一种含有五羟黄酮衍生物活性成分的骨质疏松症治疗剂的制作方法

专利名称：一种含有五羟黄酮衍生物活性成分的骨质疏松症治疗剂的制作方法
背景技术：
目前使用的用于骨质疏松症的治疗剂包括雌激素制剂、雄性促蛋白合成类固醇制剂、钙补充剂、磷酸盐制剂、氟化物制剂、异丙氧黄酮、维生素D3等。近年，已经开发出了用于骨质疏松症的新型药物，其中包括Merck公司(美国)在1995年开发的氨基双膦酸酯(Aminobisphosphonate)和Eli Lilly公司(美国)在1997年开发的在选择性雌激素受体调节剂(SERM)中发挥作用的雷洛昔芬(Raloxifene)。
上述骨质疏松症治疗剂主要是雌激素物质，已知雌激素能够导致如癌症、胆石症和血栓症等不良副作用。由于骨质疏松症的治疗中不可避免地长期给药，因此始终存在着开发出即使长期给药也具有高度安全性的能够替代雌激素的新型有效药物的需求。
据报道，植物雌激素，如大豆异黄酮可作为雌激素的替代品。1946年首次报道了在检验三叶草病的成因的过程中发现的植物雌激素，三叶草病由以红三叶草(Trifolium subterraneum var.Dwalganup)为食的绵羊高发(高于30％)不孕而命名。三叶草病的起因被证实为一种含在植物中的类似雌激素的异黄酮，因此，植物中含有的这种化合物被命名为“植物雌激素”。此后报道的作为植物雌激素的化合物包括异黄酮化合物，如大豆黄酮、染料木黄酮、芒柄花素和鹰嘴豆素甲；香豆甾烷(coumestan)化合物，如香豆雌酚；木酚素化合物，如肠内酯和酚化合物，如肠二醇。此类植物雌激素主要以糖苷配基、6′-氧-乙酰基葡糖苷或6′-氧-丙二酰基葡糖苷的形式存在，大豆黄酮和染料木黄酮以7-氧-葡糖苷的形式存在。在上述化合物中，已知葡糖苷被肠细菌和胃酸水解并以糖苷配基的形式吸收，糖苷配基是一种游离的异黄酮。研究表明，上述植物雌激素发挥的作用与动物雌激素类似。即，植物雌激素通过与雌激素受体结合抑制乳腺癌细胞的增殖并被报道作为雌激素的替代品用于心血管疾病和在绝经期后的女性中出现的其他症状的治疗。但是，由于药效不充分并且需要高成本地从天然产品中分离和纯化，所述的植物雌激素没有广泛地用于治疗和预防骨质疏松症。
在这种情况下，有充分的理由开发和探索用于治疗和预防骨质疏松症的安全有效的可选择的化合物，并且能够以经济的方式制备此类化合物。
因此，本发明的一个主要目的是提供一种骨质疏松症的治疗剂，该治疗剂含有五羟黄酮衍生物活性成分。本发明的详细描述本发明提供了一种骨质疏松症的治疗剂，该治疗剂含有由下列通式(I)所代表的五羟黄酮衍生物活性成分和可药用的载体 其中，R1是龙胆三糖、吡喃型葡萄糖、氧-呋喃型阿拉伯糖、氧-二吡喃型葡萄糖、氧-吡喃型半乳糖、氧-半乳糖苷-没食子酸盐、氧-龙胆二糖、氧-吡喃型葡萄糖、氧-葡糖苷酸、氧-新橙皮糖、氧-吡喃型鼠李糖、氧-芦丁糖、氧-槐糖、氧-吡喃型木糖、OCH3、OH、鼠李龙胆二糖、鼠李葡萄糖或硫酸酯；R2是OH或氧-吡喃型葡萄糖；R3是OCH3、OH、氧-吡喃型葡萄糖、氧-吡喃型葡糖醛酸或吡喃型葡萄糖；R4是OCH3或OH；及R5是OCH3、OH、氧-吡喃型葡萄糖或氧-葡萄糖。
在由通式(I)所代表的五羟黄酮衍生物中，将已知的化合物分类如下(i)通式I的衍生物的组，其中R2至R5是OH，R1不同，包括当R1是OH时的五羟黄酮、当R1是氧-α-L-呋喃型阿拉伯糖时的扁蓄苷、当R1是氧-吡喃型阿拉伯型糖时的古佳苷(guiajaverin)、当R1是氧-β-D-吡喃型半乳糖时的金丝桃苷、当R1是氧-β-D-吡喃型半乳糖时的异金丝桃苷、当R1是氧-吡喃型葡萄糖时的异槲皮苷、当R1是氧-[β-D-吡喃型葡萄糖基-(1-4)-α-L吡喃型鼠李糖时的麦芽类糖苷(multinoside)A、当R1是(6-氧-乙酰基)-β-D-吡喃型葡萄糖基-(1-4)-α-L-吡喃型鼠李糖时的麦芽类糖苷(multinoside)A醋酸酯、当R1是氧-α-L吡喃型鼠李糖时槲皮苷、当R1是氧-β-D-芦丁糖时的芦丁、当R1是氧-(2″-氧-β-D-吡喃型葡萄糖基)-α-L-吡喃型鼠李糖时的五羟黄酮-3-氧-(2″-氧-β-D-吡喃型葡萄糖基)-α-L-吡喃型鼠李糖苷、当R1是氧-(6″-氧-没食子酰基)-吡喃型葡萄糖时的五羟黄酮-3-氧-(6″-氧-没食子酰基)-吡喃型葡萄糖苷、当R1是氧-(6-氧-对香豆酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)-(1-2)-α-L-吡喃型鼠李糖时的五羟黄酮-3-氧-(6-氧-对香豆酰基)-β-D-吡喃型葡萄糖基-(1-2)-α-L-吡喃型鼠李糖苷、当R1是氧-D-吡喃型葡萄糖基-(1-6)-β-D-吡喃型葡萄糖基-(1-4)-α-L-吡喃型鼠李糖时的五羟黄酮-3-氧-D-吡喃型葡萄糖基-(1-6)-β-D-吡喃型葡萄糖基-(1-4)-α-L-吡喃型鼠李糖苷、当R1是氧-[2″-氧-6-氧-对(7″″-氧-β-D-吡喃型葡萄糖基)香豆酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基]-α-L-吡喃型鼠李糖时的五羟黄酮-3-氧-[2″-氧-6-氧-对(7″″-氧-β-D-吡喃型葡萄糖基)香豆酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