即FMG-CG算法，求解TIE，实现定量相位恢复。
FMG-CG算法求解光强度传播方程相位恢复的基本步骤如下 ①用五点有限差分法将TIE离散化，得到形如LΦ＝A的方程组； ②初始化Φ0，计算r0＝A-LΦ0，z0＝FMG(L，r0)，p0＝z0.j＝0； ③ ④Φj+1＝Φj+αjpj； ⑤rj+1＝rj-αjLpj； ⑥zj+1＝FMG(L，rj+1)； ⑦ ⑧pj+1＝zj+1+βjpj ⑨检验是否收敛，否则令j＝j+1，转上述③； FMG-CG算法中，本发明选择Jacobi迭代法作为光滑迭代算子，插值算子I2kk采用循环周期边界的分片线性插值算子，插值模板为一般选择插值算子的伴随算子作为限制算子，本发明选择半加权限制算子，限制算子模板为 步骤三光强度数据采集 在普通光学明场透射光学显微镜平台上，首先，采集焦平面上显微样本的图像。可以通过手动调焦的方式采集焦平面上实验用图像数据。对于自动显微镜，由于具有Z轴方向的自动聚焦功能，可以采用文献7中所介绍的自动聚焦算法，实施快速聚焦及图像采集。接着，控制载物台移动，在上下错焦平面上分别采集实验用图像数据。
步骤四定量相位恢复及相衬成像 基于上述采集的焦平面上图像和上下错焦平面上的两幅图像，计算强度在光轴方向的变化率，利用本发明的技术求解光强度传播方程(5)，实现定量相位恢复和显微相衬成像。
3、优点及效果本发明的定量显微相位成像技术与国外现有技术相比的优点在于①不需要特殊的光学部件如相位环、相位板或相差管等，可直接应用于普通明场光学显微镜平台的定量相衬成像；②可以处理复合光条件下的相位成像；③定量相位恢复方法对噪声鲁棒性高，对光源的相干性要求弱；④已经成功地基于普通光学明场透射光学显微镜实现了数字相衬成像；⑤本发明还可适用于其他模态的显微成像系统，如共聚焦显微镜成像系统的定量相位分析即相衬成像。
图1本发明中实验用成像明场光学显微镜及定量相位恢复计算机系统示意图； 图2本发明中基于FMG-CG算法求解TIE实现定量相位恢复流程图； 图3本发明中测试用模拟实验数据示意图，(a为模拟强度分布；b为模拟相位分布)； 图4本发明中基于测试用模拟实验数据，生成的不同焦平面上的光的强度分布(a为错焦距离Δz＝-0.1mm平面上光的强度分布；b为错焦距离Δz＝0.1mm平面上光的强度分布)； 图5本发明中基于测试用模拟实验数据，定量恢复的相位分布(a为多重网格求解光强度传播方程即MG-TIE相位恢复结果，b为完全多重网格求解光强度传播方程即FMG-TIE相位恢复结果，c为本发明方法求解光强度传播方程即FMG-CG-TIE相位恢复结果)； 图6本发明中基于普通光学明场透射光学显微镜，实现的定量相衬成像结果。(a为普通明场光学显微镜成像，b为基于焦平面和上下两个错焦平面上共三幅图像恢复的数字相衬成像)； 图中符号说明如下 1普通明场光学透射数码显微镜； 2普通计算机主机； 3普通计算机显示器。
具体实施例方式 本发明具体实施所需设备条件是①一台普通明场光学透射数码显微镜系统，；②数字相位恢复用计算机为普通的PIV3.4Ghz 1G RAM微机，如附图1所示；③数码显微镜的物理参数为物镜40X，摄像头型号M1500，摄像头CCD芯片像素尺寸4.65微米，三目摄像接头0.65X，图像分辨率为696X520，比例尺为0.35微米/像素。
本发明具体实施所需环境条件是普通明场光学透射数码显微镜成像环境。
本发明一种定量数字显微相衬成像的方法，该方法中定量相位恢复的流程如附图2所示。
该方法具体实施步骤如下 步骤一建立光强度传播方程并对其进行离散化处理 在傍轴近似情况下，光强度传播方程(Transport of Intensity Equation，TIE)可以表示为 上式中，λ表示波长；k＝2π/λ是波数；r⊥是平面x-y上的矢量，垂直于光轴Z；I(r⊥，z)为光的强度；φ(r⊥，z)为光的相位；是平面x-y上梯度算子；
为给定z，在由变量r⊥所确定的平面上，在光波传播方向上光强度的导数。
设P是平面x-y中具有光滑边界
的一个区域，假设在区域P内，I(r⊥，z)＞0，同时假设
是连续的，那么在给定I(r⊥，z)和
时，TIE具有唯一解，即获取光强度沿光轴的变化率，通过求解TIE可以得到唯一的
由于不能精确测量光强在光轴方向的变化率，通常计算两个输出面上光强差分近似表示光强度变化率。
