专利名称：针对sars冠状病毒n蛋白抗原的抗体及其在sars冠状病毒或者其抗原检测中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及针对SARS冠状病毒核衣壳蛋白-N蛋白(nucleocapsid protein)的抗体，利用该抗体检测样品中SARS冠状病毒或者其抗原的存在情况的方法。本发明还涉及用于这些方法的试剂盒以及相应的产品。
背景技术：
重度急性呼吸综合症(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)是一种急性致死性病毒性感染性疾病。从首例感染在中国广东省报道，仅只数月的时间即流行感染到世界上32个国家。至2003年6月11日为止，世界上有8400受染者，789例死亡(WHO统计结果)。由于其快速传播、高死亡率和无有效治疗方法，使其成为威胁全球的病毒性感染的疾病。这种疾病的传染性强，严重影响患者的身体健康，并且有较高的致死率。
有确切的证据表明，SARS是由以前不知的、暂时命名为SARS冠状病毒(SARS coronavirus，SARS-CoV)的病毒所引起的。从若干个(大约35个)SARS-CoV遗传基因序列分析，以及与其它已知冠状病毒对比的结果，SARS-CoV是一29.7kb的正链RNA基因组，具有系统发生性和可变性。其基因表达具有非常复杂的转录、翻译和翻译后修饰机制，其分子机理有待进一步阐明。
目前已经有的临床SARS-CoV检测试剂有对血清抗体检测的酶联免疫方法和对病毒遗传物质检测的RT-PCR方法。由于感染后抗体产生需要1-3周的窗口期，而从感染到发病的潜伏期在SARS感染时很短(一般一周之内)，所以抗体检测对早期诊断没有意义。加之目前的抗体检测具有较高的假阳性率，特异性无法满足需要。RT-PCR的方法技术要求高，操作时间长，标本需要特殊处理及相应的设备，也有其不足之处。因而目前上述两种方法均未被WHO和美国CDC接受为SARS诊断的指标。现有技术中特别需要一种能在感染早期快速且灵敏地进行检测的方法。特异性的抗原诊断方法，尤其是快速、敏感、特异的SARS-CoV抗原诊断方法在SARS诊断中具有无可取代的意义。目前世界上尚没有关于SARS抗原诊断性试剂的报道。也未见以N抗原作为检测抗原的报道。
本发明提供了可在感染早期测定患者样品中的SARS抗原而诊断SARS的方法，从而满足了现有技术中的这一需求。
发明内容
本发明一方面提供了针对SARS冠状病毒N蛋白抗原的抗体。
本发明另一方面提供了利用所述抗体检测样品中SARS冠状病毒或其抗原的存在情况或进行定量的方法。
在又一个方面，本发明提供了适用于上述方法的试剂盒。
图1显示了本发明的试纸条测试方法对各稀释度的SARS冠状病毒裂解液和重组N蛋白的检测结果。其中山羊抗SARS-N蛋白多克隆抗体(4mg/ml)作为俘获抗体，分别抗C端和N端的单克隆抗体(#1和#10)作为胶体金缀合抗体组合使用，羊抗鼠IgG作为阳性对照。
具体实施例方式
SARS-CoV(SARS coronavirus)的核衣壳蛋白核酸序列全长共有1269个碱基(base)，示于SEQ ID NO1中。蛋白质序列全长共有422个氨基酸，示于SEQ ID NO26。对其抗原特异性进行分析，将SARS病毒N蛋白的RNA序列(genbank locusAY307165，1269bp，RNA linear VRL 09-Jun-2003；definitionSARS coronavirusnucleocapsid protein(NP)gene，complete cds.；AccessionAY307165；VersionAY307165.1，GI31540948；Protein_IDAAP49024.1)与GenBank+EMBL+DDBJ+PDB中登记的所有已知的共1,878,949个核酸序列、8,890,866,776个碱基(base)进行对比分析，发现该蛋白质的核酸序列不与任何已知的核酸序列重复。在与所有已知的蛋白序列进行对比分析时，发现SARS N蛋白仅与鼠肝炎冠状病毒的N蛋白在氨基酸序列位点40-175之间有35.7％的序列相同，在序列位点252-361之间有27.3％的序列相同。进一步地，在对已知的35种SARS病毒核酸序列进行比较后发现，N蛋白在所有病毒分离株中几乎完全相同。
而且，有数据表明，N蛋白在表达过程具有两种分子量(分子大小)，都可以与抗N蛋白的单克隆抗体反应。其中较短的N蛋白是与病毒的组成有关，较长的分子存在于细胞浆内，不参与病毒的组装，称为剩余N蛋白。二者在病毒感染的细胞内的表达量几乎相同。在对病毒裂解液进行Westerm Blot分析中，长和短型N蛋白表达量是棘突蛋白(Spike protein，S蛋白)和膜蛋白(M蛋白)表达量的25-50倍。以上现象使N蛋白有可能作为比较有利的病毒抗原免疫检测对象。不仅由于其在病毒组成中所占的蛋白含量高，易于检出；同时由于病毒感染细胞中含有较高的不参与病毒组装的剩余N蛋白的表达，有可能在病毒株释放的过程中，或在被感染细胞死亡过程中，此型的N蛋白会随之释放到细胞外，进入体液及血液，作为检测病毒感染及复制的免疫学指标。
本发明出乎意料地发现，针对SARS冠状病毒N蛋白的特异性抗体可以用于测定样品中SARS冠状病毒或其相应抗原的存在情况或者含量，并可达到很高的灵敏度和稳定性。
在本发明中，除了可使用具有具体公开序列的N蛋白作为抗原产生本发明的抗体之外，还可以采用其变体或融合多肽或免疫原性片段来产生。
在本发明的上下文中，SARS冠状病毒N蛋白的“免疫原性部分”是指在接种到个体体内后能够引起免疫应答、并且同样能够与针对SARS冠状病毒N蛋白产生的抗体结合的部分。因此，此处所述的蛋白质免疫原性部分可用抗体结合试验鉴定。这些试验通常可用本领域普通技术人员已知的多种方法中的任何一种进行，例如，在Harlow和Lane，《抗体实验室手册》(冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1988)中所述的方法。例如，可利用所述蛋白来产生单克隆和多克隆抗体，以用于检测SARS患者或疑似患者血液或其它样品中该蛋白的存在情况。
