专利名称：具有光可裂解的键的富含对映体的化合物以及与其有关的方法
技术领域：
本发明总的涉及富含对映体的化合物，具体地说，是具有一个或多个光可裂解的键的富含对映体的化合物，以及与其有关的方法，包括合成方法。
背景技术：
尽管DNA的放射性标记和荧光标记已在分子生物学和遗传学中广泛地用于检测目的，但对于高水平倍增来说标记物的数目太少，不适用于大规模、迅速地获得数据。现已开发了由小分子的可裂解的质谱标记物(CMST)组成的一类新的标记物，并已用于单核苷酸多态性(SNP)基因型测定和基因表达测量应用(参见例如PCT国际出版物WO 99/05319；WO 97/27331；WO 97/27327和WO 97/27325的一个方面)。该系统是基于CMST经由接头、诸如光可裂解的接头与寡核苷酸的共价连接。每个标记物具有对于指定的寡核苷酸序列来说特异性的不同的质量。例如，通过从寡核苷酸的光学裂解并同时用标准单四极质谱仪使用气压化学电离(APCI)进行检测，来鉴定是否存在等位基因或被表达的序列。
本发明提供了有益的标记物，包括可通过质谱法检测的标记物，以及它们的使用方法，正如本文中更充分公开的。
发明概述本发明提供了具有光可裂解的键的富含对映体的化合物，以及用富含对映体的光可裂解的标记物制备标记分子的方法。本发明的优点包括在需要将结构上类似的标记分子的各个成员分离开这样的情况下能够得到单个的不同产物，以及如本文中更充分公开的其他相关优点。
在一个方面，本发明提供了式(1)或(II)化合物 其中R1选自卤素和有机基团；R2和R3独立地选自氢和具有大于15道尔顿的质量的有机基团，其中R2和R3可以合在一起构成羰基，或者可以在一个环状结构中连接在一起；Z是不包括碳在内的(n+1)价的原子，其中n是大于0的整数；R4独立地选自氢、卤素和具有大于15道尔顿的质量的有机基团，条件是至少有一个R4(即R4a)是具有大于100道尔顿的质量的有机基团；R5在各种存在情况下，独立地为卤素或具有小于500道尔顿的质量的有机基团；m选自0、1、2、3和4；其中若R2＝R3＝H，则当Z(R4)n是-NH(CO)-CH(iBu)-NH(CO)-(CH2Ph或O-t-Bu)时R1不是CO2(H或CH3)，而当Z是OH时R1不是CH2CO2t-Bu；且其中若式(I)和(II)化合物均存在于混合物中，则该混合物中式(I)∶式(II)的摩尔比不是50∶50。
在本发明的不同实施方案中，Z是氮；R4a是可利用质谱法检测的；R2和R3各自为氢；R1包含合成或天然的生物学物质(例如核酸、蛋白质或糖)；和/或R4a具有小于10000道尔顿的质量和C1-500N0-100O0-100S0-10P0-10HαFβIδ的分子式，其中α、β和δ的总和足以使C、N、O、P和S原子的未得到满足的化合价得到满足。
在另一个实施方案中，R4a具有化学式T2-(J-T3-)p-；其中T2是由碳和一个或多个氢、氟、碘、氧、氮、硫和磷构成的、具有15-500道尔顿的质量的有机基团；T3是由碳和一个或多个氢、氟、碘、氧、氮、硫和磷构成的、具有50-1000道尔顿的质量的有机基团；J是直连键或选自酰胺、酯、胺、硫化物、醚、硫酯、二硫化物、硫醚、脲、硫脲、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、席夫碱、还原席夫碱、亚胺、肟、腙、磷酸酯、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、磺酸酯、氨磺酰或碳-碳键的官能团；p是1-50的整数，当n大于1时，各个T3和J独立地进行选择。
在另一个实施方案中，R4a具有包含如下的结构式 其中G是(CH2)1-6其中各个G的一个且仅有一个CH2基团上的氢被-(CH2)w-酰胺-T4代替；T2和T4是式C1-25N0-9O0-9S0-3P0-3HαFβIδ的有机基团，其中α、β和δ的总和足以使C、N、O、S和P原子的未得到满足的化合价得到满足；酰胺是 或 ；R10是氢或C1-10烷基；w是0-4的整数；n是1-50的整数，以使n大于1时，G、c、酰胺、R1和T4独立地进行选择。
本发明进一步提供了包含式(I)和/或式(II)化合物的组合物，其中该组合物中式(I)∶式(II)的摩尔比在95∶5至100∶0范围内，或者在5∶95至0∶100范围内。