基]-α-L-吡喃型鼠李糖苷、当R1是氧-[6-对香豆酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基-β-(1-4)-吡喃型葡萄糖时的五羟黄酮-3-氧-[6-对香豆酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基-β-(1-4)-吡喃型鼠李糖苷、当R1是氧-[α-L-吡喃型鼠李糖基(1-2)-α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-6)-β-D-吡喃型葡萄糖时的五羟黄酮-3-氧-[α-L-吡喃型鼠李糖基(1-2)-α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-6)-β-D-吡喃型葡萄糖苷、当R1是氧-[α-吡喃型鼠李糖基(1-4)α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-6)β-D-吡喃型半乳糖时的五羟黄酮-3-氧-[α-吡喃型鼠李糖基(1-4)α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-6)β-D-吡喃型半乳糖苷、当R1是氧-[α-吡喃型鼠李糖基(1-2)]-[β-吡喃型葡萄糖基-(1-6)]-β-D-吡喃型半乳糖时的五羟黄酮-3-氧-[α-吡喃型鼠李糖基-(1-2)]-[β-吡喃型葡萄糖基-(1-6)]-β-吡喃型半乳糖苷、当R1是氧-[α-吡喃型鼠李糖基(1-4)-α-吡喃型鼠李糖基-(1-6)-β-吡喃型半乳糖时的五羟黄酮-3-氧-[α-吡喃型鼠李糖基-(1-4)-α-吡喃型鼠李糖基-(1-6)-β-吡喃型半乳糖苷、当R1是氧-α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-2)-β-D-吡喃型半乳糖时的五羟黄酮-3-氧-α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-2)-β-D-吡喃型半乳糖苷、当R1是氧-β-D-二吡喃型葡萄糖时的五羟黄酮-3-氧-β-D-二吡喃型葡萄糖苷、当R1是氧-β-D-半乳糖苷-2″-没食子酸时的五羟黄酮-3-氧-β-D-半乳糖苷-2″-没食子酸盐、当R1是氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷-(1-6)-β-D-吡喃型半乳糖时的五羟黄酮-3-氧-β-D-吡喃型半乳糖苷-(1-6)-β-D-吡喃型半乳糖、当R1是氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷-(1-3)-α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-6)-β-D-吡喃型半乳糖时的五羟黄酮-3-氧-β-D-吡喃型葡萄糖基-(1-3)-α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-6)-β-D-吡喃型半乳糖苷、当R1是氧-β-D-葡糖苷酸时的五羟黄酮-3-氧-β-D-葡糖苷酸、当R1是氧-β-D-吡喃型木糖时的五羟黄酮-3-氧-β-D-吡喃型木糖苷、当R1是氧-二吡喃型葡萄糖时的五羟黄酮-3-氧-二吡喃型葡萄糖苷、当R1是氧-龙胆二糖时的五羟黄酮-3-氧-龙胆二糖苷、当R1是氧-吡喃型葡萄糖基吡喃型半乳糖时的五羟黄酮-3-氧-吡喃型葡萄糖基吡喃型半乳糖苷、当R1是氧-新橙皮糖时的五羟黄酮-3-氧-新橙皮糖苷、当R1是氧-槐糖时的五羟黄酮-3-氧-槐糖苷、当R1是龙胆三糖时的五羟黄酮-3-龙胆三糖苷、当R1是OCH3时的五羟黄酮-3-甲基醚、当R1是鼠李龙胆二糖时的五羟黄酮-3-鼠李龙胆二糖苷、当R1是鼠李葡萄糖时的五羟黄酮-3-鼠李葡萄糖苷和当R1是硫酸酯时的五羟黄酮-3-硫酸酯；(ii)通式(I)的衍生物的组，其中R1是-OH，R2至R5中的三个官能团是-OH，剩余的一个官能团不同，包括当R4是OCH3时的异鼠李黄素、当R3是氧-β-D-吡喃型葡萄糖时的棉花黄苷、当R3是OCH3的鼠李黄素、当R2是氧-β-D-吡喃型葡萄糖时的五羟黄酮-5-氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷、当R3是氧-β-D-吡喃型葡糖醛酸时的五羟黄酮-7-氧-β-D-吡喃型葡糖醛酸苷和当R5是氧-葡萄糖时的绣线菊糖苷(spireaoside)；(iii)通式(I)的衍生物的组，其中R1至R5中的三个官能团是OH，其余的二个官能团不同，包括当R3和R4是OCH3时的甲基鼠李黄素、当R4和R5是OCH3时的五羟黄酮-3′，4′-二甲基醚、当R1和R4是OCH3时的五羟黄酮-3，3′-二甲基醚、当R1和R3是OCH3时的五羟黄酮-3，7-二甲基醚、当R1是氧-[2″-氧-(6氧-对香豆酰基)-β-D-吡喃型葡萄糖基]-α-L-吡喃型鼠李糖并且R3是氧-β-D-吡喃型葡萄糖时的五羟黄酮-3-氧-[2″-氧-(6-氧-对