专利名称：显微镜、区域判定方法和程序的制作方法
技术领域：
本公开涉及显微镜、区域判定方法和程序，其能够对于所拍摄的样本图像执行区域判定处理。
背景技术：
最近已经知道了如下的系统，其将由光学显微镜获得的生物有机体的细胞、组织等的放大图数字化，并且医生、病理学者等基于数字图像检查组织等并治疗病人。例如，通过虚拟载片(slide)设备，对被其中封入生物有机体的组织等的标本进行扫描并且产生组织等的数字图像。例如，日本专利公报No. 2010-197425包括关于如下所述的标本的描述，该标本用于通过显微镜观察诸如病理细胞的样本。如该专利文献的段落
和图5所述，样本被布置在载玻片(3)上并且在封入剂(5)位于中间的状态下叠置盖玻片(I)。由此，制造了标本(6)。
发明内容
当如上所述地产生生物有机体的组织等的数字图像时，将显微镜聚焦在封入在标本中的样本上是很重要的。然而，在制造标本时，经常在盖玻片和载玻片之间产生气泡。在这种情况下，在对标本进行扫描时，难以将显微镜聚焦在样本上。此外，例如在由通过成像获得的数字数据执行自动诊断时，也存在气泡部分被错误地包括在诊断目标区域并且妨碍正确诊断的可能性。考虑到上述内容，期望提供一种显微镜、区域判定方法和程序，即使在空气被包括在标本中的情况下，它们也能够将除了空气区域之外的区域判定为聚焦处理等的对象区域。根据本发明的实施例，提供了一种包括暗视野照明系统、成像单元和区域判定器的显微镜。暗视野照明系统将暗视野照明光照射到标本，在标本中，通过使用封入剂将样本封入在载玻片与盖玻片之间。成像单元拍摄利用暗视野照明光照射的标本的暗视野图像。区域判定器基于所拍摄的暗视野图像来检测封入剂与被包括在载玻片和盖玻片之间的空气之间的边界，并且将除了空气的区域之外的区域判定为对于样本的关心区域。在该显微镜中，暗视野照明光被照射到其中封入了样本的标本并且拍摄该标本的暗视野图像。暗视野图像是由暗视野照明光等产生的散射光的图像，并且基于暗视野图像检测在标本中的空气与封入剂之间的边界。因此,除了标本中的空气区域之外的区域可以被判定为作为聚焦处理的对象等的关心区域。区域判定器可以将在暗视野图像中形成闭区域的区域线检测为所述边界。在该显微镜中，形成闭区域的区域线被检测为边界。其允许容易检测空气与封入剂之间的边界。区域判定器可以将闭区域的内部区域与外部区域相比较，并将两者之一判定为关心区域。在该显微镜中，将闭区域的内部区域和外部区域进行比较，并且基于比较结果来判定关心区域。因此，可以可靠地判定关心区域。该显微镜还可以包括聚焦处理单元，其计算内部区域中的聚焦位置和外部区域中的聚焦位置。在这种情况下，区域判定器可以将计算得到的内部区域和外部区域的聚焦位置进行比较并判定关心区域。如上所述，内部区域中的聚焦位置和外部区域中的聚焦位置可以被比较，并且可以基于比较结果判定关心区域。该显微镜还可以包括照射器和反射光检测器。照射器将检测光照射到内部区域和外部区域的每一者。反射光检测器检测照射到内部区域和外部区域的检测光的反射光，在这种情况下，区域判定器可以判定在由反射光检测器检测到的、内部区域和外部区域的每一者的反射光中是否包括由空气的区域反射的反射光，并且基于判定结果来判定关心区域。如上所述，检测光可以被照射到内部区域和外部区域中的每一者，并且可以基于检测光的反射光来判定关心区域。根据本公开的一个实施例，提供了一种区域判定方法，包括将暗视野照明光照射到标本，在标本中，通过使用封入剂将样本封入在载玻片与盖玻片之间。拍摄利用暗视野照明光照射的标本的暗视野图像。基于所拍摄的暗视野图像来检测封入剂与被包括在载玻片和盖玻片之间的空气之间的边界，并且将除了空气的区域之外的区域判定为对于样本的关心区域。根据本公开的一个实施例，提供了一种用于使安装有计算机的显微镜执行包括照明、拍摄和检测的处理的程序。照明处理将暗视野照明光照射到标本，在标本中，通过使用封入剂将样本封入在载玻片与盖玻片之间。拍摄处理拍摄利用暗视野照明光照射的标本的暗视野图像。检测处理基于所拍摄的暗视野图像来检测封入剂与被包括在载玻片和盖玻片之间的空气之间的边界，并且将除了空气的区域之外的区域判定为对于样本的关心区域。该程序可以被记录在记录介质中。如上所述，根据本公开的实施例，即使在空气被包含在标本中时，仍然可以将除了空气区域之外的区域判定为聚焦处理等的对象区域。
图I是示出了根据本公开的第一实施例的显微镜的构造示例的示意图；图2A和图2B是示出了图I中示出的标本的构造示例的示意图；图3是示意性地示出图I中示出的标本台的平面图；图4是示出了标本被放置在图3中示出的标本台上的状态的图；图5是示出了边界检测用照明系统的示意性立体图，其作为根据第一实施例的暗视野照明系统；图6是示出了处于空气进入载玻片与盖玻片之间的状态的样本的平面图；图7是通过利用由亮视野照明的透射光对图6中示出的标本进行照明而拍摄的缩略图的图像；图8是通过利用由染色用暗视野照明的透射光对图6中示出的标本进行照明而拍摄的缩略图的图像；图9是通过根据实施例的边界检测用照明系统，利用由暗视野照明的透射光对图 