此处所用的多肽“变体”是与所述多肽区别仅在于保守性替代和/或修饰、而仍保留了多肽的免疫原性的多肽。多肽变体与已鉴定的多肽优选有至少约80％、更优选至少约90％、最优选至少约95％同一性。对于有免疫活性的N蛋白，其变体可通过例如修饰上述多肽之一的氨基酸序列并评估此修饰多肽的免疫活性而得以鉴定。
此处所用的“保守性替代”是指某一氨基酸被另一具相似特性的氨基酸所替代，肽化学领域内的技术人员可预知此多肽的二级结构和亲水特性并未实质性改变。通常说来，下述氨基酸组代表了保守性改变(1)丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸；(2)半胱氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸；(3)缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸；(4)赖氨酸、精氨酸、组氨酸；和(5)苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸。
变体可同时或只包含其它的修饰，包括删除或添加对该多肽抗原性、二级结构和亲水特性影响微小的氨基酸。例如，可将信号(或前导)序列在蛋白质的氨基末端与多肽缀合，该序列可以与蛋白质一起翻译，并在翻译后指导蛋白质的转移。多肽也可与接头或其它序列缀合，以易于多肽合成、纯化或鉴定(如多聚组氨酸)、或者增强多肽与固相支持物的结合。例如，可以将多肽与免疫球蛋白的FC区缀合。
此处所用的“多肽”还包括组合或融合多肽。“组合多肽”是含有至少一个上述免疫原性部分及一种或多种额外的免疫原性的SARS抗原性多肽，它们通过肽键连接成一条氨基酸单链。这些序列可直接连接在一起(即无插入的氨基酸)，或可通过不会明显削弱多肽组分免疫原性的连接序列(如Gly-Cys-Gly)连接在一起。
可用本领域熟知的多种方法中的任一种获得本发明的SARS蛋白和编码此类蛋白质的DNA分子。相当于编码本发明SARS病毒N蛋白之一的基因(或其一部分)的DNA序列可通过对经逆转录的SARS病毒RNA进行测序并与已知的SARS病毒核酸序列进行比对后得到。这样得到的部分DNA序列可用于设计寡核苷酸引物，以在RT-PCR中扩增全长DNA序列，所用技术在本领域是众所周知的(可见如Mullis等人，Cold Spring Harber Symp.Quant.Biol.，51263，1987；Erlich编，PCR技术，Stockton Press，纽约，1989)。一旦获得了编码多肽的DNA序列，即可用标准的诱变技术，如Adelman等(DNA，2183，1983)中所教导的寡核苷酸介导的定点诱变，轻易地引入上述任何一种修饰。本发明的序列也可以直接合成。
还可用合成或重组方式产生本文公开的SARS冠状病毒N蛋白或者其免疫原性部分。少于约100个氨基酸及通常少于约50个氨基酸的合成多肽可用本领域普通技术人员熟知的技术制备。例如，这类多肽可用任何可供利用的固相技术合成，如Merrifield固相合成方法，其中氨基酸被依次加到正在延长的氨基酸链上(可见于如，Merrifield，美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.852149-2146，1963)。多肽自动合成仪可购自如Perkin Elmer/应用生物系统分部(Foster城，CA)等厂家，并可按制造商的指示进行操作。
任何上述多肽均可重组产生，即将编码多肽的DNA序列插入表达载体中，并在适当的宿主中表达蛋白质。本领域普通技术人员所知的种种表达载体中的任一种均可用来表达本发明的重组多肽。在转化或转染了含有重组多肽编码DNA分子之表达载体的任何适当宿主细胞中均可进行表达。合适的宿主细胞包括原核细胞、酵母和高等真核细胞。优选所用的宿主细胞是大肠杆菌、酵母或哺乳类细胞系，如CHO细胞。以此方式表达的DNA序列可编码天然存在的多肽、天然存在多肽的部分，或它们的其它变体。
可通过本领域已知的多种方法，利用本发明的SARS冠状病毒N蛋白或其变体或者免疫原性部分来制备其特异性抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体。本发明的抗体也可以是单链的、嵌合的、移植CDR的或人源化的。这样的抗体可由本领域技术人员已知的众多技术制备。参阅，如Harlow和Lane，《抗体实验室手册》，冷泉港实验室，1988。在一种此类技术中，首先将含抗原性多肽的免疫原注射入多种哺乳动物(如兔、绵羊、马、驴和山羊等)的任一种中或者鸡中。在这一步中，本发明的多肽不需修饰即可作为免疫原。或者，特别是对于相对短的多肽而言，可将多肽与载体蛋白(如牛血清白蛋白或匙孔虫戚血蓝蛋白)连接在一起，以激发更强的免疫应答。将免疫原注射入动物宿主，优选根据预定的时间表，再注射一次或多次加强免疫，并定时对动物取血。对多肽特异的多克隆抗体可以从抗血清中，通过例如利用了偶联至合适固相支持物上的多肽的亲和层析法纯化得到。
不同于在实验动物和家畜中制备多克隆抗体的常规方法，可以利用已知的杂交瘤细胞培养技术制备抗N蛋白的单克隆抗体。一般来讲，这一方法包括制备产生抗体的融合细胞系，如将原代脾细胞与相容的骨髓瘤连续培养细胞系融合，通过细胞大量培养技术或转入骨髓瘤细胞来源动物或兼容动物品系中培养，使融合细胞生长。与免疫动物产生的抗体相比，此种抗体有较多优势，例如它们有很好的特异性、敏感性、在免疫化学上相比单纯。这些抗体的免疫活性片段也属于本发明的范围之内，如部分人源化的单克隆抗体F(ab)片段。
嵌合和修饰抗体嵌合抗体包括从一个免疫球蛋白来源的可变区与另一个免疫球蛋白来源的不变区之间的融合。可变区通常来源于另一个种的免疫球蛋白，也许是人。这一技术在本领域所通晓。例如欧洲专利申请EP-A-0125，023(Cabilly/Genetech)和EP-A-0120,694以及美国专利NO4,816,567。这些专利揭示了用重组DNA方法制备免疫球蛋白类分子变异体。