香豆酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)-α-L-吡喃型鼠李糖基-7-氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷、当R1是氧-[2″-氧-6氧-对(7″″-氧-β-D-吡喃型葡萄糖基)香豆酰基)-β-D-吡喃型葡萄糖基]-α-L-吡喃型鼠李糖并且R3是氧-β-D-吡喃型葡萄糖时的五羟黄酮-3-氧-[2″-氧-6-氧-p-(7″″-氧-β-D-吡喃型葡萄糖基)香豆酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)-α-L-吡喃型鼠李糖苷-7-氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷、当R1是氧-芦丁糖且R3是氧-β-D-吡喃型葡萄糖时的五羟黄酮-3-氧-芦丁糖苷-7-氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷、当R1是氧-α-L-吡喃型半乳糖且R3是氧-β-D-吡喃型葡萄糖时的五羟黄酮-3-氧-α-L-吡喃型半乳糖基-7-氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷、当R1是氧-槐糖并且R3是氧-β-D-吡喃型葡萄糖时的五羟黄酮-7-氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷-3-氧-槐糖苷、当R1是氧-吡喃型半乳糖且R3是氧-吡喃型葡萄糖时的五羟黄酮-3-氧-吡喃型半乳糖基-7-氧-二吡喃型葡萄糖苷、当R1是氧-吡喃型葡萄糖且R3是氧-吡喃型葡萄糖时的五羟黄酮-3-氧-吡喃吡喃型葡萄糖基-7-二吡喃型葡萄糖苷、当R1是吡喃型葡萄糖且R3是吡喃型葡萄糖时的五羟黄酮-3，7-二吡喃型葡萄糖苷、当R1是龙胆二糖且R3是吡喃型葡萄糖时的五羟黄酮-3-龙胆二糖基-7-吡喃型葡萄糖苷，和当R1和R5均为氧-β-D-吡喃型葡萄糖时的五羟黄酮-3，4′-二-氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷；及(iv)通式(I)的衍生物的组，其中三个以上的官能团不同，包括当R1、R3和R5是OCH3且R2和R4是OH时的五羟黄酮-3，4′，7-三甲基醚和当R1、R3、R4和R5是OCH3且R2是OH时的五羟黄酮-3，3′，4′，7-四甲基醚。
上述通式(I)中的R1至R5基团具有相同的OH基的五羟黄酮是一种在4000多种天然植物中发现的酚化合物并且是一种已知的植物雌激素。它的分子式是C15H10O7，具有共振结构，分子量为302.33克/摩尔，在1936年测定出化学结构后也被称为维生素P。五羟黄酮是一种芦丁，一种其中的糖通过β键连接的糖苷并且广泛地分布在植物中，如三叶草花、美洲豚草的花粉以及多种植物的果壳和茎中，在洋葱、羽衣甘蓝、花茎甘蓝、莴苣、蕃茄和苹果中也有分布。已经证实五羟黄酮不但在维持毛细血管壁的完整性和毛细血管抵抗中发挥重要的作用(见Gabor等，生物学和医学中的植物类黄酮II生物化学、细胞学和医学的性质(Plant Flavonoids in Biology and Medicine IIBiochemical，Cellular，and Medical Properties)，2801-15，1988；Havsteen等，生化药理学(Biochemical Pharmacology)，321141-1148，1983)而且具有抗氧化活性、维生素P活性、紫外线吸收活性、抗高血压活性、抗心律失常活性、抗炎症活性、抗过敏活性、抗胆固醇活性、对肝脏毒性的抑制活性以及对不孕的治疗效果，因此，可以预期在食物、治疗和药物产品以及化妆品中广泛应用五羟黄酮。但是，没有关于将五羟黄酮用于预防和治疗骨质疏松症的报道。
下文将说明一种含有五羟黄酮衍生物活性成分的本发明的骨质疏松症治疗剂。
为探求五羟黄酮衍生物对成骨细胞和破骨细胞的增殖效果，本发明将五羟黄酮的效果与已知用于治疗骨质疏松症的有效试剂植物雌激素染料木黄酮的效果进行了对比了，并发现五羟黄酮在活化成骨细胞增殖、提高碱性磷酸酶活性和抑制破骨细胞增殖方面比染料木黄酮具有更好的效果。
而且，在切除卵巢的小鼠中发现，给药五羟黄酮衍生物不会带来激素水平的变化，证实了五羟黄酮是一种不会导致子宫肥大的安全的试剂，子宫肥大是目前作为骨质疏松症治疗剂使用的雌二醇的不良副作用。而且，在增加小梁的骨面积易于剧烈变化的胫骨的小梁骨面积方面，五羟黄酮也被证实比雌二酮更有效，五羟黄酮对造血功能和免疫系统没有不良的副作用。