6中示出的标本进行照明而拍摄的缩略图的图像；图10是示意性地示出了图I中示出的整体控制器的构造示例的框图；图11是示出了图I中示出的显微镜的操作示例的流程图；图12是包括气泡的标本的示意截面图；图13A和13B是示出了包括气泡的标本的放大图的局部的图；图14是示出了根据实施例的设置关心区域的处理以及拍摄关心区域的放大图的处理的流程图；图15A和图15B是示出了标本的暗视野图像的其它示例的平面图；图16是示意性地示出了具有图I中示出的整体控制器的功能的计算机的构造示例的框图；图17是示出了根据本公开的第二实施例的、设定关心区域的处理以及拍摄关心区域的放大图的处理的流程图；图18是用于解释如图17所示的设定关心区域的处理的图；图19是示出了图14中示出的显微镜的处理的修改示例的流程图；图20是示出了根据图17中示出的第二实施例的显微镜的处理的修改示例的流程图；并且图21是示出了用于图5中示出的边界检测用照明系统的修改示例的示意性立体图。
具体实施例方式现在将会参照附图描述本公开的实施例。〈第一实施例〉[显微镜]图I是示出了根据本公开的第一实施例的显微镜100的构造示例的示意图。显微镜100具有缩略图拍摄单元110，其拍摄其中封入了作为样本的生物样品的标本180的整体的缩略图。此外，显微镜100具有以预定放大率拍摄生物样品的放大图的放大图拍摄单元 120。在本实施例中，缩略图拍摄单元110具有成像单元的功能。图2A和图2B是示出了标本180的构造示例的示意图。图2A是标本180的平面图。图2B是在沿着标本180的短边方向延伸的线处的界面(沿着线A-A的截面图)。根据预定的固定技术，通过将生物样品190固定到载玻片160上制造标本180。在本实施例中，通过使用封入剂165将生物样品190封入载玻片160与盖玻片161之间。生物样品190例如由诸如血液之类的结缔组织、上皮组织或这两种组织二者的组织部分或者涂片细胞构成。这些组织部分和涂片细胞根据需要受到各种染色。染色的示例不仅包括普通染色(代表为苏木精曙红(HE)染色、姬姆萨染色(Giemsa staining)、巴氏染色(Papanicolaou staining)),还包括突光染色(诸如突光原位杂交(FISH)染色和酶抗体技术)。作为封入剂165，例如，使用通过将高分子聚合物溶解在芳香族有机物中而制备的药剂。然而，封入剂165的种类没有具体的限制。可以使用含有染色剂的封入剂。如图2A所示，描述了用于识别相应生物样品190的附属信息(例如，采集样品的人员的姓名，采集的日期和时间、以及染色剂的种类)的标签162被贴到标本180上。如图I所示,显微镜100具有其上放置标本180的标本台130。图3是示意性地示出了标本台130的平面图。图4是示出了标本180被放置在标本台130上的状态的图。如图3所示，在标本台130中形成了具有略小于标本180的面积的孔131。在标本台130的孔131周围，设置了固定标本180的外周181的突起132a到132c。突起132a在与孔131相对应的位置处支撑被放置在标本台130上的标本180的短边181a。突起132b和132c支撑标本180的长边181b。此外，在标本台130上，提供保持部133，其支撑作为短边侧181a与长边侧181b之间的角部182的对角角部的角部183。 如图3和图4所示，保持部133可绕枢转点133a枢转并且受到朝向孔131的偏向力。用于识别标本台130的位置的标记134a到134d被设置在标本台130的放置面138 上，在该放置面138上放置标本180。例如，标本台130的图像由缩略图拍摄单元等拍摄。 基于在该成像中标记134a到134d的成像位置，调整标本台130的位置。作为标记134a到 134d，例如使用以彼此不同的位置关系布置的白色圆圈和白色三角的一对标记。如图I所示,显微镜100具有沿着预定方向移动标本台130的标本台驱动机构 135。通过标本台驱动机构135，标本台130可以沿着与标本台表面平行的任意方向(X轴Y 轴方向)以及垂直于标本台表面的方向(Z轴方向)自由地移动。放大图拍摄单元120具有光源121、会聚透镜122、物镜123和成像元件124。此外，放大图拍摄单元120具有视野止挡件(未示出)等。根据本实施例的光源121设置在标本台130的与放置面138相反一侧的表面139 那侧。通过光源121来照射对受到一般染色的生物样品190进行照明的光(下文中，称作为亮视野照明光或者简称为照明光)。或者，可以通过光源121照射对受到特殊染色的生物样品190进行照明的光(下文中，称作为暗视野照明光)。或者，能够以交替的方式照射亮视野照明光和染色用暗视野照明光的单元可以被用作光源121。在这种情况下，两种类型的光源，S卩，照射亮视野照明光的光源以及照射染色用暗视野照明光的光源被设置为光源121。光源121也可以被设置在标本台130的放置面 138那侧。会聚透镜122将来自光源121的亮视野照明光和从染色用暗视野照明光的光源照射的暗视野照明光会聚到标本台130上的标本180上。以其光轴ERA作为放置在标本台 130的放置面138上的放大图拍摄单元120的基准位置的法线的方式，将该会聚透镜122布置在光源121与标本台130之间。