另一种制备嵌合或修饰抗体的途径是将单克隆抗体的免疫区与另一个非免疫球蛋白分子连接，产生嵌合分子衍生物(参见WO86/01533，(Veuberger and Rabbits/Celltech)。另一种方法是制备一个嵌合免疫球蛋白，使其在不同的可变区具有不同的特异性(参见EP68763)，还有一种方法是向编码单克隆抗体的DNA中引入一个突变，在不改变其基本特异性的情况改变它的某些性质，这个方面可以通过定点突变和其它在本领域内所通晓的技术完成。
利用重组DNA技术，Winter专利申请EP-A-0239400揭示了另一种制备抗体衍生物的方法，用另一种特异性免疫球蛋白的补体决定区替代一种免疫球蛋白可变区的补体决定区(CDRs)。这样，与读框区域的改变相结合，CDR移植技术可以使抗体人源化。
制备人抗体也可以在缺乏其天然免疫系统的小鼠体内重建人类的免疫系统，然后免疫小鼠以产生对抗原特异的人类抗体。
操作或改变任何已知抗体或编码抗体的基因，产生衍生抗体的技术，为本领域所通晓。
特异于目的抗原性多肽的单克隆抗体，举例而言，可以用Kohler和Milstein，欧洲免疫学杂志，6511-519，1976的技术和改进方法制备。简单的说，这些方法涉及制备能产生具有所需特异性(也就是与目的多肽的反应性)的抗体的永久细胞系。这种细胞系，可以由例如上述免疫动物的脾脏细胞获取。接着将脾脏细胞永生化，例如通过与骨髓瘤细胞融合伙伴、最好是与免疫动物同系的骨髓瘤细胞融合伙伴融合。可以采用多种融合技术。例如，将脾脏细胞和骨髓瘤细胞与非离子型表面活性剂混合几分钟，然后以低密度平铺在能够支持杂合细胞生长而不能支持骨髓瘤细胞生长的选择性培养基上。优选的选择技术中利用了HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸苷)筛选。经过足够时间，通常大约1到2周后，就可观察到杂合体集落。挑取单个集落，检测其与多肽的结合活性。优选具有高反应活性和特异性的杂交瘤。
单克隆抗体可以从正在生长的杂交瘤集落上清液中分离得到。此外，可采用多种技术提高产量，例如将杂交瘤细胞系注射到合适的脊椎动物宿主如小鼠的腹腔中，然后可从腹水或血液中收获单克隆抗体。抗体中的污染物可以用常规技术除去，如层析法、凝胶过滤、沉淀和抽提。本发明的多肽可在纯化过程中用于例如亲和层析步骤。
本领域常规技术人员已知多种使用抗体检测样品中的多肽标记的测定方式。见例如，Harlow和Lane，《抗体实验室手册》，冷泉港实验室，1988。在一优选实施方案中，测定包括使用固定在固相支持物上的抗体来结合N蛋白抗原并将其与样品的其余部分分开。结合的N蛋白-抗体复合物随后可用含报告基团的第二抗体检测。或者，可利用竞争性分析，其中多肽被报告基团所标记，并在样品与抗体共同保温后使其结合到固定化的抗体上。样品中组分抑制标记多肽与抗体结合的程度预示了样品与固定化的抗体的反应活性。
固相支持物可以是本领域普通技术人员所已知的、抗体可附着于其上的物质。例如，固相支持物可以是微量滴定板上的检验孔或硝酸纤维素膜或其它合适的膜。或者，支持物可以是珠子或盘，诸如玻璃、纤维玻璃、乳胶、胶体金或塑料材料，如聚苯乙烯或聚氯乙烯。支持物也可以是磁性颗粒或纤维光学传感器，例如公开于美国专利号5,359,681中的那些材料。抗体可用本领域技术人员已知的多种技术固定在固相支持物上，这些技术在专利和科学文献中有充分的描述。在本发明的上下文中，“固定化”一词指非共价结合(如吸附)，及共价结合(可为抗体与支持物上官能团间的直接连接，或通过交联试剂的连接)。通过吸附到微量滴定板的孔上或膜上而固定化的方法是优选的。在这类情形中，可通过在适合的缓冲液中，使抗体与固相支持物接触一段合适的时间而完成吸附。接触时间随温度而变化，但通常是在约1小时到1天之间。一般说来，将塑料微量滴定板(如聚苯乙烯或聚氯乙烯)小孔与约10ng-10μg、优选约100ng-1μg的抗体接触，足以固定适当量的结合剂。
一般可通过将双功能试剂与支持物首先反应来完成抗体与固相支持物的共价附着，所述双功能剂可与支持物及结合剂上的官能团(如羟基或氨基)二者反应。例如，利用苯醌，或通过在固相支持物上的醛基与抗体上的胺基和活性氢之间发生缩合，可以将抗体与具有适当聚合物包被的支持物共价连接起来。[参阅Pierce ImmunotechndogyCatalog and Handbook，1991，于A12-A13]。
在某些实施方案中，可通过双抗体夹心分析对样品中的SARS冠状病毒或者其相应抗原的存在情况或者含量进行测定。首先将固定在固相支持物(常为微量滴定板的孔)上的抗体与样品接触，以使样品中的多肽结合到固定化的抗体上，从而完成这一分析。随后将未结合的样品从固定化多肽-抗体复合体中去除，并加入能结合多肽上另一位点的第二抗体(含一报道基团)。然后用适于特定报告基团的方法测定依然结合于固相支持物上的第二抗体的量。
更具体地说，一旦抗体如上所述被固定于支持物上，通常封闭支持物上残余的蛋白质结合位点。许多适合的封闭剂对本领域普通技术人员是已知的，如小牛血清白蛋白或吐温20TM(Sigma化学公司，圣路易斯，MO)。然后将固定化抗体与样品共同保温，使多肽与抗体结合。温育前可用合适的稀释液稀释样品，如磷酸盐缓冲液(PBS)。一般说来，合适的接触时间(即保温时间)是足以确定样品中SARS冠状病毒N蛋白存在情况的时间。优选的接触时间是足以使结合水平达到结合和未结合多肽平衡时结合水平的至少95％的时间。本领域普通技术人员会认识到，通过一段时间内的结合水平，可以很方便地测定达到平衡所必需的时间。室温时，大约30分钟的保温时间通常就足够了。
然后，可用适合的缓冲液(如含0.1％吐温20TM的PBS)清洗固相支持物而去除未结合样品。含报告基团的第二抗体可随后加到固相支持物上。优选的报告基团包括酶(如辣根过氧化物酶)、底物、辅助因子、抑制剂、染料、放射性核素、发光基团、荧光基团和生物素。抗体与报告基团的缀合可用本领域普通技术人员所知的标准方法完成。