因此，基于上述结果，发现本发明的五羟黄酮衍生物不但比目前使用的用于活化成骨细胞的增殖和抑制破骨细胞的增殖的植物雌激素染料木黄酮具有更好的效果，而且具有更小的副作用，对激素水平带来很小的变化并且对造血功能和免疫系统没有不良影响，证实了五羟黄酮衍生物作为骨质疏松症治疗剂或预防剂的用途。剂型可以将所述的对骨质疏松症的治疗具有优良效果的五羟黄酮衍生物与可药用的赋形剂混合制备用于口服或不经肠胃给药的药物剂型，如片剂、胶囊、软胶囊、液体、软膏剂、丸剂、粉剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、栓剂或注射剂，其中的赋形剂包括粘合剂，如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素等，崩解剂，如羧甲基纤维素钙、甘醇酸酯淀粉钠等，稀释剂，如玉米淀粉、乳糖、大豆油、结晶纤维素、甘露醇等，润滑剂，如硬脂酸镁、滑石粉等，甜味剂，如蔗糖、果糖、山梨糖醇、天冬甜素等，稳定剂，如羧甲基纤维素钠、α-或β-环糊精、维生素C、柠檬酸、白蜡等，防腐剂，如对羟甲基苯甲酸盐、对羟丙基苯甲酸盐、苯甲酸钠等以及芳香剂，如乙基香兰素、掩蔽调味剂、香味薄荷醇、香草调味剂等。而且，为增强预防和治疗骨质疏松症的疗效，可以向制剂中加入钙或维生素D3。为不经肠胃给药本发明的药物制剂，可以使用皮下、静脉内、肌肉内或腹膜内注射。为不经肠胃给药，可以使五羟黄酮衍生物与稳定剂或缓冲剂在水中混合制成溶液或悬浮液，可以将溶液或悬浮液制成安瓿或管形瓶的单次剂量剂型。剂量本发明用于骨质疏松症的治疗剂中的五羟黄酮的有效量为2至20mg/kg，优选8-12mg/kg，根据患者的年龄、性别、严重程度、给药方式或预防的目的，每天可以向患者给药1次以上。安全性文献(见，M.Sullivan等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，77269，1951)中已经报道了本发明的五羟黄酮衍生物的毒性，对于对小鼠口服给药和腹膜内给药并且口服给药的五羟黄酮的LD50低于160mg/kg的情况，证实五羟黄酮是安全的。在本发明中，检查了五羟黄酮对肝脏、肾脏、大脑、子宫、皮肤和胫骨的副作用，结果表明肝脏、肾脏、大脑、皮肤和胫骨的重量不受影响，而且，给药五羟黄酮没有观察到目前使用的治疗剂所发生的子宫肥大的副作用，证实作为激素制剂的五羟黄酮衍生物可以作为骨质疏松症的治疗剂安全地使用。
下列实施例将进一步说明本发明，实施例不应被视为限制本发明的范围。实施例1五羟黄酮对成骨细胞增殖的影响为分析五羟黄酮对成骨细胞增殖的影响，使用了人类类似成骨细胞的细胞系Saos-2并使用作为骨质疏松症治疗剂而被广泛研究的植物雌激素染料木黄酮作为对比试剂。实施例1-1选择和培养成骨细胞从附属于汉城国立大学医学院癌症研究所(Cancer ResearchInstitute of School of Medicine，Seoul National University)的韩国细胞系库(Korean Cell Line Bank)获得与成骨细胞具有类似性质的Saos-2细胞系。
将Saos-2细胞接种在一个用10％(v/v)FBS，100单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素补充的RPMI 1640培养基(Gibco BRL，美国)中并在37℃，5％(v/v)CO2气氛和饱和湿度条件下，在培养箱中长成单细胞层。每周向培养物中补充2至3次新鲜的培养基并使用0.25％(w/v)胰蛋白酶每周传代培养1次。实施例1-2取决于试剂浓度的细胞增殖将Saos-2细胞分配在96孔的板(20,000细胞/孔)中并加入在1％DMSO中的五羟黄酮至最终浓度为10-2至10-9mg/ml，每个浓度6个孔。使用不含五羟黄酮的细胞作为空白组，使用以不同浓度的作为骨质疏松症治疗剂被研究的染料木黄酮处理的细胞作为对比组。细胞在37℃下在培养箱中生长3天，在加入MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑溴化物，三唑基蓝)至0.05mg/ml的浓度后，在相同的条件下再培养4小时。然后，将与活细胞的数量成比例的紫色甲溶解在DMSO中并使用酶联免疫吸附(ELISA)读数器在550nm测量光密度(OD)。
通过计算加入五羟黄酮的孔的OD与空白孔的OD的比例计算细胞增殖率(％)，其中使用以相同浓度的五羟黄酮处理的6个孔的OD的平均值(见表1)。
细胞增殖率(％)＝{(以五羟黄酮处理的孔在550nm的OD的平均值-空孔在550nm的OD的平均值)/空白孔在550nm的OD的平均值}×100实施例1-3碱性磷酸酶(ALP)活性分析由于成骨细胞具有细胞特异的碱性磷酸酶活性，按照如下方式评价本发明的五羟黄酮对成骨细胞中的ALP活性的影响所使用的细胞的数量、测试试剂的浓度和培养条件与实施例1-2的MTT实验相同并且在温育3天后收获细胞。使用染料木黄酮作为对比试剂。通过分析由对硝基苯基磷酸酯水解为对硝基苯酚和磷酸酯而导致的在405nm的OD的变化评价ALP活性(见表1)。
表1五羟黄酮对成骨细胞增殖的影响
*p＜0.05**p＜0.01如上表1所示，在使用MTT方法的细胞增殖实验中，与没有使用试剂处理的空白细胞相比，使用浓度在1×10-9至1×10-3mg/ml范围内的不同浓度的五羟黄酮处理的细胞没有表现出任何不同，而在1×10-2mg/ml浓度，五羟黄酮表现出是空白细胞增殖的109％的最大细胞增殖效果(p＜0.01)。另一方面，对比试剂染料木黄酮在1×10-9mg/ml的浓度为91％(p＜0.05)，在1×10-6mg/ml浓度为90.5％(p＜0.01)，在1×10-3mg/ml的浓度为86％(p＜0.01)以及在1×10-2mg/ml浓度为66％(p＜0.01)，这意味着染料木黄酮对成骨细胞的增殖具有抑制效果而不是促进效果。