以其光轴ERA作为放置在标本台130的放置面138上的放大图拍摄单元120的基准位置的法线的方式，将预定放大率的物镜123布置在标本台130的放置面138那侧。穿过放置在标本台130上的标本180的透射光由物镜123会聚并且在设置于物镜123的后侧 (即，照明光的行进目标侧)上的成像元件124上形成图像。在放大图拍摄单元120中，通过相应地改变物镜123，可以为各种放大率进行放大的方式对生物样品190进行成像。在成像元件124上，形成在标本台130的放置面138上具有预定横向宽度和纵向宽度的成像范围内的图像。即，生物样品190的一部分被成像为使其由物镜123放大。成像范围的尺寸根据成像元件124的像素尺寸、物镜123的放大率等决定。成像范围的尺寸充分地小于由缩略图拍摄单元110成像的成像范围。缩略图拍摄单元110具有光源111、物镜112和成像元件113。此外，缩略图拍摄单元110具有边界检测用照明系统(在图I中未示出)，来作为根据本实施例的暗视野照明系统。将会之后描述边界检测用照明系统的细节。光源111设置在标本台130的与放置面138相反侧的表面139那侧。作为光源 111，可以使用照射亮视野照明光的光源或者照射染色用暗视野照明光的光源。或者，可以使用以切换的方式照射这两种照明光的光源。光源111也可以被设置在标本台130的放置面138那侧上。以其光轴SRA为放置面138 (其上放置标本180)上的缩略图拍摄单元110的基准位置的法线的方式，预定放大率的物镜112被设置在标本台130的放置面138那侧上。穿过放置在标本台130上的标本180的透射光由该物镜112会聚并且在设置于物镜112的后方(即，成像光的行进目标那侧)的成像元件113上形成图像。在成像元件113上，形成在包括放置在放置台138上的标本180的整体的成像范围中的图像光(基本穿过标本180的整体的透射光)。形成在成像元件113上的该图像被获得为缩略图，该缩略图是通过对标本180的整体进行成像而获得的显微镜图像。此外，通过成像元件113，拍摄由边界检测用照明系统(之后对其进行描述)的暗视野照明光照射的标本180的缩略图。如图I所示，放大图拍摄单元120和缩略图成像单元110也被布置为使得光轴SRA 和光轴ERA (它们都是各个单元的基准位置的法线)沿着Y轴方向彼此分离距离D。该距离D被设计为使得保持放大图拍摄单元120的物镜123的镜筒(未示出)不落入成像元件 113的成像范围内。另一方面，距离D被设置为尽可能短以减小显微镜100的尺寸。上述成像元件124和113可以是一维成像元件或二维成像元件。图5是示出了作为根据本实施例的暗视野照明系统的边界检测用照明系统的示意立体图。边界检测用照明系统500具有发光二极管LED)环状照明器114，其利用暗视野照明光对标本180进行照射。LED环状照明器114被布置在放置于标本台130上的标本180 与成像元件113之间。即，其设置在与光源111相反的一侧。LED环状照明器114的位置和形状也被设计为使得暗视野照明光可以从标本180的边缘部分184那一侧倾斜地照明。暗视野照明光的照射角度可以被任意地设置。例如，可以以标本180被包括在环中的方式，将LED环状照明器114布置在与标本180基本相同的高度。此外，暗视野照明光可以从标本180的旁边照射。下文中将会描述由根据本实施例的边界检测用照明系统500的暗视野照明光照射的标本180的缩略图。图6到图9是用于该描述的图。如图6所示，当生物样品190被封入标本180中时，空气进入载玻片160与盖玻片CN 102540445 A
161之间并且在这种情况下产生气泡50。图7是通过利用亮视野照明的透射光照射该标本180而拍摄的缩略图210的图像。如图7所示，在封入剂165与气泡50之间的边界55处的对比度较低。因此，难以检测该边界55。图8是通过利用染色用暗视野照明的透射光照射该标本180而拍摄的缩略图220 的图像。如图8所示，也在缩略图220中，在封入剂165与气泡50之间的边界55处的对比度较低，并且难以检测边界55。图9是通过根据本实施例的边界检测用照明系统500的暗视野照明光照射而拍摄的缩略图200的图像。该缩略图200被拍摄为暗视野图像。如图9所示，在缩略图200中， 在封入剂165与气泡50之间的边界55处的对比度被强调。这是因为暗视野照明光在封入剂165与气泡50之间的边界55处被散射，并且被散射的光的图像等形成在成像元件113上。作为一般光的特性，具有短波长的光容易被散射(即，散射率较高)并且具有长波长的光难以被散射(即，散射率较低)。散射率根据波长而变化的散射被称为瑞利散射 (Rayleigh Scattering)。瑞利散射的散射率与波长的四次幂成反比。当光被散射到更大程度时，散射率的变化的差异可以被成像为更高程度的光的对比度差异，并且因此可以更清楚地检测边界55。因此，具有高散射率的短波长光(例如，蓝色、紫色或白色光)可以被用作为暗视野照明光。然而，暗视野照明光的波长可以被任意地设置。在本实施例中，LED照明器被用作为边界检测用照明系统。然而，照明系统不局限于此。例如，激光可以被用作为暗视野照明系统。