专利名称：一种NF-κB抑制物及其制备方法、以及作为抗肿瘤药物的应用的制作方法
技术领域：
本发明属基因工程技术领域。
背景技术：
目前，肿瘤治疗的核心问题是解决肿瘤细胞对抗抗瘤药物的致凋亡作用。最近的研究发现，核转录因子NF-κB的异常活化在肿瘤细胞的抗凋亡机制中起了关键性作用。正常情况下，NF-κB与其抑制物IκBα结合，不表现生物学活性，当细胞受到外界因素如TNF-α等刺激时，经过一系列的酶促级联反应，使IκBα于Ser32和Ser36位磷酸化，并迅速泛素化及酶解，最终使NF-κB活化并与核内特异靶基因结合，启动应激蛋白的表达，以对抗TNF-α等作用。这一发现揭示了肿瘤细胞产生耐药性的根本原因，因此，如何抑制NF-κB的作用，诱导肿瘤细胞凋亡，便成为肿瘤治疗，尤其是肿瘤基因治疗的关键。
Baldwin，Ghosh S等的研究指出，若在IκBα的磷酸化位点发生突变，即构建变异的IκBα(IκBαM)以去除IκBα的磷酸化位点，则不能被磷酸化及降解，因而能持续结合NF-κB以阻止其不恰当活化。
NF-κB抑制物(IκBαM超级抑制物)的构建方法在国外已有报道，且方式各不相同，而采用体外定点突变法分两次将第32和36位编码丝氨酸的密码子分别进行定向诱变，制备超级抑制物IκBαM，然后用特定引物进行PCR扩增的方法，至今尚未见国内外的相关报道，同时，在对IκBαM的体内外抑瘤活性研究的方法中，Hoechst染色法观察其对人肝癌细胞株HePG2细胞核形态的影响、体内抑瘤活性研究等，至今亦未见报道。因此，本技术的理论意义和实际意义都将是十分重大的。
发明内容
本发明的目的是为了以AdEasy System腺病毒为载体，通过构建IκBαM腺病毒重组体，系统研究超级抑制物IκBαM在体内外对肝癌等肿瘤细胞生长的抑制作用；为了该制剂的临床应用及产业化开发奠定基础。
本发明包括IκBαM超级抑制物的制备，真核/原核表达载体IκBαM重组腺病毒(AdIκBαM)和对照AdIκBα的构建方法。
本发明还包括两对诱变引物和RT-PCR引物的设计；引物的序列详见“IκBαM超级抑制物的构建”。
本发明还包括在对IκBαM的体内外抑瘤活性研究的方法中，采用Hoechst染色法观察其对人肝癌细胞株HePG2细胞核形态的影响。
本发明还包括在体内外实验研究中采用未突变的IκBα重组腺病毒为对照。
本发明所构建的重组腺病毒表达载体经Western blot及免疫组化等实验证明能稳定、高效表达IκBαM超级抑制物；经EMSA实验证明能稳定、持续地抑制NF-κB的过度活化；在进一步的体外实验研究中，联合TNF-α作用，MTT法和Hoechst染色等细胞实验初步显示了其抑制肿瘤细胞生长、引起肿瘤细胞的凋亡的效果。
图1是IκBα基因的克隆和序列分析技术路线图2是IκBαM超级抑制物构建的点突变程序图3是IκBα重组腺病毒载体结构示意4是IκBαM的序列与所进行同源性分析结果(mutant为IκBαM的基因序列，clone为克隆的IκBα序列，反黑为同源序列，反白的为突变碱基。)
具体实施例方式本发明的目的可以通过以下措施来达到本发明运用RT-PCR方法，将从人外周血单核细胞扩增IκBαcDNA，经纯化、测序鉴定后，运用酶切、连接等基因重组手段，得到重组质粒pGEM-IκBα。通过体外定点诱变技术，构建重组质粒pGEM-IκBαM，然后将IκBα突变基因亚克隆到pAdTrack-CMV穿梭载体中，与腺病毒骨架质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，线性化后转入293细胞进行包装、扩增以得到完整的重组腺病毒表达载体。然后在原核及真核细胞(包括293、HePG2、HeLa、HUVEC、MAD-435S等细胞)中高效表达，得到的蛋白经Western blot、免疫组化等方法检测，结果表明此抑制物能稳定、高效表达；经EMSA和Hoechst染色等细胞实验证明能抑制NF-κB的过度活化并引起肿瘤细胞的凋亡。