在分析ALP活性的实验中，在1×10-6mg/ml的浓度，五羟黄酮表现出是空白ALP活性的127％的最大ALP活化效果(p＜0.01)，而在1×10-4mg/ml的浓度，染料木黄酮表现出121％的最大ALP活化效果，表明本发明的五羟黄酮的ALP活化效果比染料木黄酮的ALP活化效果高约100倍。因此，本发明的五羟黄酮在促进成骨细胞增殖和活化ALP活性方面比近年被作为骨质疏松症治疗剂而广泛研究的染料木黄酮更有效。实施例2五羟黄酮对破骨细胞增殖的效果为研究五羟黄酮是否对破骨细胞的增殖具有抑制效果，按照下文进行实验。实施例2-1破骨细胞的选择和培养以缺钙饮食(美国俄亥俄州ICN生物医学公司(ICN Biomedicals，Inc.))饲养ICR小鼠(韩国化学技术研究所(Korea Research Institute ofChemical Technology)韩国大田)4周，活化破骨细胞。避免周围肌肉组织的污染摘除缺钙小鼠的左右胫骨和股骨。将在清洁的工作台上分类并分别置于冰上的股骨和左右胫骨加入到含有100μg/ml链霉素的α-MEM中，然后分别充分震荡，将破骨细胞提取到培养基中。在置于冰上5分钟后，将细胞悬浮液在800xg离心分离3分钟，然后将细胞球粒重新悬浮到用10％FBS，100μg/ml链霉素和100单位/ml青霉素补充的α-MEM营养培养基中。将细胞悬浮液分配至细胞数为3.5×106/孔的24孔板中。实施例2-2取决于五羟黄酮浓度的细胞增殖向上述实施例2-1所获得的破骨细胞中加入五羟黄酮，获得1×10-8至1×10-2mg/ml的浓度。第二天，使用可商购的试剂盒(美国Sigma化学公司)对细胞进行抗酒石酸盐酸性磷酸酶(TRAP)染色，然后计数破骨细胞，破骨细胞是TRAP-阳性的多核细胞(MNC)，可通过在一个染为红色的细胞中多于三个细胞核判断(见表2)。
表2五羟黄酮对破骨细胞增殖的效果
*p＜0.05，**P＜0.01如上表2所示，虽然浓度在1×10-8至1×10-4mg/ml之间的五羟黄酮对破骨细胞的增殖具有很小的抑制效果，但浓度在1×10-3mg/ml和浓度在1×10-2mg/ml的五羟黄酮的细胞数量分别是空白组细胞数量的61％(p＜0.05)和25％，表明五羟黄酮对破骨细胞的增殖具有显著的抑制效果。
基于实施例1和2的结果，清楚地证实了五羟黄酮是一种用于骨质疏松症的潜在的治疗剂，在1×10-2mg/ml的浓度下，五羟黄酮对成骨细胞的增殖具有促进效果，对破骨细胞的增殖具有抑制效果。实施例3五羟黄酮对切除卵巢的小鼠的影响使用绝经期后发生的I型骨质疏松症的模型动物，雌性SD(Sprague-Dawley)小鼠评价五羟黄酮的药效。使用从韩国化学技术研究所获得的体重为200至300g的雌性小鼠(10周龄)作为实验动物。通过包括下列步骤的程序进行实验切除卵巢；向每组小鼠给药试剂；在切除卵巢后的特定天数杀死小鼠并进行包括称量体重、检查内脏器官、测量小梁的骨面积、全部血细胞计数和血浆的生化分析在内的分析。实施例3-1切除卵巢和给予试剂按照下文所述除了假手术组(正常组)以外，切除对照组和实验组小鼠的卵巢通过向左右下肢的股骨肌肉进行肌肉内注射5mg/100g氯胺酮(Ketamin，韩国Yuhan公司)和1mg/100g甲苯噻嗪(韩国BeyerKorea)使雌性小鼠全身麻醉，然后刮掉下腹部区域的毛，在卧位用Potadin液体(碘，韩国Samil Pharm.有限公司)对手术区域消毒，在无菌条件下，在中间切开大约2cm的腹部皮肤、腹部肌肉和腹膜，使用灭菌的镊子使卵巢暴露，然后在使用丝线结扎输卵管后，切除左右卵巢。接着，腹膜内注射0.3ml抗生素(Sulfaforte-4，韩国Yoonee化学有限公司)以防止感染，然后用丝线或尼龙线缝合腹膜、腹部肌肉和皮肤。
利用假手术组比较在空白组中仅仅由于切除卵巢所导致的变化，假手术组是进行卵巢切除小鼠的外科手术但不切除卵巢的动物，空白组是切除了卵巢但不给予试剂的动物。利用空白组对比在实验组中由于给予试剂而导致的变化，实验组是切除了卵巢并给予试剂的动物。
当给予实验试剂时，在给药前和给药后的特定期间，使用导管(B.D公司24G)从尾部静脉中取1.5ml血样并进行全部血细胞计数(Coulter公司JT)和血浆生化分析(Crone公司Airon 200)。在尸体解剖过程中，从尾部的腔静脉中取血样并进行上述分析。然后，冷冻保存每个样品用于测量小梁的股骨骨面积和检查内脏器官。
手术后1周，给假手术组和空白组小鼠腹膜内注射10％的Tween80溶液，以1μg/kg/天的浓度给E2组小鼠注射17β-雌二醇，以10mg/kg/天的浓度给实验组动物注射五羟黄酮或染料木黄酮9周，每周称量每组小鼠的体重1次。在给药期间，每周取血样1次。在给药9周后，使用肝素处理抽取全部血液。在全部血细胞计数(CBC)后，以3,000转/分钟离心分离20分钟以获得血浆，在-70℃保存血浆至使用。为测量骨的矿物质密度，摘除脊柱腰段L5和L6和右胫骨并分别保存在4％(v/v)的福尔马林溶液中。实施例3-2取决于给药五羟黄酮的体重变化在手术后10周，每周称量1次假手术组、用17β-雌二醇处理的E2组和分别用五羟黄酮和染料木黄酮处理的实验组的小鼠的体重(见表3)。