设输入面和输出面均垂直于光轴z，并设输入面位于z＝0平面上，输出面位于输入面前后平面即z＝±Δz平面上，不同平面上光的强度分布为I(r⊥，z0)、I(r⊥，zΔz)和I(r⊥，z-Δz)。光强度在光轴方向的变化率可以近似表示为 如果将方程(1)的左端扩展为 那末，可以将方程(1)改写为如下形式 利用五点有限差分法，可以将方程(3)离散化处理。同光强变化率计算方法相同，相位的偏导数根据如下公式近似计算 公式(4)中，h为x和y方向上相同的离散化采用间隔，(i，j)表示平面x-y上离散点的坐标位置。离散后的方程形式如下 方程(5)中， 为了描述方便，进一步将方程(5)简化为如下的椭圆型微分方程边值形式
其中，P是平面x-y中具有光滑边界Γ的一个区域，L是椭圆微分算子。已知输入平面和两个输出平面上光强度，就可以用多重网格方法求解方程(6)，实现输入平面上的相位恢复。
步骤二设计离散化后的光强度传播方程数值算法 本发明设计一种集成完全多重网格算法(Full Multigrid method，FMG)和预处理共轭梯度算法(Preconditioned conjugate gradient algorithm，PCG)优点的混合算法，即FMG-PCG算法，求解TIE，实现定量相位恢复。
FMG-CG算法求解光强度传播方程相位恢复的基本步骤如下 ①用五点有限差分法将TIE离散化，得到形如LΦ＝A的方程组； ②初始化Φ0，计算r0＝A-LΦ0，z0＝FMG(L，r0)，p0＝z0.j＝0； ③ ④Φj+1＝Φj+αjpj； ⑤rj+1＝rj-αjLpj； ⑥zj+1＝FMG(L，rj+1)； ⑦ ⑧pj+1＝zj+1+βjpj ⑨检验是否收敛，否则令j＝j+1，转上述③. FMG-CG算法中，本发明选择Jacobi迭代法作为光滑迭代算子，插值算子I2kk采用循环周期边界的分片线性插值算子，插值模板为一般选择插值算子的伴随算子作为限制算子，本发明选择半加权限制算子，限制算子模板为 步骤三光强度数据生成及采集 本发明实验实施中，通过两种方式获取光强度数据。
方案一仿真实验数据 仿真实验选择3幅含有丰富细节的图像作为设想的输入焦平面上光强度和相位分布，分别如附图3(a)、图3(b)所示，其像元数为256×256，物理尺寸为1×1mm2，波长λ＝550nm，相位值在
弧度之间变化，强度值在
之间变化。利用文献8中所介绍的平面波角谱传播公式，计算不同输出平面上光强度分布，如附图4所示。
方案二明场光学显微镜平台上采集的光强度数据 在普通光学明场透射光学显微镜平台上，首先，采集焦平面上显微样本的图像。可以通过手动调焦的方式采集焦平面上实验用图像数据。对于自动显微镜，由于具有Z轴方向的自动聚焦功能，可以采用文献7中所介绍的自动聚焦算法，实施快速聚焦及图像采集。
接着，控制载物台移动，在上下错焦平面上分别采集实验用图像数据。
步骤四定量相位恢复及相衬成像 本发明实验实施中，设计两种方案进行相位位恢复及相衬成像实验。
方案一基于仿真实验数据的定量相位恢复 基于仿真实验数据进行定量相位恢复能够准确测试本发明的相位恢复效率及准确度。在PIV3.4Ghz 1G RAM微机上做模拟相位恢复实验。对比了MG法、FMG法和本发明方法(FMG-CG法)求解光强度传播方程相位恢复的计算效率和相位恢复精度。采用相对均方根误差(root mean square，RMS)定量评估相位恢复精度，它的定义为 其中，φijtrue表示输入面模拟真实相位某个元素(i，j)的相位值，φijrec表示相位恢复算法恢复的相位某个元素(i，j)的相位值。
另外，模拟相位恢复实验中，为了对比在相同初始解条件下，不同方法求解TIE的收敛速度和求解精度，光强度传播方程的初始解都假设为0。
利用仿真得到的不同输出平面上光的强度，通过求解TIE，恢复出输入面上光的相位信息如图5所示，其中多重网格的V循环迭代次数均设定为10次。附表1对比了三种方法求解TIE相位恢复的计算时间和相位恢复的相对均方根误差。
从上述相位恢复仿真实验结果可以看出，在相同初始值条件下，本发明的方法在相位恢复精度和算法收敛速度上都优于MG和FMG相位恢复的结果。
方案二明场光学显微镜平台上的相位恢复及相衬成像实验 在附图1所示MoticBA600普通明场光学透射数码显微镜系统进行定量相位恢复及相衬成像实验。基于采集的焦平面上图像和上下错焦平面上的两幅图像，计算强度在光轴方向的变化率，利用本发明的技术求解离散化处理后的光强度传播方程(5)，实现定量相位恢复和显微相衬成像。相衬成像结果如附图6所示，其中图6(a)所示为普通明场光学显微镜成像，6(b)所示为基于本发明方法实现的数字相衬图像。可以看出，相衬图像展现了样本的结构信息，便于观察样本不同区域的细节对比信息。