然后将第二抗体与固定化的抗体-多肽复合体温育足够长时间，以检测相关多肽。通常根据试验一段时间后的结合水平来确定适当的温育时间。接着除去未结合的第二抗体，并通过报告基团检测结合的第二抗体。检测报告基团的方法取决于报告基团的性质。对于放射性基团，闪烁计数法或放射自显影方法通常是可行的。光谱法可用来检测染料、发光基团和荧光基团。生物素可用偶联了其它报告基团(通常是放射性或荧光基团或酶)的抗生物素蛋白来检测。通常通过加入底物(一般持续特定时间)、再用光谱法或其它方法分析反应产物而对酶报告基团进行检测。
为了确定样品中SARS冠状病毒或者其相应抗原的存在情况或者含量，通常将测得的仍结合于固相支持物的报告基团的信号与标准曲线进行比较。在一个优选的实例中，标准曲线是通过将固定化的抗体与系列稀释的SARS冠状病毒裂解液或者相应抗原一起温育，并将检测到的信号与病毒裂解液或抗原滴度/浓度进行作图而得到的。
在一个相关实例中，可以流通形式进行该分析。其中抗体被固定在膜，如硝酸纤维素上。在试验过程中，当样品流经膜时，样品中的多肽即与固定化的抗体相结合。然后，当含有第二抗体的溶液流经膜时，标记的第二抗体即与抗体-多肽复合体相结合。结合的第二抗体的检测可依上述方法进行。
在另一个相关实例中，可以试纸条试验形式进行该分析。其中，将结合了抗体的膜的一端浸入含样品的溶液中。样品沿着膜迁移，经过含第一抗体的区域，至俘获抗体(第二抗体)的区域。第一抗体在俘获抗体的区域的集中说明病毒或相应抗原的存在。通常，第一抗体在该位点的集中产生了可见的样式，如一条线。没有这种样式说明是阴性结果。在一个实施方案中，用于试纸条试验的膜是硝酸纤维素膜，尼龙膜或类似物等。第一抗体可以是多克隆抗体，也可以是一或多种单克隆抗体，或者其组合。第二抗体也可以是多克隆抗体，或者一或多种单克隆抗体，或者其组合。第一抗体和第二抗体的配对使用情况可经配合实验确定，这在下文中将会更具体描述。第一抗体可以附着在胶体金颗粒、磁性颗粒、微珠等上。优选地是胶体金颗粒，其大小可以是10-100nm，优选20-60nm，尤其是例如40nm。优选地，对检测样品进行进一步处理，使其抗原性提高。例如，对样品进行裂解处理，以暴露其N蛋白抗原。裂解可采用例如0.001-0.2％SDS，优选地0.005-0.15％SDS、更优选0.01-0.1％SDS在室温处理，或者煮5-10分钟。在检测SARS病毒时，还可以在检测前对病毒进行Vero细胞扩增，然后检测，这样对样品中的SARS冠状病毒检测下限能达到更低。通常，固定在膜上的抗体的选用量是，当生物样品中含有足以能在双抗体夹心试验中产生阳性信号的多肽水平时，在上述检测方式中也能产生可肉眼察觉的样式。优选地，固定在膜上的抗体量为约25ng-1μg，更优选为约50ng-500ng。这类检测可对很小量的生物样品进行。这种快速的SARS免疫检测试纸条方法具有灵敏、快速、特异、简便(操作不需要特殊技术和设备)和早期诊断的优点，而且还可减少样本检测废弃物(液)的产生，在疾病的隔离、防污染方面有其它检测方法不具备的优点。
适用于本发明的抗体可以多种多样，只要其具有足够的反应活性、并且对重组N蛋白及天然SARS冠状病毒裂解物的反应性相当(最好相等)即可。配对抗体的选择可依常规方法进行，例如普通双抗体夹心实验。简言之，将第一抗体固定在96孔微量滴定板的孔中，加入标准N蛋白抗原与之温育足够时间，以便充分结合。然后加入例如经辣根过氧化物酶标记的第二抗体，温育。洗涤去除未结合的第二抗体之后，用相应标记的底物显色。选择出第二抗体能够结合于其上的组合(即第一抗体和第二抗体之间不会发生拮抗作用)。在一个实施方案中，所述第一抗体和第二抗体都是多克隆抗体。在另一个实施方案中，所述第一抗体是一种单克隆抗体或者两种以上单克隆抗体的混合物，而所述第二抗体是多克隆抗体。在又一个实施方案中，所述第一抗体和第二抗体是能够相配合的单克隆抗体。
在本发明的上下文中，“能够相配合的抗体”是指所述抗体针对的是N蛋白抗原中不同的表位、在与N蛋白抗原的结合中不发生相互干扰或拮抗的抗体组合。
本发明中的抗体配合测试可以例如按照下述方法进行用单株单克隆抗体或多株单克隆抗体的组合作为俘获抗体(喷在膜上)，用其它的单株单克隆抗体或多株单克隆抗体的组合作为胶体金缀合抗体(gold conjugate)。也可以用多克隆抗体(羊抗SARS-N抗体)作为俘获抗体(喷在膜上)，单株或多株单克隆抗体作为缀合抗体。用1mg/ml抗IgG喷膜作为对照线。作为标记抗体的用量决定于每一单种抗体本身的特性，以能够在加入10％v/v的10％氯化钠后胶体金颗粒不发生凝聚为标准，这可通过系列稀释度确定。
标记好的抗体的用量可以决定试剂的敏感度，一般以已标记抗体的胶体金的OD(常用的40nm胶体金颗粒在520-530nm波长处的吸光度)和用在金膜(gold pad)上的量有关。生产中将胶体金缀合抗体施加到金膜上有两种方法，即传统的浸泡法和改进的喷膜法。前者一般用OD530在1-10之间的悬液通过OD浓度有限度的调节标记抗体的用量；后者一般用OD530＝50的悬液喷膜，但在无法将胶体金缀合抗体复合物浓缩到OD530＝50的悬液的情况下则可采用OD530＜50以下所能浓缩到的最高浓度。其用量是以喷到金膜上的体积来决定的。一般可工作范围的体积在1-2.5ul/cm之间。在本发明的SARS N蛋白抗原检测试剂研制中，所有标记抗体均在0.5-3.0ul/cm之间系统测试过，通常在1-2.5ul/cm可以达到相当的敏感度，在2.0-3.0之间达到最好的敏感度。作为俘获抗体的用量也决定于不同单克隆抗体本身的特性，如抗体的亲和力、抗体纯度、抗体之间是否有相互累加或拮抗作用等等，多克隆抗体的用量决定于抗体的滴度、提纯方法(是否经过亲和层析拄提纯或只是简单的免疫学清的IgG级分)等因素。一般抗体用量在0.5mg/ml-5mg/ml之间，优选1mg/ml-3mg/m。最高敏感度要由抗体(俘获抗体和胶体金缀合抗体)的组合及配合情况而定。
本发明人发现，利用抗SARS冠状病毒N蛋白的抗体，可以试纸条的方式简便地测定样品中SARS病毒的存在情况，并且可达到与迄今已报导的RT-PCR检测灵敏度(1000pfu/ml)。优选地，所述第一抗体被标记上胶体金。胶体金颗粒的大小可以是例如20-60nm，尤其是40nm。在本发明中，可以使用大小并不均一的胶体金颗粒。可通过常规方法用第一抗体与胶体金缀合。这样的方法在现有技术中有众多的科技文献可供参考，也可见于诸多胶体金颗粒生产厂家例如Arista Biologicals Inc.的网页。