本发明进一步提供了制备富含对映体的化合物的方法，该方法包括使下式化合物 其中Z选自氧、氮和硫，其中当Z是氧或硫时R6是氢，若Z是氮则R6选自氢和C1-C22烃且两个R6基团与Z键合；R5在各种存在情况下，独立地为卤素或具有小于500道尔顿的质量的有机基团；m选自0、1、2、3和4；R7是氢或有机基团，由实线和虚线代表的键表示单键或双键；与选自下列成员的试剂接触(a)酶；(b)酶和式H2N-C(＝O)-CHR8-NH-R9的辅助剂，其中R8是有机基团，R9是氨基保护基团；(c)手性酸；(d)手性胺；(e)氢和手性氢化催化剂；和(f)机械性晶体分离工具；以制得下式的富含对映体的化合物 在上文所确定的方法的一个实施方案中，要在该方法中发生反应的化合物具有以下结构式 其中R5在各种存在情况下，独立地为卤素或具有小于500道尔顿的质量的有机基团；m选自0、1、2、3和4；R7是氢或有机基团；该化合物与酶接触而得到下列结构式的富含对映体的化合物 在上文所确定的方法的另一个实施方案中，要在该方法中发生反应的化合物具有以下结构式 其中R5在各种存在情况下，独立地为卤素或具有小于500道尔顿的质量的有机基团；m选自0、1、2、3和4；R7是氢或有机基团；该化合物与酶和式H2N-C(＝O)-CHR8-NH-R9的辅助剂接触，其中R8是有机基团，R9是氨基保护基团；从而得到下列结构式的富含对映体的化合物 在上文所确定的方法的另一个实施方案中，要在该方法中发生反应的化合物具有以下结构式 其中R5在各种存在情况下，独立地为卤素或具有小于500道尔顿的质量的有机基团；m选自0、1、2、3和4；R7是氢或有机基团；该化合物与手性酸接触，得到下列结构式的富含对映体的盐 在上文所确定的方法的另一个实施方案中，要在该方法中发生反应的化合物具有以下结构式 其中R5在各种存在情况下，独立地为卤素或具有小于500道尔顿的质量的有机基团；m选自0、1、2、3和4；该化合物与手性胺接触，得到下列结构式的富含对映体的盐 在上文所确定的方法的另一个实施方案中，要在该方法中发生反应的化合物具有以下结构式 其中R5在各种存在情况下，独立地为卤素或具有小于500道尔顿的质量的有机基团；m选自0、1、2、3和4；该化合物在手性氢化催化剂的存在下与氢接触，得到下列结构式的富含对映体的化合物 在另一个方面，本发明提供了下式化合物 其中R5在各种存在情况下，独立地为卤素或具有小于500道尔顿的质量的有机基团；m选自0、1、2、3和4；R7是氢或有机基团；Z是SH或NR8，其中R8是氢或胺保护基团；且其中若式(V)和(VI)化合物都存在于混合物中，则该混合物中式(V)∶式(VI)的摩尔比不是50∶50。
在另一个方面，本发明提供了下式化合物 其中R5在各种存在情况下，独立地为卤素或具有小于500道尔顿的质量的有机基团；m选自0、1、2、3和4；R11是包括氨基亚膦酸基(phosphoramidite)或H-膦酸酯基团的官能基团；R12是具有15-10,000道尔顿的质量的有机基团；且其中若式(VII)和(VIII)化合物都存在于混合物中，则该混合物中式(VII)∶式(VIII)的摩尔比不是50∶50。
在一个实施方案中，在上述化合物中，R11的氨基亚膦酸基基团具有化学式-O-P(OR13)(N(R14)2)，其中R13和R14各自独立地选自烷基或具有一个或多个选自卤素和氰基的取代基的取代烷基，而两个R14基团可以与氨基亚膦酸基的氮一起键合构成杂环烷基。在另一个实施方案中，R11的H-膦酸酯基团包含式-O-P(＝O)(H)(O-+HN(R15)3)，R15独立地为C1-6烷基。
本发明的这些以及其他方面和实施方案在参考了以下的详细描述后将变得更为清晰可见。为此，本文中列出了各种参考文献，它们更详细地描述了某些操作、化合物和/或组合物，并完整地结合在此作为参考。
发明详述本发明提供了适于与核酸或所研究的其他分子偶联的标记物。当与DNA偶联时，该标记物提供了达到高产量基因型测定系统的方式。优选地，标记物和所研究的分子之间的接头在不引起标记物碎裂的条件下应当完全裂解。另外，标记物优选使每个注入的寡核苷酸产生一个峰，并给出关于离子流的最佳信号。并且，标记物优选对在测定形式中所用的PCR条件、HPLC和其他操作是稳定的。将标记物引入所研究的分子中的试剂应当可以良好的收率进行再生。在满足这些目的的优选方法中，研制了一种允许CMST成分被独立地优化的模块结构。CMST的成分优选包括不耐光的接头、质谱灵敏度增强剂(MSSE)和可变质量单位(VMU)，所有这些都通过支架连接在一起。