表1本发明基于仿真图像数据进行相位恢复实验的误差及算法效率比较。
权利要求
1、一种定量数字显微相衬成像的方法，它是在普通数字光学显微镜平台和普通个人用计算机上实现的，其特征在于该方法具体步骤如下
步骤一建立光强度传播方程并对其进行离散化处理
在傍轴近似条件下，建立光强度传播方程并将其转化为一个椭圆型偏微分方程；然后，利用五点有限差分法，将转化的光强度传播方程离散化处理；
符号定义为λ表示波长；k＝2π/λ是波数；r⊥是平面x-y上的矢量，垂直于光轴Z；I(r⊥，z)为光的强度；φ(r⊥，z)为光的相位；是平面x-y上梯度算子；
为给定z，在由变量r⊥所确定的平面上，在光波传播方向上光强度的导数；
在傍轴近似情况下，光强度传播方程TIE可以表示为
设P是平面x-y中具有光滑边界
的一个区域，假设在区域P内，I(r⊥，z)＞0，同时假设
是连续的，那么在给定I(r⊥，z)和
时，TIE具有唯一解，即获取光强度沿光轴的变化率，通过求解TIE可以得到唯一的
由于不能精确测量光强在光轴方向的变化率，通常计算两个输出面上光强差分近似表示光强度变化率；
设输入面和输出面均垂直于光轴z，并设输入面位于z＝0平面上，输出面位于输入面前后平面即z＝±Δz平面上，不同平面上光的强度分布为I(r⊥，z0)、I(r⊥，zΔz)和I(r⊥，z-Δz)；光强度在光轴方向的变化率可以近似表示为
如果将方程(1)的左端扩展为
那末，可以将方程(1)改写为如下形式
利用五点有限差分法，可以将方程(3)离散化处理；同光强变化率计算方法相同，相位的偏导数根据如下公式近似计算
公式(4)中，h为x和y方向上相同的离散化采用间隔，(i，j)表示平面x-y上离散点的坐标位置，离散后的方程形式如下
方程(5)中，
将方程(5)简化为如下的椭圆型微分方程边值形式
其中，P是平面x-y中具有光滑边界Γ的一个区域，L是椭圆微分算子；已知输入平面和两个输出平面上光强度，就可以用多重网格方法求解方程(6)，实现输入平面上的相位恢复；
步骤二设计离散化后的光强度传播方程数值算法
设计一种集成完全多重网格算法即FMG和预处理共轭梯度算法即P-CG优点的混合算法，即FMG-CG算法，求解TIE，实现定量相位恢复；
FMG-CG算法求解光强度传播方程相位恢复的基本步骤如下
①用五点有限差分法将TIE离散化，得到形如LΦ＝A的方程组；
②初始化Φ0，计算r0＝A-LΦ0，z0＝FMG(L，r0)，p0＝z0·j＝0；
③
④Φj+1＝Φj+αjpj；
⑤rj+1＝rj-αjLpj；
⑥zj+1＝FMG(L，rj+1)；
⑦
⑧pj+1＝zj+1+βjpj；
⑨检验是否收敛，否则令j＝j+1，转上述③；
FMG-CG算法中，选择Jacobi迭代法作为光滑迭代算子，插值算子I2kk采用循环周期边界的分片线性插值算子，插值模板为一般选择插值算子的伴随算子作为限制算子，在这里选择半加权限制算子，限制算子模板为
步骤三光强度数据采集
在普通光学明场透射光学显微镜平台上，首先，采集焦平面上显微样本的图像；可以通过手动调焦的方式采集焦平面上实验用图像数据；对于自动显微镜，由于具有Z轴方向的自动聚焦功能，可以采用自动聚焦算法，实施快速聚焦及图像采集；接着，控制载物台移动，在上下错焦平面上分别采集实验用图像数据；
步骤四定量相位恢复及相衬成像
基于上述采集的焦平面上图像和上下错焦平面上的两幅图像，计算强度在光轴方向的变化率，利用技术求解光强度传播方程，实现定量相位恢复和显微相衬成像。
全文摘要
本发明是一种定量数字显微相衬成像的方法，它是在普通数字光学显微镜平台和普通个人用计算机上实现的。该方法有四大步骤步骤一建立光强度传播方程并对其进行离散化处理；步骤二设计离散化后的光强度传播方程数值算法；步骤三光强度数据采集；步骤四定量相位恢复及相衬成像。本发明是在普通数字光学显微镜平台上，不需要增加复杂的光学部件，基于相位恢复数值算法实现相衬成像，提高透明或半透明样本成像的衬度，快速实现定量显微相衬成像和定量相位分析。它还适用于其他模态的显微成像系统。本发明在显微光学成像技术领域内具有广泛的实用价值和应用前景。
文档编号G02B21/00GK101576650SQ20091008659
公开日2009年11月11日 申请日期2009年6月12日 优先权日2009年6月12日
发明者薛斌党, 郑世玲 申请人:北京航空航天大学