表3取决于给药的体重变化的测量
*p＜0.05，**p＜0.01，与手术前相比#p＜0.05，##p＜0.01，与空白组相比如表3所示，假手术组的体重在手术后3周开始增加(p＜0.05)，而空白组的体重在手术后2周开始增加(p＜0.01)。即，与假手术组相比，空白组表现出更快的体重增长并且在给药雌二醇后，此种体重的增加被减慢，手术后20周，与空白组相比，E2组表现出更慢的体重增加(p＜0.05)。同时，分别以10mg/kg/天的浓度给药植物雌激素五羟黄酮或染料木黄酮的实验组即使在切除卵巢后也表现出与空白组类似的体重的快速增加。因此，没有发现给药五羟黄酮会给体内的激素水平带来有意义的变化。实施例3-3五羟黄酮使内脏器官重量的变化为查明五羟黄酮对实验动物内脏器官的影响，在手术后9周，切除以实验试剂给药的实验动物的肝脏、肾脏、大脑、子宫、皮肤和胫骨并测量每个器官的净重(见表4)表4给药后内脏器官的重量变化
**p＜0.01
如表4所示，对于肝脏、肾脏、大脑、胫骨和皮肤的重量，正常的假手术组、切除卵巢的空白组以及实验组之间没有表现出区别。但是，对于受卵巢所分泌的雌激素影响的子宫的重量，与假手术组相比，切除卵巢的空白组表现出显著的增加(p＜0.01)，并且与空白组相比，在切除卵巢后给药E2抑制了子宫的萎缩(p＜0.01)。另一方面，给药植物雌激素五羟黄酮或染料木黄酮没有导致子宫重量的变化，表明目前作为骨质疏松症的治疗剂使用的E2具有如子宫肥大的副作用，而五羟黄酮可以作为骨质疏松症的治疗剂安全地使用，不会产生不良的副作用。实施例3-4五羟黄酮对小梁骨面积的改变按照下文所述测量从使用不同的试剂处理9周的每组小鼠切除的腰椎和胫骨的小梁骨面积(TBA)即，使用定量图象分析系统的数字化装置(Wild Leitz公司)，通过绘出小梁的轮廓在计算机显示器上获得每个小梁的图象，然后使用计算机计算位于接近胫骨的生长板下面的面积为2×106μm2的矩形内的骨小梁的平均面积，其中矩形的宽度大约是生长板长度的2/3。而且，在获得矩形内的骨小梁数量后，用平均面积乘以骨小梁的数量以获得每个骨骼样品的小梁骨面积，对其进行统计学分析(见表5)。
表5取决于给药的胫骨的小梁骨面积的变化
*p＜0.05，**p＜0.01
如表5所示，对于胫骨，空白组的TBA是34.62×104μm2，该数值与正常的假手术组的85.55×104μm2相比明显降低(p＜0.01)，表明骨质疏松症已经在空白组中发生，通过使用E2、五羟黄酮或染料木黄酮处理，此种降低的TBA被分别再次增加至空白组TBA的148％、160％和138％，特别是五羟黄酮的情况，观察到TBA的显著增加(p＜0.05)。
使用与上述方法相同的方法测量从使用实验试剂处理9周的动物中切除的腰椎的TBAs(见，表6)。
表6取决于给药的腰椎的小梁骨面积的变化
*p＜0.05，**p＜0.01如表6所示，对于腰椎，空白组的TBA是67.53×104μm2，该数值与假手术组的93.70×104μm2相比降低(p＜0.01)，但是，通过使用E2、五羟黄酮或染料木黄酮处理，此种降低的TBA被分别再次增加至空白组TBA的132％(p＜0.01)、129％(p＜0.05)和128％(p＜0.05)，表明这些实验试剂对由于切除卵巢而引起的TBA的降低具有抑制效果。特别地，在TBA易于显著变化的胫骨中，五羟黄酮比目前作为骨质疏松症的治疗剂使用的E2表现出使TBA更显著地增加，表明五羟黄酮是一种不会导致子宫肥大的更有效的治疗剂，子宫肥大是E2所导致的不良副作用。实施例3-5全部血细胞计数为查明由于给药试剂所导致的实验动物的异常，测量反应身体状况和异常的全部血细胞计数。即，为查明实验小鼠的血细胞生成作用的变化，测量从手术前的小鼠以及手术后给药10周的小鼠获得的血液样品中的红血细胞计数、血红蛋白(Hb)的浓度和红细胞比容(Ht)，并查明免疫系统，如组织的发炎和坏死的变化，测量白细胞计数、淋巴细胞计数、单核细胞计数和粒细胞计数(见表7)。
表7取决于给药的全部血细胞计数的变化
*p＜0.05，**p＜0.01
如表7所示，在所有组中，在手术前后RBC计数没有表现出任何变化，血红蛋白浓度和红细胞比容在手术后降低。在五羟黄酮或染料木黄酮处理组中，在手术前后白细胞计数没有表现出任何变化，但在假手术组和E2组中，手术后白细胞计数降低。而且，淋巴细胞和粒细胞计数仅在E2组中显著降低，在所有组中，单核细胞计数没有变化。因此，发现五羟黄酮是一种不会干扰体内的造血功能和免疫系统的安全试剂。实施例3-6五羟黄酮引起的血浆的生化变化由于血液反应身体状况，通过测量生化参数评价五羟黄酮在体内的安全性即，在手术前、手术后1周和手术后10周，取小鼠血样，测量碱性磷酸酶(ALP)、钙、无机磷酸盐、血液尿素氮(BUN)、肌酸酐、总胆固醇、HDL-胆固醇和LDL-胆固醇(见表8)。
表8取决于给药的血浆的生化参数变化
*p＜0.05，**p＜0.01，与空白组相比
#p＜0.05，##p＜0.01，与手术前相比$p＜0.05，$$p＜0.01，与手术1周后相比如表8所示，在所有组中，直接与骨骼的新陈代谢相关的ALP活性表现出随年龄降低的倾向，特别地，在假手术组和染料木黄酮处理组中，手术后10周的小鼠表现出ALP活性的显著降低，与手术前和手术后1周的小鼠相比，钙浓度没有变化。在空白组和染料木黄酮处理组中，与手术前的小鼠相比，手术后10周的小鼠的无机磷酸盐的水平显著降低。