本发明提供了所研究的标记分子、所研究的标记分子的前体以及产生标记分子及其前体的方法，其中标记物是富含对映体的。通过使用富含对映体的前体，可促进前体的反应产物和所研究的分子的纯化，目的是得到所研究的纯化的标记分子。
因此，本发明提供了式(I)或式(II)化合物 其中R1选自卤素和有机基团；R2和R3独立地选自氢和具有大于15道尔顿的质量的有机基团，其中R2和R3可以合在一起构成羰基，或者可以在一个环状结构中连接在一起；Z是不包括碳在内的(n+1)价的原子，其中n是大于0的整数；R4独立地选自氢、卤素和具有大于15道尔顿的质量的有机基团，条件是至少有一个R4是具有大于100道尔顿的质量的有机基团；R5在各种存在情况下，独立地为卤素或具有小于500道尔顿的质量的有机基团；m选自0、1、2、3和4。本发明化合物是富含对映体的，于是若式(I)和(II)化合物均存在于混合物中，则该混合物中式(I)∶式(II)的摩尔比不是50∶50。
本发明化合物包括在苯环的1位上具有取代的甲基的2-硝基苯基，其中甲基的碳原子在本文中将称之为C1或苄基碳原子。除了2-硝基苯基以外，C1原子直接与氢原子(未显示)、碳原子(本文中称作C2)和非碳原子键合。
由于有2-硝基苯基，本发明化合物是光可裂解的。也就是说，本发明化合物将通过经历一个裂解反应而对与某些电磁辐射的接触作出反应，由此如以下结构式中所示，使取代的Z原子与C1分离，其中 指示对光解不稳定的键。 由于C1直接与唯一的一个不是碳或氢原子的原子键合，所以本发明化合物经历一个选择性光裂解反应。也就是说，C1-Z键可以通过适宜的光解条件而被选择性裂解，剩下其他C1键，如果不是完全完整的也是大半完整的。只要Z不是碳原子就可发生这种选择性裂解。在优选的实施方案中，Z选自氧、氮和硫。氧、氮和硫各自是位置Z的优选原子。
允许C1-Z键选择性裂解的光解条件多半不受2-硝基苯基环上其他取代的影响。因此，苯环上的任何一个或多个氢原子可以被相等数量的R5基团取代。因此，本发明化合物可以有大量(“m”)R5基团，其中m是选自0、1、2、3和4的整数。所需光裂解化学多半与R5基团的性质无关，所以R5基团可以是无机基团，例如卤素，或有机基团。一般说来，有机的R5基团是不太大的，因此具有小于约500道尔顿的质量。优选的R5基团选自C1-C22烃基。在优选的本发明化合物中，m等于0，于是2-硝基苯基环具有4个氢取代基。
经历了光裂解反应后，所得来自本发明化合物的含有Z的残基在本文中将被称作标记物。该标记物是、或者包括可检测部分，其中该术语指的是可以利用分析方法加以检测、并优选描述特性的部分。代表性的分析方法包括光谱测定或电位法。典型的光谱测定法包括质谱法、红外光谱法、紫外光谱法和荧光光谱法。典型的电位滴定法是恒电位电流滴定法。
为了提供有效的标记物，至少有一个R4基团是具有大于100道尔顿的质量的有机基团。该R4基团在本文中将称作第一R4基团(或R4a)。希望该标记物应当具有大于100道尔顿的质量的原因有许多。当标记物的质量小于100道尔顿时，可能难以鉴别标记物。例如，若利用质谱法鉴定标记物和描述其特性，则分子量小于100道尔顿的标记物可能难以与质谱仪的操作中固有的背景噪声区别开。
此外，本发明提供了含有大量本发明的非相同化合物的组合物，其中非相同化合物含有可以利用分析方法彼此区别开的非相同标记物。为了将大量非相同标记物区别开，标记物彼此间必须有足够的差异，以便分析方法可以检测到这些差异。为了得到例如用电位分析法显示出不同的适宜数量的标记物，这些标记物必须含有大量能以分析上显示出不同的非相同方式键合在一起的原子。当标记物具有小于100道尔顿的质量时，对分析上显示出不同的标记物的数量有不适当的限制。因此，为了使结构上有足够的可变性，并使检测容易而有效，标记物应当有超过100道尔顿的质量。
只要第一R4基团具有超过100道尔顿的质量，就可选出本发明化合物中其他R4基团的特性来达到一个或多个目标。例如，第二个或更多个的R4基团(例如R4b、R4c等)可以给出补充从第一个R4基团得到的信息的那些信息。在这种情况下，第二或更多个的R4基团也优选具有至少100道尔顿的质量。但是，在其他情况下，可能希望第二或以上的R4基团确实最多满足未得到满足的C1的价态，不干扰光裂解反应或标记物的检测，并且是在合成上容易形成的。在后一种情况下，第二或更多个的R4基团可能是氢或简单的烃基。在优选的实施方案中，第二或以上的R4基团，如果存在的话，是氢。