具体实施方案如下1.引物的设计与合成根据已知κBo基因序列，设计特异的Nest-RT-PCR引物为F5’-CTTAAGCTTAGCTCGTCCGCGCCATGTTC-3’；R5’-GCTCTAGAGTCCATGTTCTTTCAGCC-3’；特异的两对诱变引物为诱变引物15′-GTCCAGGCCGATGTCGTGGC-3′，诱变引物25′-TCTTTCATGGCGTCCAGGCC-3′。诱变引物合成后均需5’端进行磷酸化。
2.RT-PCR扩增以人外周血单核细胞提取的IκBαRmENA为模板，采用RT-PCR扩增IκBαcDNA，扩增产物纯化后克隆到pGEM-T载体中进行筛选和鉴定。
3.IκBαM超级抑制物的构建我们应用GeneEditorTMin vitro Site-directed Mutagenesis System构建IκBαM超级抑制物，其突变的原理和流程如下(1).将目的基因插入带有Amp抗性的质粒载体，碱变性使其变为单链，加入诱变引物(引物中部含一个变异碱基)和选择引物(试剂盒提供，其将质粒中的Amp抗性变为试剂盒提供的Mix抗生素抗性)，使其退火、连接(与单链模板互补)。(2).以T4多聚酶和T4连接酶合成突变链。(3).将含有突变链的质粒转入修复功能阴性的M71-18MutS菌内，应用试剂盒提供的选择性抗生素Mix筛选突变菌株。由此筛选出突变菌株M2。由于M2质粒抗性已经改变，故需将突变后的IκBa基因重新亚克隆到具有AMP抗性的载体中进行第二轮诱变。方法如下应用限制性内切酶HindIII和Xba I同时对M2和pGEM-11zf质粒进行酶切，酶切产物经纯化、连接，即构建成第32位突变的M2质粒，以诱变引物2，照上述方法对该质粒进行第二轮诱变操作，即得到超级抑制物IκBαM。
4.IκBαM重组腺病毒(AdIκBαM)和对照AdIκBα构建IκBαM重组腺病毒构建采用美国John Hopkins癌症研究中心最新研制的腺病毒载体系统AdEasySystem，构建IκBαM重组腺病毒。该系统较之以前的方法有了较大的改进(1)含有大部分腺病毒基因组序列的腺病毒骨架质粒，于超螺旋状态应用而不需要进行酶切处理。(2)穿梭质粒与腺病毒骨架质粒的同源重组在细菌中而不是在细胞中进行。(3)由于在所选细菌中具有较高效的同源重组机制，因此，在构建腺病毒重组体时不需要连接步骤。(4)该系统可以允许插入10kb的目的基因，并且在同一腺病毒内导入多个目的基因。(5)部分骨架质粒含有绿色荧光蛋白基因，因此可以直接观察转染和感染效率。该方法避免了在真核细胞内进行繁琐的同源重组步骤，而代之以简单的原核细胞内的同源重组。目的基因的表达鉴定和重组腺病毒的滴度测定，则采用了当前流行的荧光检测方法，使之更加简捷、方便。主要步骤如附图2所示。包括(1)将超级抑制物IκBαM从pGEM-T载体亚克隆到pAdTrack-CMV穿梭载体中。经PmeI酶切，使之线性化。
(2)将上述线性化的pAdTrack-CMV重组质粒与超螺旋的腺病毒载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183。
(3)采用卡那霉素筛选同源重组子pAd-IκBαM。
(4)pAd-IκBαM经PacI酶切线形化后，转染包装细胞(293细胞)，培养7-10天后，收获IκBαM重组腺病毒。
5.Hoechst染色法观察IκBαM重组腺病毒对人肝癌细胞株HepG2细胞核形态的影响重组腺病毒感染HepG2细胞48小时后，收集细胞用4％多聚甲醛固定30分钟，lmMHoechst33258染色10分钟，在荧光显微镜(激发波长365nm)下观察细胞核形态，计数凋亡细胞并计算凋亡率。