虽然在所有组中，与蛋白质的新陈代谢和肌肉量相关的血液尿素氮的水平均维持在适当水平，但在所有组中，肌酸酐的水平均升高。
已知在绝经后的女性中升高的总胆固醇水平在所有组中均升高，但在假手术组的升高较低。虽然在所有组中，HDL-胆固醇的水平均随时间而降低，但在正常的假手术组以及切除卵巢组中发现LDL-胆固醇的水平随时间而升高。
因此，发现本发明的五羟黄酮是一种用于骨质疏松症的有效的治疗和预防剂。实施例4五羟黄酮制剂的剂型糖精.....................................0.8g糖.......................................25.4g甘油.....................................8.0g芳香剂...................................0.04g乙醇.....................................4.0g山梨酸...................................0.4g蒸馏水...................................适量五羟黄酮盐酸化物的类黄酮衍生物............1gNaCl......................................0.6g抗坏血酸..................................0.1g蒸馏水....................................适量如上文的明确说明和证明，本发明提供了一种含有五羟黄酮衍生物活性成分的骨质疏松症治疗剂，其中五羟黄酮衍生物能够有效地促进成骨细胞的增殖和抑制破骨细胞的增殖。本发明的五羟黄酮衍生物可以在实践中用于骨质疏松症的治疗和预防，因为它能够比骨质疏松症的常规治疗剂更有效地抑制破骨细胞的增殖和促进成骨细胞的增殖，能够显著地增加小梁的骨面积，不会改变体内的激素水平和对造血功能和免疫系统产生副作用。
权利要求
1.一种用于骨质疏松症的治疗剂，所述的治疗剂含有由下列通式(I)所代表的五羟黄酮衍生物活性成分和可药用的载体 其中，R1是龙胆三糖、吡喃型葡萄糖、氧-呋喃型阿拉伯糖、氧-二吡喃型葡萄糖、氧-吡喃型半乳糖、氧-半乳糖苷-没食子酸盐、氧-龙胆二糖、氧-吡喃型葡萄糖、氧-葡糖苷酸、氧-新橙皮糖、氧-吡喃型鼠李糖、氧-芦丁糖、氧-槐糖、氧-吡喃型木糖、OCH3、OH、鼠李龙胆二糖、鼠李葡萄糖或硫酸酯；R2是OH或氧-吡喃型葡萄糖；R3是OCH3、OH、氧-吡喃型葡萄糖、氧-吡喃型葡糖醛酸或吡喃型葡萄糖；R4是OCH3或OH；及R5是OCH3、OH、氧-吡喃型葡萄糖或氧-葡萄糖。
2.权利要求1所述的用于骨质疏松症的治疗剂，其中的五羟黄酮衍生物是当通式(I)中的R2、R3、R4和R5为-OH时，通式(I)所代表的下列化合物五羟黄酮、扁蓄苷、古佳苷、金丝桃苷、异金丝桃苷、异槲皮苷、麦芽类糖苷A、麦芽类糖苷A醋酸酯、槲皮苷、芦丁、五羟黄酮-3-氧-(2″-氧-β-D-吡喃型葡萄糖基)-α-L-吡喃型鼠李糖苷、五羟黄酮-3-氧-(6″-氧-没食子酰基)-吡喃型葡萄糖苷、五羟黄酮-3-氧-(6-氧-对香豆酰基)-β-D-吡喃型葡萄糖基-(1-2)-α-L-吡喃型鼠李糖苷、五羟黄酮-3-氧-D-吡喃型葡萄糖基-(1-6)-β-D-吡喃型葡萄糖基-(1-4)-α-L-吡喃型鼠李糖苷、五羟黄酮-3-氧-[2″-氧-6-氧-对(7″″-氧-β-D-吡喃型葡萄糖基)香豆酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基]-α-L-吡喃型鼠李糖苷、五羟黄酮-3-氧-[6-对香豆酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基-β-(1-4)-吡喃型鼠李糖苷、五羟黄酮-3-氧-[α-L-吡喃型鼠李糖基(1-2)-α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-6)-β-D-吡喃型葡萄糖苷、五羟黄酮-3-氧-[α-吡喃型鼠李糖基(1-4)α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-6)β-D-吡喃型半乳糖苷、五羟黄酮-3-氧-[α-吡喃型鼠李糖基-(1-2)]-[β-吡喃型葡萄糖基-(1-6)]-β-吡喃型半乳糖苷、五羟黄酮-3-氧-[α-吡喃型鼠李糖基-(1-4)-α-吡喃型鼠李糖基-(1-6)-β-吡喃型半乳糖苷、五羟黄酮-3-氧-α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-2)-β-D-吡喃型半乳糖苷、五羟黄酮-3-氧-β-D-二吡喃型葡萄糖苷、五羟黄酮-3-氧-β-D-半乳糖苷-2″-没食子酸盐、五羟黄酮-3-氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷-(1-6)-β-D-吡喃型半乳糖苷、五羟黄酮-3-氧-β-D-吡喃型葡萄糖基-(1-3)-α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-6)-β-D-吡喃型半乳糖苷、五羟黄酮-3-氧-β-D-葡糖苷酸、五羟黄酮-3-氧-β-D-吡喃型木糖苷、五羟黄酮-3-氧-二吡喃型葡萄糖苷、五羟黄酮-3-氧-龙胆二糖苷、五羟黄酮-3-氧-吡喃型葡萄糖基吡喃型半乳糖苷、五羟黄酮-3-氧-新橙皮糖苷、五羟黄酮-3-氧-槐糖苷、五羟黄酮-3-龙胆三糖苷、五羟黄酮-3-甲基醚、五羟黄酮-3-鼠李龙胆二糖苷、五羟黄酮-3-鼠李葡萄糖苷和五羟黄酮-3-硫酸酯。