在本发明化合物中，R1选自卤素和有机基团，而R2和R3独立地选自氢和具有大于15道尔顿的质量的有机基团。如上所述，本发明化合物包括可检测部分，其中对可检测部分的检测和可选的特性描绘提供了有关本发明化合物的信息。在一个实施方案中，R1基团含有化合物的特征，有关其的信息是所需要的。例如，R1可包括来自个体的生物学物质，而标记物是该个体和/或特定生物学物质的特征。另一个例子是，R1基团可含有特定的合成核酸、肽或糖的序列，它们是由标记物独特地确定的。在另一个实施方案中，R1是可经历化学反应的活性化学基团，由此从生物学上衍生的物质可以与标记物光可裂解地连接。例如，R1可以是卤素原子，其在化学反应中可以被生物学物质或衍生的生物学物质代替。
R2和R3基团独立地选自氢和具有大于15道尔顿的质量的有机基团。一般说来，R2和R3基团的选择着眼于它们对选定用于连接R1与C1的化学的影响、和/或它们对使标记物与C1分离的光裂解反应的影响。当R2和R3各自为氢时，则R2和R3都不会对光裂解反应产生不利影响，且一般来说，它们与用于使R1与C1偶联的任何化学都是相容的。因此，R2和R3优选为氢。不过，R2和R3也可以是氢以外的基团。例如，R2和R3一起可以与C1构成羰基。另一方面，R1和R2可以与C1一起构成环状结构。作为另一个可供替代的选择，R2或R3可能是质量大于15道尔顿的有机基团，例如，C1-C22烃基。通常，烃基不会妨碍所需的光裂解反应，且不会妨碍R1/C1偶联化学。
本发明化合物的另一个特征在于C1原子是手性的。正如从式(I)和(II)可以看出的那样，C1上取代基的性质必然要求C1是手性的。另外，如果式(I)和(II)化合物是混合物形式，则式(I)化合物与式(II)化合物的摩尔比不是50∶50。在本发明的优选实施方案中，式(I)化合物不与式(II)化合物混合，反之亦然。此外，在式(I)化合物与式(II)化合物混合的情况下，式(I)化合物与式(II)化合物的摩尔比优选超过95∶5，或96∶4，或97∶3，或98∶2，或99∶1，或超过99.5∶0.5，或反过来说也是这样(即式(II)化合物与式(I)化合物的摩尔比优选超过95∶5，或96∶4，或97∶3，或98∶2，或99∶1，或超过99.5∶0.5)。
由于式(I)或(II)化合物不与或者仅最小限度地分别与式(II)或(I)化合物混合，所以有关式(I)或(II)化合物的色谱分离远比大量式(I)和(II)化合物彼此混合时要容易和有效得多。本发明提供了含有大量式(I)或(II)化合物的组合物，由于它们的同分异构结构，可以更容易地将它们彼此分离开，否则就将不是这种情况。这种得到增强的区别不同标记化合物的能力使得能够形成组合物，否则就将无法描述这些组合物的特性。
例如，当两种式(I)化合物因R1基团稍有差异而不同时，如果它们与在C1周围具有相同取代基的式(II)化合物(化合物IIA和IIB)混合，则可能无法有效地将这两种化合物(化合物IA和IB)分离开。这是因为化合物IA的色谱洗脱时间可能与化合物IIB的洗脱时间重叠和/或化合物IB的洗脱时间可能与化合物IIA的洗脱时间重叠。因此，由于来自化合物IIA和IIB的干扰，化合物IA和IB不能轻易地彼此解离开。本发明通过提供不带、或实际上不带式(II)化合物的式(I)化合物来解决该问题。
在另一个方面，本发明涉及使用规定试剂来制备富含对映体的化合物的方法。更具体地说，该方法作用于下式化合物 其中Z选自氧、氮和硫；其中当Z是氧或硫时R6是氢，若Z是氮则R6选自氢和C1-C22烃且两个R6基团与Z键合；R5在各种存在情况下，独立地为卤素或具有小于500道尔顿的质量的有机基团；m选自0、1、2、3和4；R7是氢或有机基团，由实线和虚线代表的键表示单键或双键。
本发明方法使如上文确定的化合物与试剂接触。所述试剂选自(a)酶；(b)酶和式H2N-C(＝O)-CHR8-NH-R9的辅助剂，其中R8是有机基团，R9是氨基保护基团；(c)手性酸；(d)手性胺；(e)氢和手性氢化催化剂；和(f)机械性晶体分离工具。化合物与试剂接触以便得到下列结构式的富含对映体的化合物 除了本文中公开的制备具有与富含对映体标记物的不耐光键的化合物的具体技术以外，在以下文献中可以找到其他合适的技术《有机合成中的不对称催化作用》，R.Noyori，John Wiley & Sons，New York，NY，1994；《不对称合成工艺》，D.J.Ager和M.B.East，CRC Press，Boca Raton，FL，1995；《不对称合成》，R.A.Aitken和S.N.Kilenyi编辑，Blackie Academic & Professional，Glasglow，U.K.