标记环境的pH值对标记效率有直接的影响。多克隆抗体对胶体金的标记一般在pH7.2-7.5进行。对于单克隆抗体，标记环境pH值一般是比其pI(等电点)偏碱性约0.1-0.5。这可通过测定具体单克隆抗体的pI值来确定。或者，可通过设置pH值梯度，测定单克隆抗体在不同pH值下对胶体金的标记效率、选择最佳者来确定。标记抗体的用量足够标记之用即可，不宜过多，否则会增加成本，更为严重的是会干扰测定反应。直接的检测方法是以能够在加入1/10体积的10％NaCl溶液后室温静置10分钟胶体金颗粒不发生凝聚为标准。选用能达到此程度的最低抗体浓度进行胶体金颗粒的标记。标记好的胶体金颗粒悬液(通常OD530nm的读数在1.0-10之间)可以通过传统的直接浸泡法施加到金膜(gold pad)上。或者，可对标记好的胶体金颗粒悬液浓缩，例如2400g-4400g、4℃离心30-60分钟浓缩成OD530nm的读数达到50或其最大值的悬液，然后通过改进的喷膜法以0.5-3.0μl/cm、优选1.0-3.0μl/cm、例如1-2.5、2.0-3.0μl/cm的用量喷到金膜上。
作为“俘获抗体”的第二抗体，其用量取决于抗体本身的性质和纯度，以及与第一抗体的配合情况。例如与单克隆抗体的亲和力、抗体纯度、抗体之间是否有相互累加或拮抗效应等因素有关。作为多克隆抗体，其用量决定于例如抗体的滴度、提纯方法等。一般在1mg/ml-5mg/ml之间。可以通过常规方法确定最佳的第一抗体&第二抗体组合和用量。例如，在按照前文所述方法确定了合适的第一抗体与第二抗体组合后，在96孔微量滴定板上用系列稀释的第一抗体包被相应孔，再与适当浓度的SARS冠状病毒N蛋白抗原温育足够时间。充分结合后，去除温育液，加入系列稀释的标记第二抗体温育。之后显色。选择落入ELISA读数器适合读取的数值范围的第一抗体&第二抗体配合用量。在以后的实验室或临床检测中即可采用这样确定的范围。通过对系列浓度的标准N蛋白抗原或SARS病毒裂解液读数，制成标准曲线，本发明的双抗体夹心检测法还可以用于对样品中的N蛋白抗原或SARS病毒含量进行定量测定。
在本发明的方法中，第一抗体和第二抗体无需精制而通过简单的硫酸铵沉淀和透析后即可使用。当然，毫无疑问，经过例如亲和纯化的抗体也可用于本发明中。
在本发明的试纸条测定方法中，除了胶体金颗粒之外，还可以使用经第一抗体标记的磁性颗粒、胶乳颗粒等来进行。其中相应颗粒的标记、用量、第二抗体的用量等均可常规地确定。
还可以采用例如毛细管等方法，经本发明公开的双抗体夹心法检测样品中的SARS冠状病毒或相应的N蛋白抗原。这样的测定方式均是本领域中已知的，并且有众多的文献可供参考。
本发明的测定方法中检测的是N蛋白抗原，即核衣壳蛋白。在完整的病毒颗粒中是包被在颗粒内部的。因此，若未经裂解，在完整SARS冠状病毒中是检测不到的。然而，研究结果表明，病毒感染细胞中含有较高的不参与病毒组装的剩余N蛋白的表达，有可能在病毒株释放的过程中，或在被感染细胞死亡过程中随之释放到细胞外，进入体液及血管，作为检测病毒感染及复制的免疫学指标，从而通过本发明的方法直接、简便、快速地进行检测。
若是检测完整病毒的N蛋白抗原，则可简单地用0.001-0.2％、优选0.005-0.15％、更优选0.01-0.1％、例如0.05％SDS处理样品，以便裂解病毒颗粒，释放N蛋白抗原来进行检测。
在试纸条实验中，可以简单地将试纸条浸入样品或裂解液中来进行检测。这大大简化了样品的处理，节约了时间，在临床诊断上有重要的意义。
当然，存在大量适合于与本发明抗体一起使用的试验方法。上述描述只是举例说明。
在另一个实例中，SARS冠状病毒N蛋白可作为监控SARS患者病情的标记使用。在这个实例中，上述就SARS诊断所述的测定可随时间进行，并评估反应性多肽水平的改变情况。举例而言，可在1个月至1年期间每24-48小时进行一次测定，以后按需要进行。通常，经抗体检测，多肽水平持续增加，说明患者体内SARS一直在发展。相反，当反应多肽的水平随时间降低时，SARS不再发展。
本发明的抗体和/或方法，可以用于对适当病人标本进行检测，作为疗效观察的指标及是否具有传染性和是否需要隔离的指标。其中一个实施方案是为治疗性干预提供监测方案。优选的，在治疗过程中周期性监测SARS冠状病毒N蛋白水平，在治疗开始前或治疗结束后对SARS冠状病毒N蛋白水平的周期性测定可能非常有益。
此处所述“患者”是指任何温血动物，优选是人，患者可以是患病的，或不患有可察觉的疾病。
在本发明的上下文中，“样品”可以是任何可能含有SARS病毒或其抗原的样品，包括例如血清、全血、痰液、口腔/鼻咽分泌物或洗液、尿液、粪便、胸腹腔积液、脑脊液和组织标本。
本发明提供了一个对怀疑有SARS病毒污染的生理标本进行检测的诊断试剂盒。该试剂盒包括(a)本发明的针对SARS冠状病毒N蛋白的抗体，例如一种或多种单克隆抗体和/或多克隆抗体；(b)任选的样品处理溶液，例如0.01-0.2％SDS；和(c)使用说明书。本发明的诊断试剂盒中还可含有适当的可检测标记物(例如辣根过氧化物酶)和相应的标记和检测试剂。在一个实施方案中，所述试剂盒中包含能够配合使用的第一抗体和第二抗体。优选地，所述第一抗体与胶体金、磁性颗粒、胶乳等相缀合。
本发明进一步提供了一种检测或测定样品中SARS病毒的方法。该方法包括将任选地经过处理(例如利用0.01-0.2％SDS于室温处理过)的样品与本发明的抗SARS冠状病毒N蛋白抗体混合，形成一种包括抗体和抗原的二价复合物，对形成的复合物进行定性检测和定量测定。该复合体的存在或数量指示了SARS病毒的存在情况或者含量。本发明的抗体包括人或动物的单克隆抗体，多克隆抗体制剂，以及抗体片段或合成抗体。合成抗体包括重组抗体和嵌合抗体，其又包括人源化抗体，抗独特型抗体及其衍生物。
通过以下实施例对本发明作进一步的说明。这些实施例都是示范性的，并不以任何方式限制本发明。