在本发明中，运用分子生物学相关技术，构建了IκBαM超级抑制物及其重组腺病毒表达载体，并在真核细胞中稳定持续表达。在进一步的体外实验研究中，联合TNF-α作用，初步显示了其抑制肿瘤细胞生长的效果。
本发明的优点在于(1).采用定点突变的方法构建了IκBαM超级抑制物，方法简单，便捷，易于操作，且能保证突变效果。较之于两端环化或N端截短的构建方法，IκBαM的表达量更高、更稳定。
(2).本发明中，采用美国John Hopkins癌症研究中心最新研制的腺病毒载体系统AdEasy System，构建IκBαM重组腺病毒。该系统的优点在于A.含有大部分腺病毒基因组序列的腺病毒骨架质粒，于超螺旋状态应用而不需要进行酶切处理。B.穿梭质粒与腺病毒骨架质粒的同源重组在细菌中而不是在细胞中进行。C.由于在所选细菌中具有较高效的同源重组机制，因此，在构建腺病毒重组体时不需要连接步骤。D.该系统可以允许插入10kb的目的基因，并且在同一腺病毒内导入多个目的基因。E.部分骨架质粒含有绿色荧光蛋白基因，因此可以直接观察转染和感染效率。该方法避免了在真核细胞内进行繁琐的同源重组步骤，而代之以简单的原核细胞内的同源重组。目的基因的表达鉴定和重组腺病毒的滴度测定，则采用了当前流行的荧光检测方法，使之更加简捷、方便。
(3).本发明中，构建的IκBαM重组腺病毒表达载体通过293细胞的扩增能实现IκBαM重组腺病毒的大量制备，以满足实验研究及以后的临床用药，克服了以往的真核表达体系的这方面缺陷。
(4).在实验研究中，我们以IκBα重组腺病毒为对照，显然比空载体或AdLac更有说服力。
(5).本发明中，在IκBαM超级抑制物应用时，用Hoechst染色法观察IκBαM重组腺病毒对人肝癌细胞株HePG2细胞核形态的影响，这种方法直观、方便。
核苷酸序列表<110>重庆医科大学<120>一种NF-(B抑制物及其制备方法、以及作为抗肿瘤药物的应用<160>2<210>1<211>420<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>mutation<222>(99)...(110)<223>体外定点突变法分两次将I(Bα基因中第32和36位编码丝氨酸的密码子分别进行定向诱变<400>1cgccatgttc caggcggccg agcgccccca ggagtgggcc atggagggcc cccgcgacgg 60gctgaagaag gagcggctac tggacgaccg ccacgacatc ggcctggacg ccatgaaaga 120cgaggagtac gagcagatgg tcaaggagct gcaggagatc cgcctcgagc cgcaggaggt 180gccgcgcggc tcggagccct ggaagcagca gctcaccgag gacggggact cgttcctgca 240cttggccatc atccatgaag aaaaggcact gaccatggaa gtgatccgcc aggtgaaggg 300agacctggcc ttcctcaact tccagaacaa cctgcagcag actccactcc acttggctgt 360gatcaccaac cagccagaaa ttgctgaggc acttctggga gctggctgtg atcctgagct 420<210>2<211>420<212>DNA<213>中国人种(Chinese kinds)<400>2cgccatgttc caggcggccg agcgccccca ggagtgggcc atggagggcc cccgcgacgg 60gctgaagaag gagcggctac tggacgaccg ccacgacagc ggcctggact ccatgaaaga 120cgaggagtac gagcagatgg tcaaggagct