，1992；《不对称合成》，J.Morrison编，Academic Press，Orlando，FL.(系列丛书，包括1984年卷和1985年卷)；《不对称合成》，R.G.Proctor，Oxford University Press，New York，NH，1996；《不对称合成使用氨基酸构造手性分子》，G.M.Coppola和H.F.Schuster，JohnWiley & Sons，New York，NY，1987；《催化不对称合成》，I.Ojima编，VCH Publishers，New York，NY，1993；《不对称合成中的手性辅助物和配基》，J.Seyden-Penne，John Wiley & sons，New York，NY，1995；《手性分离应用与技术》，S.Ahuja编，美国化学会，Washington D.C.，1996；《工业中的偏光力》I & II，A.N.Collins，G.N.Sheldrake和J.Crosby编，John Wiley & sons，New York，NY，1995和1997；《手性技术旋光化合物的工业合成》，R.A.Sheldon，Marcel Dekkar，New York，NY，1993；和《旋光对映体、消旋体和拆分》，J.Jacques，A.Collet和S.H.Wilen，John Wiley & Sons，New York，NY，1981。
本发明化合物和组合物，以及它们的制备方法，可以用于制备标记分子，其中标记物是富旋光性的，并且是光可裂解地与分子连接的。可以制备成按照本发明的富旋光性的形式的、带有光可裂解地连接的标记物的分子，以及可以用本发明的化合物和组合物实施的方法，列在例如PCT国际出版物WO 99/05319；WO 97/27331；WO 97/27327；WO 97/27325和WO 95/04160中。因此，本发明化合物可以代替这些出版物中公开的标记化合物，以及其中采用具有光可裂解地连接的标记物的分子的其他方法和测定法。
给出以下实施例是为了阐述本发明，而不是作为对本发明的限制。
实施例在下列实施例中，除非另有说明，否则化学反应物和试剂是标准商品级的，从商业供应机构得到，诸如Aldrich(Milwaukee，WI；www.sigma-aldrich.com)、Fluka(Aldrich的一个部门)和Lancaster Synthesis，Inc.(Windham，NH；http//www.lancaster.co.uk)。
实施例1用手性酸DTTA进行拆分将(±)-3-氨基-3-(2-硝基苯基)丙酸甲酯(24.6g，110mmol)和手性酸二-对甲苯甲酰-D-酒石酸(DTTA，42.4g，110mmol)通过加热至67℃而溶于500mL甲醇。将所得溶液冷却至56℃并加入晶种3-氨基-3-(2-硝基苯基)丙酸甲酯和DTTA的盐。使该混合物冷却至环境温度(21℃)并搅拌16小时。过滤收集所形成的结晶，得到富含一种对映体的白色固体(46％对映体过量，e.e.)。在甲醇中结晶一次得到12g非对映体纯度为88％的物质。
实施例2用手性酸(-)樟脑酸进行拆分将(±)-3-氨基-3-(2-硝基苯基)丙酸(172mg，0.82mmol)和手性酸(-)-樟脑酸(165mg，0.83mmol，Fluka)通过加热至回流而溶于5mL水中。将所得溶液冷却至环境温度(21℃)。过滤收集所形成的结晶，得到白色固体(105mg，31％收率)。利用手性高压液相色谱法(cHPLC，Chirobiotic T柱，5℃，20mM 75％醋酸铵缓冲液，pH 4.5和25％EtOH，检测器在215nm下)的分析显示产物是纯对映体。
实施例3用酶进行选择性水解将(±)-3-氨基-3-(2-硝基苯基)丙酸甲酯(60g，270mmol)溶于磷酸缓冲液(50mM，500mL)并调节至pH7。然后将在磷酸缓冲液(100mL)中的呈浆状的Amano PS酶(6g，10wt％，Amano酶(Milton Keynes，U.K.；Lombard IL，USA；www.amano-enzyme.co.jp))加入到该溶液中，将该反应混合物在环境温度(21℃)下搅拌24小时。完成后，滤出氨基酸沉淀，除去含水滤液，然后固体用二氯甲烷(DCM，2×10mL)洗涤。将该固体溶于盐酸水溶液(6M，150mL)，但仍剩余有细小的未知沉淀物，将其滤除。所得含水混合物用DCM萃取，通过调节pH至7使固体再次沉淀出来。由此得到所需的氨基酸(23g，90％收率)。