实施例1、N蛋白基因合成N蛋白核酸序列全长为1269bp，蛋白序列全长共有422个氨基酸。因为SARS病毒为经空气传播的严重威胁生命的传染性疾病的病原体，从安全考虑以人工合成为安全和简单。依据于2003年6月19日在GenBank发表的SARS冠状病毒核衣壳蛋白(NP)基因完整编码区核酸序列(LocusAY307165 Protein_id＝“AAP49024.1”合成整个编码区序列，该序列示于SEQ ID NO1，其推断的氨基酸序列示于SEQ ID No26。
N蛋白编码基因合成策略如下1 357911131517195’----- - - - -3’3’----- - - - -5’2 46810 1214161820为完成完整核酸序列的合成，首先合成如下寡核苷酸1)5’atgtctgataatggaccccaatcaaaccaacgtagtgccccccgcattacatttggtggacccacagatt 3’(SEQ ID NO2，对应于SEQ ID NO1中第1-70位核苷酸所示序列)；2)5’ctgttttggccttgccccattgcgtcctccattctggttattgtcagttgaatctgtgggtccaccaaat 3’(SEQ ID NO3，对应于SEQ ID NO1中第51-140位核苷酸所示序列的互补序列)；3)5’ccgaccccaaggtttacccaataatattgcgtcttggttcacagctctcactcagcatggcaaggaggaacttagatt 3’(SEQ ID NO4，对应于SEQ ID NO1中第123-200位核苷酸所示序列)；4)5’tagccaatttggtcatctggaccactattggtgttgattggaacgccctggcctcgagggaatctaagttcctccttgcc 3’(SEQ ID NO5，对应于SEQ ID NO1中第181-260位核苷酸所示序列的互补序列)；
5)5’ccagatgaccaaattggctactaccgaagagctacccgacgagttcgtggtggtgacggcaaaatgaaagagctcagccccag 3’(SEQ ID NO6，对应于SEQ IDNO1中第241-323位核苷酸所示序列)；6)5’ttgttagcgccgtagggaagtgaagcttctgggccagttcctaggtaatagaagtaccatctggggctgagctctttca 3’(SEQ ID NO7，对应于SEQ ID NO1中第305-383位核苷酸所示序列的互补序列)；7)5’ttccctacggcgctaacaaagaaggcatcgtatgggttgcaactgagggagccttgaatacacccaaagaccacattggcac 3’(SEQ ID NO8，对应于SEQ ID NO1中第365-446位核苷酸所示序列)；8)5’tttggcaatgttgttccttgaggaagttgtagcacggtggcagcattgttattaggattgcgggtgccaatgtggtctttgg 3’(SEQ ID NO9，对应于SEQ ID NO1中第428-509位核苷酸所示序列的互补序列)；9)5’tcaaggaacaacattgccaaaaggcttctacgcagagggaagcagaggcggcagtcaa gcctcttctcgctc ctcatcacgtagtcgcg 3’(SEQ ID NO10，对应于SEQID NO1中第488-577位核苷酸所示序列)；10)5’tcgagcaggagaatttcccctactgctgccaggagttgaatttcttgaattaccgcgactacgtgatgagg 3’(SEQ ID NO11，对应于SEQ ID NO1中第560-630位核苷酸所示序列的互补序列)；11)5’ggaaattctcctgctcgaatggctagcggaggtggtgaaactgccctcgcgctattgctgctagacagatt gaaccagcttg 3’(SEQ ID NO12，对应于SEQ IDNO1中第613-694位核苷酸所示序列)；12)5’gatgcctcagcagcagatttcttagtgacagtttggccttgttgttgttggcctttaccagaaactttgctctcaagctggttcaatctgtc 3’(SEQ ID NO13，对应于SEQ ID NO1中第676-767位核苷酸所示序列的互补序列)；13)5’aatctgctgctgaggcatctaaaaagcctcgccaaaaacgtactgccacaaaacagtacaacgtcactcaag catttgggagacgtg 3’(SEQ ID NO14，对应于SEQID NO1中第749-835位核苷酸所示序列)；
14)5’atcagttccttgtctgattaggtcttggtccccgaaatttccttgggtttgttctggaccacgtctcccaaatgcttg 3’(SEQ ID NO15，对应于SEQ ID NO1中第817-894位核苷酸所示序列的互补序列)；15)5’ctaatcagacaaggaactgattacaaacattggccgcaaattgcacaatttgctccaagtgcctctgcattc tttggaatgtca 3’(SEQ ID NO16，对应于SEQ IDNO1中第874-957位核苷酸所示序列)；16)5’taatggctccatgataagtcagccatgttcccgaaggtgtgacttccatgccaatgcgtgacattccaaagaatgcaga 3’(SEQ ID NO17，对应于SEQ ID NO1中第937-1015位核苷酸所示序列的互补序列)；17)5’gacttatcatggagccattaaattggatgacaaagatccacaattcaaagacaacgtcatactgctgaacaa gcacatt 3’(SEQ ID