如图I所示，显微镜100连接有用于控制显微镜100的各个模块的控制器。例如， 显微镜100连接有用于控制由显微镜100拥有的各种类型的光源(包括光源111、光源121 和LED环状照明器114)进行控制的照明控制器141。标本台驱动机构135连接到标本台驱动控制器142。缩略图拍摄控制器143连接到用于拍摄缩略图的成像元件113，并且放大图拍摄控制器144连接到用于拍摄生物样品190的放大图的成像元件124。这些控制器经由各种类型的数据通信路径连接到显微镜100的各个模块。如图I所示，控制显微镜100整体的总控制器150被分立地设置在显微镜100中。 上述各种控制器经由各种数据通信路径连接到总控制器150。总控制器150具有区域判定器等的功能。各个控制器和总控制器150由中央处理单元(CPU)、只读存储器(ROM)、随机存取存储器(RAM)、诸如硬盘驱动器(HDD)之类的存储装置、通信装置和算法电路等实现。当表明用于照明生物样品190的方法的信息从总控制器150输出到照明控制器 141时，照明控制器141基于该信息执行相应光源的照射控制。例如，如果照明光要由缩略图拍摄单元110的光源111照射，那么照明控制器141参照照明方法的信息并且判定成像模式。具体地，照明控制器141判定要执行以下模式中的哪种模式应当获取亮视野图像的模式(下文中，称作为亮视野模式)和应当获取暗视野图像的模式(下文中，称作为暗视野模式)。照明控制器141设置与用于光源111的模式相关的参数，并且使得光源111照射适合于该模式的照明光。由此，从光源111发射的照明光经由标本台130的孔131照射到生物样品190。由照明控制器141设置的参数的示例包括照明光的强度以及光源的种类的选择。如果要由放大图拍摄单元120的光源121照射的照明光，那么照明控制器141参照照明方法的信息并且判定执行亮视野模式还是暗视野模式。照明控制器141设置与用于光源121的模式相关的参数，并且使得从光源121照射适合于该模式的照明光。由此，从光源121发射的照明光经由标本台130的孔131照射到生物样品190。亮视野模式中的照射光通常是可见光。暗视野模式中的照射光通常是包括诸如能够激发用于特殊染色的荧光标记的波长的光。在暗视野模式中，荧光标记的背景部分被去掉。当表示用于对生物样品190进行成像的方法的信息从总控制器150输出到标本台驱动控制器142时，标本台驱动控制器142基于该信息控制标本台驱动机构135。例如，表示被拍摄的生物样品190的缩略图的信息从总控制器150输出到标本台驱动控制器142。 响应于该信息，标本台驱动控制器142控制标本台驱动机构135的驱动，并且沿着标本台表面方向(XY轴方向)移动标本台130。标本台130被移动为使得整个标本180落入成像元件113的成像范围内。此外,标本台驱动控制器142沿着与标本台表面垂直的方向移动标本台130 (Z轴方向，生物样品190的深度方向)，以进行物镜112的聚焦处理。当表示被拍摄的生物样品190的放大图的信息从总控制器150输出时，标本台驱动控制器142将标本台130从缩略图拍摄单元110移动到放大图拍摄单元120。以使得生物样品190被布置在会聚透镜122和物镜123之间的位置处的方式，使标本台130沿着标本台表面方向移动。此外，标本台130被移动为使得生物样品190的预定部分被布置在由成像元件124成像的成像范围内。此外,标本台驱动控制器142沿着Z轴方向移动标本台 130，以进行物镜123的聚焦处理。缩略图拍摄控制器143在成像元件113中设置与亮视野模式或暗视野模式相关的参数。此外，基于与形成在成像元件113的图像形成平面上的图像相关的输出信号，缩略图拍摄控制器143输出关于缩略图的成像数据。由缩略图拍摄控制器143设置的参数的示例包括曝光的开始时间和结束时间。放大图拍摄控制器144在成像元件124中设置与亮视野模式或暗视野模式相关的参数。此外，基于与形成在成像元件124的图像形成平面上的图像相关的输出信号，放大图拍摄控制器144输出关于放大图的成像数据。该图像数据被输出到总控制器150。图10是示意性地示出了总控制器150的构造示例的框图。总控制器150包括位置控制器151、图像处理器152、缩略图获取器153和放大图获取器154。位置控制器151执行位置控制处理，以将标本台130移动到目标位置。位置控制器151具有目标位置决定器151a、标本台图像获取器151b和标本台位置检测器151c。如果获取了缩略图，则由目标位置决定器151a决定标本台130的目标位置。标本台130的目标位置被设置为使得整个标本180落入成像元件113的成像范围内的位置。目标图像获取器151b经由照明控制器141驱动光源111 (该光源照射记号134a 到134d)等。随后，标本台图像获取器151b以预定时间间隔经由缩略图拍摄控制器143获取由成像元件113成像的整个成像范围的标本台图像。