将最初的滤液碱化至pH8并首先用上面所收集的DCM洗涤液萃取；其次用新鲜的DCM萃取。将有机层合并、干燥并蒸发得到氨基乙酯(23g，80％收率)。在甲醇中的乙酯盐酸盐的旋光度为αD+127.55°(c＝1，20℃，589nm)。氨基酸和氨基乙酯的对映体过量(e.e.)均利用cHPLC测定，且均超过98％对映体纯度。
实施例4用于将富旋光性的标记物递送至所研究的分子的活性分子的合成本文中描述的标记物优选通过不耐光的键与所研究的分子缀合。优选的不耐光键存在于邻硝基苄基中(参见例如(a)Greenberg，M.M.；Gilmore，J.L.，《有机化学杂志》1994，59，746-753；(b)Yoo，D.J.；Greenberg，M.M.，《有机化学杂志》1995，60，3358-3364；和(c)Venkatesan，H.；Greenberg，M.M.，《有机化学杂志》1996，61，525-529)。邻硝基苄基中的分子内光致氧化还原反应(参见例如Pillai，V.N.R.，《合成》1980，1-26)使得标记物能够在中性条件(用254nm Hg灯照射6秒)下很快地从寡核苷酸裂解且没有碎裂。
因此，合成路线从(方案1)光敏性接头3-氨基-3-(2-硝基苯基)丙酸的酯化开始(ANP，1，参见例如Brown，B.B.；Wagner，D.S.；Geysen，H.M.《分子多样性》1995，1，4-12；和(b)Rodebaugh，R.；Fraser-Reid，B.；Geysen，H.M.《四面体快报》1997，38，7653-7656)，得到盐酸乙酯(2)，收率为84％。接着将2酶促转化得到乙酯单一异构体，这有助于寡核苷酸缀合步骤中的HPLC纯化。将该盐酸乙酯溶于水并用2N HCl调节至中性pH。加入磷酸缓冲液浆液形式的Amano PS酯酶。反应完成后，做碱性处理以除去水解的ANP副产物(4)，回收单一异构体乙酯(3，＞99％e.e.)(92％有效物质)。
方案1 赖氨酸提供了对于合成标记物的模块方法来说非常合适的支架。赖氨酸中存在的两个胺和一个羧酸基团提供了对稳健的肽化学过程的处理，得到了在标记物成分之间的酰胺键。肽在质谱中有可预测的行为，并且还对254nm的光相对稳定。正如方案2中可见，3与α-BOC-ε-Alloc-赖氨酸(5)的偶联使用EDACl(1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基-碳二亚胺盐酸盐，从Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI得到)和1-羟基苯并三唑(HOBT)进行，得到被保护的ANP赖氨酸(6)。用HCl除去BOC得到ε-Alloc-赖氨酸ANP酯(7)，为白色固体，从3的收率为81％。
全氟化芳族化合物可以在负离子型质谱法中用作用于分析目的的电泳标记物(参见例如(a)Abdel-Baky，S.；Klempier，N.；Giese，R.W.，《四面体》1990，46，5859；(b)Abdel-Baky，S.；Allam，K.；Giese，R.W.《分析化学》1993，65，498-499；(c)Trainor，T；Giese，R.W.；Vouros，P.《色谱杂志》1988，452，369-376；和(d)Saha，M.；Saha，J.；Giese，R.W.《色谱杂志》1993，641，400-404)。我们对MSSE候选者-标记物的电离成分的最初策略是，使各种电子少、氟化程度高的羧酸与典型的支架连接，并用负离子型APCI测量相对离子流。发生碎裂，得到多重峰且信号不佳。然后研究了用于相反电离方案的增强剂。给标记物加入吡啶基、脯氨酸基和哌啶基结构作为MSSE并在正离子型APCI中进行测试。利用所有标准，使用N-甲基异哌啶甲酸(INA)的标记物得到了出色的结果。
使用EDAC和三乙胺将INA盐酸盐与7偶联得到粗的Alloc-被护结构8，其用二乙胺、三苯基膦和醋酸钯去保护。所得核心结构(9)从反应混合物中结晶，通过过滤回收，收率为95％，为黄色固体。