NO18，对应于SEQ ID NO1中第996-1074位核苷酸所示序列)；18)5’gctctgttggtgggaatgttttgtatgcgtcaatgtgcttgttcagcagtat 3’(SEQID NO19，对应于SEQ ID NO1中第1054-1105位核苷酸所示序列的互补序列)；19)5’acattcccaccaacagagcctaaaaaggacaaaaagaaaaagactgatgaagctcagcctttgccgcagagacaaaagaagcagcccactgtgactcttcttcctgcggctg 3’(SEQ IDNO20，对应于SEQ ID NO1中第1087-1198位核苷酸所示序列)；20)5’ttatgcctgagttgaatcagcagaagctccactcatggaattttgaagttgtctggagaaatcatccatgtcagccgcaggaagaagag 3’(SEQ ID NO21，对应于SEQ IDNO1中第1181-1269位核苷酸所示序列的互补序列)。
利用DNA自动合成仪合成上述寡核苷酸，并进行凝胶纯化，以20pmol/μl溶于dH2O中。
2)退火，将寡核苷酸1-20各种各2μl(20pmol/μl)温和混合。在干燥加热器内加热到90℃10分钟，冷却至室温大约1小时。
3)延伸按常规PCR向寡核苷酸混合物中加入PCR缓冲液、MgCl2、dNTP和Taq聚合酶，于56℃延伸5分钟，然后冷却至4℃。此步骤将填平所有的缺口。
4)连接向经过退火的寡核苷酸混合物中加入足量的T4连接酶(New England Biolabs)、连接酶缓冲液和dH2O，使体积加倍。于16℃连接过夜。
5).PCR使用如下引物，以步骤4)中获得的连接产物为模板，PCR扩增全长和部分截短的SARS冠状病毒N蛋白编码序列引物15’caccatgtctgataatggacccca 3’(SEQ ID NO22)，其中斜体为5’末端添加的核苷酸，其余核苷酸对应于SEQ ID NO1中第1-20位残基；引物25’tgcctgagttgaatcagcag 3’(SEQ ID NO23)，对应于SEQID NO1中第1247-1266位残基的互补序列；引物35’gccgtcaccaccacgaact 3’(SEQ ID NO24)，对应于SEQID NO1中第282-300位残基的互补序列；引物45’caccatggaagtcacaccttcgggaa 3’(SEQ ID NO25)，其中斜体为5’末端添加的核苷酸，其余核苷酸对应于SEQ ID NO1的第970-988位残基。
将引物1与引物2，引物1与引物3和引物4与引物2组合使用时获得的产物分别克隆到pET101/D-TOPO载体(1nvitrogen公司)内，克隆操作按照Invitrogen ChampionTMpET定向TOPO表达试剂盒进行。得到三种重组表达质粒pET-1、pET-2和pET-3。其中pET-1表达全长N蛋白序列(422个氨基酸)加上C-末端的6×His标签；pET-2表达N末端的截短N蛋白(大约100个氨基酸)加上C-末端6×His标签；pET-3表达C-末端的截短N蛋白(约99个氨基酸)加上C-末端6×His标签。
6)测序使用试剂盒内提供的通用测序引物对三种克隆测序，选择出序列完全正确的克隆。
7)表达按照试剂盒说明书进行。
8)纯化遵循用于融合了6×His标签的重组蛋白的标准方案进行。
实施例2.利用山羊抗SARS冠状病毒N蛋白多克隆抗体进行双抗体夹心分析(1)多克隆抗体的制备按照常规方法，用实施例1中制备的全长SARS病毒N蛋白免疫接种山羊，并加强免疫。由免疫山羊血清分离多克隆抗体，并经硫酸铵纯化，对PBS透析。沉淀。
(2)将多克隆抗体与胶体金颗粒缀合利用Arista Biologicals Inc.的胶体金标记试剂盒，将山羊抗SARS病毒N蛋白的多克隆抗体缀合40nm胶体金颗粒备用。
(3)以常规方法制备试纸条，其中与胶体金缀合的山羊抗SARS冠状病毒N蛋白多克隆抗体为第一抗体，单纯的山羊抗SARS病毒N蛋白多克隆抗体作为“俘获抗体”-第二抗体，兔抗山羊IgG为阳性对照。将试纸条浸入含SARS病毒裂解液(102、103、104、105pfu/ml)的样品中。取出后静置5分钟，在103pfu/ml以上数量级的样品中可明显观察到阳性的显色条带。
实施例3鼠抗SARS-N蛋白单克隆抗体的制备I.抗原的准备将实施例1中制备的全长SARS-N重组蛋白质抗原溶解于1×PBS中，制备成0.5mg/ml的工作液。
II.小鼠Balb/c雌性小鼠，5-6周龄。8-9周龄时开始免疫。
III.杂交瘤的制备1).将1.5ml浓度为1.0mg/ml的全长SARS-N蛋白与等体积完全性弗氏佐剂混合。
2).初次免疫小鼠每只小鼠注射0.5ml，共免疫6只。
3).加强免疫从初次免疫后第14天开始加强免疫，然后每14天加强免疫一次。加强免疫采用抗原与不完全弗氏佐剂的混合物进行，共加强免疫3次。在第3次加强免疫后的第10天，采集尾静脉血。用1×PBS分别将免疫小鼠血清及未免疫小鼠血清稀释成不同的浓度，ELISA方法检测抗体滴度。
检测程序用2μg/ml浓度的N蛋白抗原包被酶标板。每孔加入5μl血清和45μl样本稀释液(1×PBST)。每个稀释度均做双孔。37℃保温1小时。洗板五次。加入1∶8000的羊抗鼠IgG-HRP，37℃保温1小时。洗板五次。TMB显色37℃10分钟。0.2N硫酸终止反应。450nm波长下读数。结果见表1。
表1 ELISA方法检测抗体滴度结果。
3).最终免疫于初次免疫后第56天，分别将0.2μ过滤的100μl抗原不加佐剂进行静脉注射和同侧足掌内注射。。
4).免疫小鼠淋巴细胞制备于初次免疫后第60天，处死小鼠。分离腹股沟淋巴结，置于10ml已预热至37℃的无血清培养基中，分离淋巴细胞。400g离心5分钟，重悬于5ml无血清培养基中。
5).骨髓瘤细胞Ag8.8(可从ATCC获得)的准备于融合前6天将细胞株从液氮复苏。融合前一天，用含10％血清的新鲜培养基将细胞分离为5×105细胞/ml。融合的当天早晨，在10ml过夜培养瓶中加入等体积的含20％胎牛血清的培养基。400g离心5分钟，重悬于5ml无血清培养基中。