标本台位置检测器151c计算所获取的标本台图像的各个像素与预先存储在 HDD(存储装置)中的标记134a到134d的形状数据之间的相关值。之后，标本台位置检测器151c计算在标本台图像中的标记134a到134d的位置。基于这些标本台图像中的各个标记的位置，通过采用例如存储在HDD中的对应表格来检测标本台130的实际位置。位置控制器151计算由目标位置决定器151a所决定的目标位置与由标本台位置检测器151c所检测的标本台130的位置之间的差异。之后，位置控制器151将该差异输出到标本台驱动控制器142。标本台驱动控制器142根据从位置控制器151提供的差异来控制标本台驱动机构 135，并且将标本台130移动到目标位置。每次获取由成像元件113拍摄的标本台图像时， 位置控制器151能够将该差异的信息输出到标本台驱动控制器142。根据本实施例的图像处理器152基于从缩略图拍摄控制器143输出的缩略图执行各种类型的处理。例如，基于通过边界检测用照明系统500进行照明而获得的缩略图200， 图像处理器152检测气泡50与封入剂165之间的边界55，类似图9所示。此外，图像处理器152将除了空气层区域51 (该区域是气泡50的区域)之外的区域判定为用于生物样品 190的关心区域195 (见图6)。之后将会描述这种处理的细节。通过成像处理器152，可以设置对象区域，从该对象区域拍摄多个放大图。此外， 通过图像处理器152，可以获得贴到标本180上的标签162的图像，并且可以去除由于标本 180中的异物等而产生的噪音。由图像处理器152产生的数据、参数等被输出到缩略图获取器153和放大图获取器154。缩略图获取器153要求缩略图拍摄控制器143基于例如用户对于显微镜100的操作在各种设置条件下拍摄缩略图。当标本180被放置在标本台130上时，用于自动地作出拍摄缩略图的请求。缩略图获取器153可以将从图像处理器152输出的缩略图的数据存储在预定存储部分中。或者，缩略图数据可以被缩略图获取器153经由通信部分(未示出)输出到设置在外部的图像数据存储服务器等。放大图获取器154要求放大图拍摄控制器144基于例如用户对于显微镜100的操作在各种设定条件下拍摄放大图。可以在拍摄标本180的缩略图之后自动地作出拍摄放大图的请求。放大图获取器154可以将从放大图拍摄控制器144输出的放大图的数据存储在预定存储部分中。或者，放大图数据可以被放大图获取器154经由通信部分(未示出)输出到设置在外部的图像数据存储服务器等。〈显微镜的操作〉图11是示出了根据本实施例的显微镜100的操作示例的流程图。标本台130被移动到缩略图拍摄单元110的光源111与物镜112之间的位置(步骤101)。标本180由边界检测用照明系统500的LED环状照明器114照射的暗视野照明光照射(步骤102)。拍摄标本180的暗视野图像(步骤103)。由此，产生如图9所示的缩略图200等。可以在拍摄缩略图200之后关闭暗视野照明光的照射。在所拍摄的缩略图200中检测对比度被强调的强调部分56 (步骤104)。该强调部分56被检测为标本180中的封入剂165与气泡50之间的边界55。
基于例如缩略图200的各个像素的亮度值来检测强调部分56。例如，亮度值大于预先设置的阈值的部分可以被检测为强调部分56。或者，可以通过使用频率成分或标准偏差值，检测强调部分56。此外，用于检测对比度的强调部分56的方法可以被任意地设置。基于所检测到的封入剂165与气泡50之间的边界55的信息，将除了空气层区域 51 (其为气泡50的区域)之外的区域判定为对于生物样品190的关心区域195。之后，对于关心区域195相应地执行聚焦处理等，并且扫描标本180 (步骤105)。图12以及图13A和图13B是用于解释对于标本180的聚焦处理的图。图12是包括气泡50的标本180的示意性截面图。图13A和图13B是示出了包括气泡50的标本180 的放大图的一部分的图像。在本实施例中，缩略图拍摄单元110和放大图拍摄单元120具有作为聚焦处理单元的自动聚焦机构。由自动聚焦机构计算聚焦位置，并且基于该聚焦位置设置焦点。如图12所示，通过封入剂165将生物样品190封入载玻片160与盖玻片161之间。 在载玻片160与盖玻片161之间产生气泡。这里，标本180的外部(空气)以及气泡50的内部的折射率N4的值被定义为I。假设载玻片160的折射率N1、封入剂165的折射率N2以及盖玻片161的折射率N3几乎彼此相等。此外，假设这些折射率的值大于空气的折射率的值，例如，I. 5。如图12所不,在对于不存在气泡50的关心区域195执行聚焦处理时,基于聚焦位置匕来设置焦点。图13A示出了在对于关心区域195的区域执行聚焦处理时获得的图片。另一方面，在对于气泡50中的空气层区域51执行聚焦处理时，基于聚焦位置F2来设置焦点。由于空气层区域51的折射率N4的值与盖玻片等的折射率N1到N3的值之间的差异，聚焦位置F2与聚焦位置F1不同。如图12所示，聚焦位置F2是比聚焦位置F1更深的位置，即，沿着Z轴方向离开物镜112的位置。图13B示出了在对于气泡50中的空气层区域51执行聚焦处理时，获得的图像。如刚刚所述的，如果气泡50进入标本180，那么在扫描标本180时难以将显微镜聚焦在作为诊断对象等的关心区域195上。