方案2 为了得到一大组具有不同分子量的可检测标记物，将核心结构9与称之为可变质量单位(VMU)的一组45个羧酸衍生。VMU的质量间隔最小4 a.m.u.，以将标记物之间的同位素重叠减到最小。VMU的分子量范围是90-298 a.m.u.。优选的VMU不具有下列性能或特性(1)与合成序列、诸如酯的不相容的官能度；(2)具有多种同位素的元素(Cl，Br，S)；(3)可能导致竞争性光化学过程的官能度(碘化物、酰基-和芳基-苯酮)；(4)消旋酸，和(5)缺乏商业上的可利用性。使用HATU和N-甲基吗啉使VMU与9偶联。利用柱色谱法纯化后，以可变的收率回收CMST乙酯(10)。10用NaOH皂化以定量收率得到CMST酸(11)。至于最后的步骤，使用三氟乙酸四氟苯基酯(TFP TFA，参见例如Green，M.；Berman，J.《四面体快报》1990，31，5851-5852；TFP TFA以和三氟乙酸五氟苯基酯的类似方式制备并使用，因为四氟苯环上的质子充当鉴定NMR检查)和11的碱催化的酯基转移作用使形成活性酯，从而以可变收率得到CMST TFP酯(12)。选择四氟苯基活性酯是因为副产物容易去除和对寡核苷酸缀合条件的相对稳定性和相容性。按照Lukhtanov等的方法(参见例如Lukhtanov，E.A.；Kutyavin，I.V.；Gamper，H.B.；Meyer，R.B.《生物缀合化学杂志》1995，4，418-426)使CMSTTFP酯与5’-氨基己基-结尾的寡核苷酸(从TriLink Biotechnology，San Diego，CA购得)缀合。
方案3 标记物的数量通过增加使用酪氨酸衍生物而进一步扩展，酪氨酸衍生物起总质量调节剂的作用(GMA，更具体说是N-Boc-O-乙基-L-酪氨酸，其可在商业上从Bachem California(Torrance，CA)定购或通过N-Boc-L-酪氨酸-OMe以86％的收率用碘化乙烷和碳酸铯烷基化、接着用NaOH定量水解来制备)，扩展使得裂解的标记物的分子量增加了191 a.m.u.，并得到了将要再次用于更高分子量标记物的VMU集合。如方案4中所示，将GMA与核心结构9偶联。碱处理后，通过过滤分离BOC-被护的GMA结构。用TFA去保护以定量收率得到GMA单体核心结构(13，n＝1)。VMU用如前述相同的方式偶联，得到另外的标记物集合(14)。使用4个单位的质量调节剂，可以合成总共约200个标记物。
方案4a a(a)EDAC，HOBT，THF；(b)TFA，DCM；(c)VMU，HATU，NMM；(d)IN NaOH，THF；(e)TFP TFA，DIEA，DMF从前面的描述可以领会到尽管在本文中出于说明的目的已描述了本发明的具体实施方案，但在不背离本发明的精神和范围的情况下可以做各种改变。因此，本发明只受所附的权利要求书的限制。
权利要求
1.式(1)或式(II)化合物 其中R1选自卤素和有机基团；R2和R3独立地选自氢和具有大于15道尔顿的质量的有机基团，其中R2和R3可以合在一起构成羰基，或者可以在一个环状结构中连接在一起；Z是不包括碳在内的(n+1)价的原子，其中n是大于0的整数；R4独立地选自氢、卤素和具有大于15道尔顿的质量的有机基团，条件是至少有一个R4(即R4a)是具有大于100道尔顿的质量的有机基团；R5在各种存在情况下，独立地为卤素或具有小于500道尔顿的质量的有机基团；m选自0、1、2、3和4；其中若R2＝R3＝H，则当Z(R4)n是-NH(CO)-CH(iBu)-NH(CO)-(CH2Ph或O-t-Bu)时R1不是CO2(H或CH3)，而当Z是OH时R1不是CH2CO2t-Bu；且其中若式(I)和(II)化合物均存在于混合物中，则该混合物中式(I)∶式(II)的摩尔比不是50∶50。
2.权利要求1化合物，其中Z是氮。
3.权利要求1化合物，其中R4a可利用质谱法检测。
4.权利要求1化合物，其中R4a具有小于10,000道尔顿的质量和C1-500N0-100O0-100S0-10P0-10HαFβIδ的分子式，其中α、β和δ的总和足以使C、N、O、P和S原子的未得到满足的化合价得到满足。
5.权利要求1化合物，其中R4a具有化学式T2-(J-T3-)p-；其中T2是由碳和一个或多个氢、氟、碘、氧、氮、硫和磷构成的、具有15-500道尔顿的质量的有机基团；T3是由碳和一个或多个氢、氟、碘、氧、氮、硫和磷构成的、具有50-1000道尔顿的质量的有机基团；J是直连键或选自酰胺、酯、胺、硫化物、醚、硫酯、二硫化物、硫醚、脲、硫脲、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、席夫碱、还原席夫碱、亚胺、肟、腙、磷酸酯、膦酸酯、磷酰胺、膦酰胺、磺酸酯、氨磺酰或碳-碳键的官能团；和p是1-50的整数，当n大于1时，各个T3和J独立地进行选择。