gcaggagatc cgcctcgagc cgcaggaggt 180gccgcgcggc tcggagccct ggaagcagca gctcaccgag gacggggact cgttcctgca 240cttggccatc atccatgaag aaaaggcact gaccatggaa gtgatccgcc aggtgaaggg 300agacctggcc ttcctcaact tccagaacaa cctgcagcag actccactcc acttggctgt 360gatcaccaac cagccagaaat tgctgaggc acttctggga gctggctgtg atcctgagct 420
权利要求
1.制备一种NF-κB抑制物(IκBαM超级抑制物)，其特征在于本发明在克隆IκBα基因的cDNA时采用特异的RT-PCR引物和两对诱变引物；将IκBα基因的第32和36位编码丝氨酸的密码子分别进行定向诱变，序列分析表明第95和106位核苷酸分别按设计由G变为T、由T变为G，即32位和36位编码丝氨酸的密码子分别定向诱变为编码异亮氨酸和丙氨酸的密码子，其余序列与GeneBank中的IκBα基因序列一致，结果表明构建成功了NF-κB的超抑制物IκBαM。
2.根据权利要求1所述的IκBαM超级抑制物的制备方法，其特征在于RT-PCR引物序列为上游引物5’-CTTAAGCTTAGCTCGTCCGCGCCATGTTC-3’；下游引物5’-GCTCTAGAGTCCATGTTCTTTCAGCC-3’。
3.根据权利要求1所述的IκBαM超级抑制物的制备方法，其特征在于两对诱变引物序列为诱变引物15′-GTCCAGGCCGATGTCGTGGC-3′，诱变引物25′-TCTTTCATGGCGTCCAGGCC-3′。诱变引物合成后均需5’端进行磷酸化。
4.根据权利要求1所述的IκBαM超级抑制物的制备方法，其特征在于IκBα基因的第32和36位编码丝氨酸的密码子分别定向诱变为编码异亮氨酸和丙氨酸的密码子。
5.IκBαM重组腺病毒(AdIκBαM)和对照AdIκBα的构建。其特征在于可通过腺病毒载体在肿瘤细胞内大量稳定持续表达NF-κB的超级抑制物IκBαM以及用于对照的IκBα；以及制备的产品(制剂)腺病毒重组体AdIκBαM和对照AdIκBα，它能在体外直接感染靶细胞或在体内局部注射到靶器官。
6.采用Hoechst染色法观察超级抑制物IκBαM诱导肿瘤细胞凋亡作用。其特征在于通过Hoechst染色可观察IκBαM对人肝癌细胞株HepG2细胞核形态的影响。
7.根据目前国外相关的研究报道及我们的体内外实验结果证实这种NF-κB抑制物(IκBαM超级抑制物)的特征在于能稳定、持续地抑制NF-κB的过度活化，能明显抑制肿瘤细胞生长、引起肿瘤细胞的凋亡，并能最终作为一种制剂运用到临床治疗恶性肿瘤，为恶性肿瘤的治疗开辟了一条新途径。
全文摘要
一种NF－κB抑制物及其制备方法、以及作为抗肿瘤药物的应用。本发明设计两对诱变引物和一对RT－PCR引物，运用分子生物学相关技术，采用体外定点突变法分两次将第32和36位编码丝氨酸的密码子分别进行定向诱变，构建了IκBαM超级抑制物，将超级抑制物IκBαM从pGEM－T载体亚克隆到pAdTrack－CMV穿梭载体中，然后与AdEasy－1 System系统的腺病毒骨架质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，线性化后转入293细胞进行包装、扩增以得到完整的重组腺病毒。然后在原核及真核细胞(包括293、HepG
文档编号C07K14/435GK1504483SQ0213419
公开日2004年6月16日 申请日期2002年11月29日 优先权日2002年11月29日
发明者黄爱龙, 刘冰熔, 向明确, 唐霓 申请人:重庆医科大学