此外，例如在基于所拍摄的放大图执行自动诊断时，由于在诊断对象的区域中包括了气泡50的一部分所以降低了正确诊断的可能性。此外，由于拍摄了气泡50中的无意义的部分，也将会存在所产生的放大图等的数字数据的尺寸变得不必要地过大的不利效果。在根据本实施例的显微镜100中，其中封入了生物样品190的标本180被边界检测用照明系统500的暗视野照明光照射。那么，将标本180的缩略图200拍摄为暗视野图像。在暗视野图像中，拍摄了由于在标本180中气泡50与封入剂165之间的边界55处的散射光而被强调的强调部分56。因此，强调部分56可以被检测为边界55。因此，标本180 中除了气泡50中的空气层区域51之外的区域可以被判定为关心区域195，使其受到聚焦处理等。此外，通过从自动诊断的诊断对象排除空气层区域51并且将关心区域195用作诊断对象而实现了正确诊断。此外，因为可以省略空气层区域51的成像，所以所产生的数字数据的尺寸可以被减小并且可以减轻处理资源的负担。下文中将会针对用于基于由边界检测用照明系统500用暗视野照明光照射的标本180的缩略图200(下文中称作为暗视野图像200)来设定关心区域195的方法给出说明。 图14是示出了设定关心区域195的处理以及拍摄关心区域195的放大图的处理的流程图。
从标本180的暗视野图像200检测闭区域和开区域(步骤201)。如图9所示，强调部分56作为形成闭区域57的区域线来发挥作用。即，在本实施例中，形成暗视野图像 200中的闭区域57的强调部分56被检测为气泡50与封入剂165之间的边界55。不是闭区域57的区域被检测为开区域58。例如，如果灰尘等附着到标本180上，可能在这些粘附部分处产生散射光。在这种情况下，可能将不是气泡50与封入剂165之间的边界55的部分拍摄为暗视野图像200中的强调部分56。然而，在本实施例中，形成闭区域57的强调部分56被检测为边界55。这允许容易地检测气泡50与封入剂165之间的边界55。图15A和图15B是示出了标本180的暗视野图像200的另一个示例的平面图。在图15A中，封入剂165被设置为遍布基本整个盖玻片161并且产生了多个气泡50。S卩，由强调部分56形成的闭区域57是气泡50，并且开区域58是关心区域195。在图15B中，封入剂165被滴落到与盖玻片161的一部分相对应的区域中。即，在图15B中，由强调部分56形成的闭区域57是关心区域195。开区域58是空气层区域51。如图15A和图15B所示，这里提到的闭区域57还包括由强调部分56以及载玻片 160或盖玻片161的边缘部分159形成的区域。在这种情况下，可以计算边缘部分159与形成闭区域57的强调部分56的比例。例如，如果边缘部分159的比率高于预定值，可以判定为该区域不是闭区域57。此外，闭区域57可以基于强调部分56的形状、强调部分56的长度等决定。以此方式，闭区域57或开区域58是否对应于关心区域195根据设置封入剂165 的方式而不同。因此，在本实施例中，测量所设置的闭区域57和开区域58中每一者的聚焦位置(步骤202)。聚焦位置(图12中示出的聚焦位置F1)更接近物镜112的那个区域被设定为关心区域195 (步骤203)。聚焦位置(图12中示出的聚焦位置F2)更远离物镜112的区域被设定为空气层区域51 (步骤204)。以此方式，在本实施例中，将闭区域57和开区域58 (换言之，闭区域57的内部区域和外部区域)彼此比较。之后，基于比较结果将两个区域之一设定为关心区域195。这允许可靠地判定关心区域195。按照放大图的视野的尺寸对标本180的整体进行划分。具体地，以用于拍摄放大图的成像范围的尺寸将标本180以网格方式划分(步骤205)。由此，限定了由放大图拍摄单元120成像的多个拍摄区域。关于每个拍摄区域(每个网格)，判定关心区域195和空气层区域51是否以混合的方式存在于拍摄区域中(步骤206)。如果判定为区域195和51都以混合方式存在(步骤206中为“是”)，那么从作为聚焦处理的对象的聚焦检测区域排除空气层区域51 (步骤 207)。即，关心区域195被设定为聚焦检测区域。基于被设定为聚焦检测区域的关心区域195来执行自动聚焦处理(步骤208)。基于所计算的聚焦位置来获得拍摄区域的放大图(步骤209)。如果在步骤206判定为关心区域195和空气层区域51没有以混合的方式存在于拍摄区域中，那么在步骤210中判定是否仅有关心区域195存在于拍摄区域中。如果判定为关心区域195不存在于拍摄区域中(步骤210中为“否”)，那么不获得该拍摄区域的放大图(步骤211)。如果在步骤210中判定为仅有关心区域195存在于拍摄区域中，那么基于该关心区域195执行自动聚焦处理(步骤212)。基于所计算的聚焦位置来获得该拍摄区域的放大图(步骤213)。在关于全部拍摄区域执行图14中示出的处理时，结束获得其中封入了生物样品 190的标本180的放大图的处理。图16的框图示意性地示出了具有根据本实施例的总控制器150的功能的计算机的构造示例。由总控制器150执行的处理可以由硬件执行或由软件执行。总控制器150包括CPU 10UR0M 102、RAM 103和主机总线104a。