6.权利要求1化合物，其中R4a具有包含如下的结构式 其中G是(CH2)1-6其中各个G的一个且仅有一个CH2基团上的氢被-(CH2)w-酰胺-T4代替；T2和T4是式C1-25N0-9O0-9S0-3P0-3HαFβIδ的有机基团，其中α、β和δ的总和足以使C、N、O、S和P原子的未得到满足的化合价得到满足；酰胺是 或 R10是氢或C1-10烷基；w是0-4的整数；和n是1-50的整数，以使n大于1时，G、c、酰胺、R1和T4独立地进行选择。
7.权利要求1化合物，其中R2和R3各自为氢。
8.权利要求1化合物，其中R1包含合成或天然的生物学物质。
9.权利要求8化合物，其中R1包含核酸、蛋白质或糖。
10.包含权利要求1化合物的组合物，其中式(I)∶式(II)的摩尔比在95∶5至100∶0范围内，或者在5∶95至0∶100范围内。
11.制备富含对映体的化合物的方法，该方法包括使下式化合物 其中Z选自氧、氮和硫，其中当Z是氧或硫时R6是氢，若Z是氮则R6选自氢和C1-C22烃且两个R6基团与Z键合；R5在各种存在情况下，独立地为卤素或具有小于500道尔顿的质量的有机基团；m选自0、1、2、3和4；R7是氢或有机基团，由实线和虚线代表的键表示单键或双键；与选自下列成员的试剂接触(a)酶；(b)酶和式H2N-C(＝O)-CHR8-NH-R9的辅助剂，其中R8是有机基团，R9是氨基保护基团；(c)手性酸；(d)手性胺；(e)氢和手性氢化催化剂；和(f)机械性晶体分离工具；制得下式的富含对映体的化合物
12.权利要求11的方法，其中下式化合物 其中R5在各种存在情况下，独立地为卤素或具有小于500道尔顿的质量的有机基团；m选自0、1、2、3和4；R7是氢或有机基团；与酶接触而得到下列结构式的富含对映体的化合物
13.权利要求11的方法，其中下式化合物 其中R5在各种存在情况下，独立地为卤素或具有小于500道尔顿的质量的有机基团；m选自0、1、2、3和4；R7是氢或有机基团；与酶和式H2N-C(＝O)-CHR8-NH-R9的辅助剂接触，其中R8是有机基团，R9是氨基保护基团；从而得到下列结构式的富含对映体的化合物
14.权利要求11的方法，其中下式化合物 其中R5在各种存在情况下，独立地为卤素或具有小于500道尔顿的质量的有机基团；m选自0、1、2、3和4；R7是氢或有机基团；与手性酸接触，得到下列结构式的富含对映体的盐
15.权利要求11的方法，其中下式化合物 其中R5在各种存在情况下，各自独立地为卤素或具有小于500道尔顿的质量的有机基团；m选自0、1、2、3和4；与手性胺接触，得到下列结构式的富含对映体的盐
16.权利要求11的方法，其中下式化合物 其中R5在各种存在情况下，各自独立地为卤素或具有小于500道尔顿的质量的有机基团；m选自0、1、2、3和4；在手性氢化催化剂的存在下与氢接触，得到下列结构式的富含对映体的化合物
17.式(V)或式(VI)化合物 其中R5在各种存在情况下，独立地为卤素或具有小于500道尔顿的质量的有机基团；m选自0、1、2、3和4；R7是氢或有机基团；Z是SH或NR8，其中R8是氢或胺保护基团；且其中若式(V)和(VI)化合物都存在于混合物中，则该混合物中式(V)∶式(VI)的摩尔比不是50∶50。
18.式(VII)或式(VIII)化合物 其中R5在各种存在情况下，独立地为卤素或具有小于500道尔顿的质量的有机基团；m选自0、1、2、3和4；R11是包括氨基亚膦酸基或H-膦酸酯基团的官能基团；R12是具有15-10,000道尔顿的质量的有机基团；且其中若式(VII)和(VIII)化合物都存在于混合物中，则该混合物中式(VII)∶式(VIII)的摩尔比不是50∶50。
19.权利要求18化合物，其中R11的氨基亚膦酸基部分具有化学式-O-P(OR13)(N(R14)2)，其中R13和R14各自独立地选自烷基或具有一个或多个选自卤素和氰基的取代基的取代烷基，而两个R14基团可以与氨基亚膦酸基的氮一起键合构成杂环烷基。
20.权利要求18化合物，其中R11的H-膦酸酯部分包含式-O-P(＝O)(H)(O-+HN(R15)3)，R15独立地为C1-6烷基。
全文摘要
本发明提供了式(I)或(II)化合物:其中R
文档编号C07F9/141GK1371356SQ00812153
公开日2002年9月25日 申请日期2000年8月31日 优先权日1999年8月31日
发明者B·M·斯凯德, S·J·法尔康布里奇, S·B·D·温特, C·J·洛克 申请人:佳根基因组学公司