3.权利要求1所述的用于骨质疏松症的治疗剂，其中的五羟黄酮衍生物是当通式(I)中的R1为-OH并且R2、R3、R4和R5中的三个官能基团是-OH时，通式(I)所代表的下列化合物异鼠李黄素、棉花黄苷、鼠李黄素、五羟黄酮-5-氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷、五羟黄酮-7-氧-β-D-吡喃型葡糖醛酸苷和绣线菊糖苷。
4.权利要求1所述的用于骨质疏松症的治疗剂，其中的五羟黄酮衍生物是当通式(I)中的R1、R2、R3、R4和R5中的三个官能基团是-OH时，通式(I)所代表的下列化合物鼠李黄素、五羟黄酮-3′，4′-二甲基醚、五羟黄酮-3，3′-二甲基醚、五羟黄酮-3，7-二甲基醚、五羟黄酮-3-氧-[2″-氧-(6-氧-对香豆酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)-α-L-吡喃型鼠李糖基-7-氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷、五羟黄酮-3-氧-[2″-氧-6-氧-对(7″″-氧-β-D-吡喃型葡萄糖基)香豆酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)-α-L-吡喃型鼠李糖苷-7-氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷、五羟黄酮-3-氧-芦丁糖苷-7-氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷、五羟黄酮-3-氧-α-L-吡喃型阿拉伯糖基-7-氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷、五羟黄酮-7-氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷-3-氧-槐糖苷、五羟黄酮-3-氧-吡喃型半乳糖基-7-氧-二吡喃型葡萄糖苷、五羟黄酮-3-氧-吡喃型葡萄糖基-7-二吡喃型葡萄糖苷、五羟黄酮-3，7-二吡喃型葡萄糖苷、五羟黄酮-3-龙胆二糖基-7-吡喃型葡萄糖苷或五羟黄酮-3，4′-二-β-D-吡喃型葡萄糖苷。
5.权利要求1所述的用于骨质疏松症的治疗剂，其中的五羟黄酮衍生物是五羟黄酮-3，4′，7-三甲基醚或五羟黄酮-3，3′，4′，7-四甲基醚。
6.权利要求1所述的用于骨质疏松症的治疗剂，其中可药用的载体选自由聚乙烯吡咯烷酮和羟丙基纤维素所组成的组。
7.权利要求1所述的用于骨质疏松症的治疗剂，其中可药用的载体是选自由羧甲基纤维素钙和甘醇酸酯淀粉钠所组成的组的崩解剂。
8.权利要求1所述的用于骨质疏松症的治疗剂，其中可药用的载体是选自由玉米淀粉、乳糖、大豆油、结晶纤维素和甘露醇所组成的组的稀释剂。
9.权利要求1所述的用于骨质疏松症的治疗剂，其中可药用的载体是选自由硬脂酸镁和滑石粉所组成的组的润滑剂。
10.权利要求1所述的用于骨质疏松症的治疗剂，其中可药用的载体是选自由蔗糖、果糖、山梨糖醇和天冬甜素所组成的组的甜味剂。
11.权利要求1所述的用于骨质疏松症的治疗剂，其中可药用的载体是选自由羧甲基纤维素钠、α-或β-环糊精、维生素C、柠檬酸和白蜡所组成的组的稳定剂。
12.权利要求1所述的用于骨质疏松症的治疗剂，其中可药用的载体是选自由对羟甲基苯甲酸盐、对羟丙基苯甲酸盐和苯甲酸钠所组成的组的防腐剂。
13.权利要求1所述的用于骨质疏松症的治疗剂，其中可药用的载体是选自由乙基香兰素、掩蔽调味剂、香味薄荷醇和香草调味剂所组成的组的芳香剂。
14.权利要求1所述的用于骨质疏松症的治疗剂，其中的治疗剂是选自由片剂、胶囊、软胶囊、液体、软膏剂、丸剂、粉剂、悬浮剂、分散剂、糖浆剂、栓剂和注射剂所组成的组的口服或不经肠胃给药的药物剂型。
15.权利要求1所述的用于骨质疏松症的治疗剂，其中还包括钙和维生素D3。
全文摘要
本发明涉及一种含有五羟黄酮衍生物活性成分的骨质疏松症治疗剂。本发明的五羟黄酮衍生物可以在实践中用于骨质疏松症的治疗和预防,因为它能够比骨质疏松症的常规治疗剂更有效地抑制破骨细胞的增殖和促进成骨细胞的增殖,能够显著地增加小梁的骨面积,而不会改变体内的激素水平和对造血功能和免疫系统产生副作用。
文档编号C07H17/07GK1383381SQ01801856
公开日2002年12月4日 申请日期2001年3月9日 优先权日2000年8月14日
发明者金贞淑, 河惠景, 宋启用 申请人:韩国韩医学研究院