此外，总控制器150包括桥接器104、外部总线104b、接口 105、输入装置106、输出装置107、存储装置 (HDD) 108、驱动器109、连接端口 115和通信装置116。CPU 101具有算法处理装置和控制装置的功能，并且根据各种类型的程序来控制总控制器150中的一般操作。CPU 101可以是微处理器。ROM 102存储由CPU 101使用的程序、算法参数等。RAM 103临时地存储用于由 CPU 101执行的程序，在执行过程中相应地改变的参数等。这些单元通过由CPU总线等构成的主机总线104a彼此连接。主机总线104a经由桥接器104连接到外部总线104b (诸如外围组件互连/接口 (PCI)总线)。主机总线104a、桥接器104和外部总线104b不一定被分离地构造，并且这些功能可以被实施在一个总线中。输入装置106由用于用户的信息输入的输入单元(诸如鼠标、键盘、触摸板和按钮)和控制电路等组成，控制电路基于用户的输入产生输入信号并且将输入信号输出到 CPU 101。输出装置107例如包括显示装置和诸如扬声器的音频输出装置，显示装置例如液晶显示器(LCD)装置或有机发光二极管(OLED)装置。存储装置108是总控制器150的存储部分的一个示例并且是用于数据存储的装置。存储装置108例如包括存储介质、在存储介质中记录数据的记录装置、从存储介质读出数据的读取装置以及删除记录在存储介质中的数据的删除装置。存储装置108驱动硬盘并且存储由CPU 101执行的程序以及各种数据。驱动器109是用于存储介质的读取器/写入器，并且被设置为总控制器150的内置驱动器或外部驱动器。驱动器109读出记录于所装载的可移动记录介质(诸如磁盘、光盘、磁光盘或半导体存储器)中的信息并且将信息输出到RAM 103。连接端口 115是连接到外部设备的接口并且是能够与外部设备通过例如通用串行总线(USB)传输数据的连接端口。通信装置116是例如由用于连接到通信网络10的通信装置构成的通信接口。通信装置116可以是用于无线局域网(LAN)的通信装置、用于无线USB的通信装置或者执行有线通信的有线通信装置。〈第二实施例〉下文中将会描述根据本公开的第二实施例的显微镜。在下文中，省略与第一实施例的显微镜100中的那些部分相似的构造和操作的描述。
图17是示出了根据本实施例的、设定关心区域的处理的流程图以及拍摄关心区域的放大图的处理的流程图。图18是用于解释如图17所示的设定关心区域的处理的图。在根据本实施例的显微镜中，在图17中示出的步骤302到304中执行的设定关心区域的处理与由根据第一实施例的显微镜100进行的处理不同。图17中示出的步骤301 和步骤305到313与图14中示出的步骤201和步骤205到213相同。如图18所示，根据本实施例的显微镜具有高度检测器290，其基于标本台的放置面来检测标本180的高度(沿着Z轴方向的尺寸)，即，标本180的厚度。高度检测器290 具有照射器291和反射光检测传感器292，该照射器291利用激光对标本180的盖玻片进行照射，该反射光检测传感器292检测由盖玻片161反射的反射光Lp基于直到检测到来自于盖玻片161的反射光L1为止的时间、照射角等来检测标本180的高度。利用高度检测用激光照射在步骤301中检测到的闭区域57和开区域58中的每一者(步骤302)。如图18所示，如果空气层区域51存在于载玻片160与盖玻片161之间，那么来自于空气层区域51的反射光L2被高度检测器290的反射光检测传感器292检测到。 检测到从其而来的反射光L2的闭区域57或开区域58被设定为空气层区域51 (步骤303)。 没有检测到从其而来的反射光的闭区域57或开区域58被设定为关心区域195 (步骤304)。以此方式，在本实施例中，基于来自空气层区域51的反射光L2是否存在来设定关心区域195。激光照射器等可以被独立地设置为用于设定关心区域195的机构。在本实施例中，空气层区域51的反射光L2由用于检测标本180的高度的高度检测器290检测。这可以降低成本，而不需要提供额外的机构。此外，这有利于显微镜的尺寸减小。〈修改示例〉本公开的实施例不局限于上述实施例并且可以被不同地修改。图19是示出了图14中示出的显微镜100的处理的修改示例的流程图。在本修改示例中，图19中示出的步骤405和406的处理与图14中示出的处理不同。其他步骤与图 14中示出的那些相同。在步骤405中，执行自动区域检测处理。因此，决定用作由放大图拍摄单元120成像的拍摄区域的候选者。例如，基于利用亮视野照明光照射的标本180的缩略图，来自动地检测存在生物样品的区域。存在生物样品的区域被划分为多个拍摄区域，并且由此决定拍摄候选区域。此外，用于计算生物样品的位置信息的方法、用于决定拍摄候选区域的方法等可以被任意地设置。对于在步骤405中决定的拍摄候选区域中的每一者判定是否以混合方式存在关心区域和空气层区域(步骤406)。随后，执行上述步骤207到213。图20是示出了根据图17中示出的第二实施例的显微镜的处理的修改示例的流程图。在该修改示例中，同样在步骤505中执行自动区域检测处理，从而决定拍摄候选区域。 随后，在步骤506中，判定在每个拍摄候选区域中是否以混合方式存在关心区域和空气层区域。其他步骤的处理与图17中示出的那些相同。通过图19和图20中示出的自动区域检测处理和拍摄候选区域决定处理，可以省略获得不存在生物样品的部分的放大图的操作。因此，获取放大图的处理的负担被减轻了并且获取放大图的效率可以被加强。图21是示出了用于图5中示出的边界检测用照明系统500的修改示例的是以立体图。此边界检测用照明系统600具有四个LED条状照明器614，而不是图5中示出的LED 环状照明器114。由这些LED条状照明器614用暗视野照明光照射标本180。以此方式，可以使用一个或多个LED条状照明器614。其他构造可以被用作边界检测用照明系统。在第一实施例中，基于闭区域57和开区域58中的聚焦位置F1和F2来设定关心区域195。在第二实施例中，基于照射到闭区域57和开区域58的每一者上的检测光的反射状态来判定空气层区域51是否存在，并且判定关心区域195。然而，用于判定关心区域195 的方法不局限于这些方法，并且可以任意地设置。例如，可以获得每个区域57或58的亮视野图像，并且基于各个图像的亮度值的平均值、标准差等判定关心区域195。或者，可以基于区域57或58中每一者的亮视野图像的频率成分来判定关心区域195。在以上描述中，基于所判定的关心区域195来执行聚焦处理，并且由此获得合适的放大图。然而，利用所判定的关心区域195的处理不局限于聚焦处理。例如，关心区域195 可以被用作诊断对象区域。或者，关心区域195可以被用作用于检测标本180的厚度的检测光照射区域。此外，利用关心区域195的处理由根据本实施例的显微镜相应地执行。标本180中的空气层区域51与封入剂165之间的边界55的信息可以被相应地用于各种类型的处理。本技术包含的主题与2010年12月6日递交于日本专利局的日本在先专利申请JP 2010-271355中公开的主题相关，该专利申请的全部内容通过引用结合于此。本领域技术人员应当注意，只要在权利要求及其等同物的实旨和范围内，就可以根据设计需要和其他因素进行各种修改、结合、子结合和替换。
1权利要求
1.一种显微镜，包括暗视野照明系统，其构造为将暗视野照明光照射到标本，在所述标本中，通过使用封入剂将样本封入在载玻片与盖玻片之间；成像单元，其构造为拍摄利用所述暗视野照明光照射的所述标本的暗视野图像；以及区域判定器，其构造为基于所拍摄的暗视野图像来检测所述封入剂与被包括在所述载玻片和所述盖玻片之间的空气之间的边界，并且将除了所述空气的区域之外的区域判定为对于所述样本的关心区域。
2.根据权利要求I所述的显微镜，其中所述区域判定器将在所述暗视野图像中形成闭区域的区域线检测为所述边界。
3.根据权利要求2所述的显微镜，其中所述区域判定器将所述闭区域的内部区域与外部区域相比较，并将两者之一判定为所述关心区域。
4.根据权利要求3所述的显微镜，还包括聚焦处理单元，其构造为计算所述内部区域中的聚焦位置和所述外部区域中的聚焦位置，其中所述区域判定器将计算得到的所述内部区域和所述外部区域的聚焦位置进行比较并判定所述关心区域。
5.根据权利要求3所述的显微镜，还包括照射器，其构造为将检测光照射到所述内部区域和所述外部区域的每一者；以及反射光检测器，其构造为检测照射到所述内部区域和所述外部区域的所述检测光的反射光，其中所述区域判定器判定在由所述反射光检测器检测的、所述内部区域和所述外部区域的每一者的反射光中是否包括由所述空气的区域反射的反射光，并且基于该判定结果来判定所述关心区域。
6.一种区域判定方法，包括以下步骤将暗视野照明光照射到标本，在所述标本中，通过使用封入剂将样本封入在载玻片与盖玻片之间；拍摄利用所述暗视野照明光照射的所述标本的暗视野图像；以及基于所拍摄的暗视野图像来检测所述封入剂与被包括在所述载玻片和所述盖玻片之间的空气之间的边界，并且将除了所述空气的区域之外的区域判定为对于所述样本的关心区域。
7.一种用于使安装有计算机的显微镜执行处理的程序，所述处理包括以下步骤 将暗视野照明光照射到标本，在所述标本中，通过使用封入剂将样本封入在载玻片与盖玻片之间；拍摄利用所述暗视野照明光照射的所述标本的暗视野图像；以及基于所拍摄的暗视野图像来检测所述封入剂与被包括在所述载玻片和所述盖玻片之间的空气之间的边界，并且将除了所述空气的区域之外的区域判定为对于所述样本的关心区域
全文摘要
本发明提供了显微镜、区域判定方法和程序。显微镜包括暗视野照明系统，其构造为将暗视野照明光照射到标本，在标本中，通过使用封入剂将样本封入在载玻片与盖玻片之间；以及成像单元，其构造为拍摄利用暗视野照明光照射的标本的暗视野图像。显微镜还包括区域判定器，其构造为基于所拍摄的暗视野图像来检测封入剂与被包括在载玻片和盖玻片之间的空气之间的边界，并且将除了空气的区域之外的区域判定为对于样本的关心区域。
文档编号G02B21/32GK102540445SQ201110394178
公开日2012年7月4日 申请日期2011年11月29日 优先权日2010年12月6日
发明者成泽龙, 松延刚 申请人:索尼公司