6).细胞融合将制备好的5ml淋巴细胞和5ml骨髓瘤细胞合并，400g离心5分钟，小心移去上清。缓慢加入0.2ml预温为37℃的30％PEG溶液使细胞融合。将融合后的细胞转移至100ml含20％胎牛血清、1×OPI、1×AH的培养基中，种入10个96孔培养板，每孔100微升，置于于二氧化碳培养箱中37℃培养。10天后，可观察到每板均有数十个克隆。
7).杂交瘤的筛选融合后第10天，用ELISA方法筛选阳性克隆。用2μg/ml全长N抗原、N端和C端的N蛋白分别包被酶标板。每孔加入20μl培养基上清及30μl样本稀释液(1X PBS，2％BSA，0.05％NP-40，0.01％NaN3)37℃温育60分钟。洗板五次。加入1∶8000的羊抗鼠IgG-HRP。37℃温育60分钟。洗板五次。TMB显色10分钟。0.2N硫酸终止反应。450nm读数。选择所有对全长N蛋白及N端片段均为阳性的杂交瘤和所有对全长N蛋白及C端片段均为阳性的杂交瘤。根据ELISA结果及显微镜下观察，随机挑选出40个孔的细胞，培养于24孔板。4天后，用ELISA方法筛选。具体方法同上。共选出30株杂交瘤。
8).用细胞培养基的上清再进一步作Western印迹。用全长N蛋白，N端片段和C端片段进行SDS-PAGE，转移到硝酸纤维素膜上，用5％脱脂奶粉封闭，洗涤，加入不同细胞株的培养基上清，洗涤，加入羊抗鼠IgG-HRP，最后加入显色剂显色。选择ELISA和WesternBlot均反映较强的、N端片段与全长蛋白或者C端片段与全长蛋白都反应的细胞株保存，并通过有限稀释进一步亚克隆，获得14株单克隆。将它们分别编号为#1-#14，其中#1-#6对N端片段与全长蛋白都反应，#7-#14对C端片段与全长蛋白都反应。
9).单克隆杂交瘤的培养和储存稳定的杂交瘤在含2％灭活胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、100U/ml青霉素-链霉素、1mM丙酮酸钠、5.5×10-5M 2-巯基乙醇的HB101培养基中进行体外传代培养。细胞浓度为2-2.5×105/ml，保存于37℃含8％二氧化碳的温箱中。细胞换液后，悬于含20％FCS和10％DMSO的基本培养基中，5×106个/ml/管，缓慢冻存于液氮中。
10).单克隆抗体的纯化收集单克隆细胞培养基上清，用50％饱和硫酸铵沉淀，随即于PBS(pH7.2)中透析，离心吸取上清，加入0.02％的叠氮化钠，储存于-70℃。
11).单克隆抗体的鉴定 Western Blot抗原样品电泳制备抗原样品，浓度为10μg/ml，并电泳分离。电转移到硝酸纤维素膜上后用5ml封闭液(0.05％脱脂奶粉)封闭。然后换入用封闭液按1∶1000稀释过的第一抗体，在室温下持续摇动30～60分钟。取出膜用TTBS洗膜四次，每次10-15分钟。再加入用封闭液按1∶2000稀释过的HRP-羊抗鼠IgG抗体缀合物。按常规方法使膜显色，条带应在10-30分钟内出现。
直接ELISA法在酶标板中包被N蛋白抗原，包被浓度为2ug/ml。封闭后加入系列稀释的抗N蛋白单克隆抗体，37℃温育30分钟，洗板后再加入HRP标记的羊抗鼠IgG，37度温育30分钟，TMB显色。
上述实验证实所获得的#1-#14杂交瘤都分泌与N蛋白抗原特异性反应的单克隆抗体。
实施例4抗N蛋白抗体与病毒抗原的免疫反应性的检测为确定抗N蛋白抗体与重组N蛋白抗原和SARS病毒天然N蛋白抗原之间的免疫反应性是否存在差异，需确保使用等同量的重组抗原和天然抗原。为此，对重组全长N蛋白抗原500ng和SARS病毒裂解产物系列滴度液进行SDS-PAGE电泳，通过N蛋白条带的亮度确定与重组蛋白用量相当的SARS病毒滴度。用等同量的重组全长N蛋白抗原和经SDS处理的SARS病毒裂解液分别包被板，用HRP标记的#1-#10杂交瘤单克隆抗体与其反应，选择二者之间反应强度相等或相近的抗体作为最终使用的抗体。结果得到除#2和#7外的其余12株杂交瘤单克隆抗体均可强度相当地与重组N蛋白抗原和SARS病毒裂解产物反应。
实施例5抗SARS病毒N蛋白多克隆抗体与单克隆抗体组合使用以检测重组N蛋白随机挑选实施例4中选出的抗N蛋白单克隆抗体#1，#3，#5，#8，#9和#12作为第一抗体，按照常规方法与胶体金缀合，抗SARS病毒N蛋白多克隆抗体4mg/ml作为“俘获抗体”-第二抗体组合使用，以测试对重组N蛋白各稀释度(5pg/ml，10pg/ml，20pg/ml，50pg/ml，100pg/ml，200pg/ml，500pg/ml)的反应性。结果发现这些抗体均可达到肉眼观察检测到20pg/ml重组N抗原的敏感度。
实施例6分别抗N蛋白N端片段和C端片段的两种单克隆抗体配合使用以检测重组N蛋白抗原和SARS冠状病毒裂解液包被抗体和酶联抗体的配对实验将选出的抗N蛋白单克隆抗体(#1，#3-#6和#8-#14)均用PierceHRP标记试剂盒(Pierce Biotechnology，Inc.，Customer ServiceDepartment，P.O.Box 117，Rockford，IL.61105 U.S.A，cat.no.31490)标记。
用上述单克隆抗体包被酶标板。抗体以1ug/ml溶于BBS。用溶于含0.02％NaN3(叠氮化钠)的PBS中的3％BSA封闭板，加N蛋白抗原100pg/ml。每一个包被用的抗N端单克隆抗体首先和HRP标记的抗C端的单克隆抗体作配合试验，然后再分别和其它所有标记的抗N-HRP抗体配合，选择有最强信号的单克隆抗体作为配对抗体。反之用抗C端的单克隆抗体作为包被抗体是，首先用HRP标记的抗N端的单克隆抗体配合，然后再与其它所有标记的抗体配合。选择反应信号最强的#1和#10、#3和#9作为配合抗体。
参照常规方法将#1和#9分别与胶体金颗粒缀合，浓缩后以OD530nm＝50喷膜，用量为2.5ul/cm。将#3和#10抗体以2.0mg/ml固定在相应试纸条上作为俘获抗体，并以羊抗鼠IgG作为阳性对照。将试纸条浸入系列稀释的重组N蛋白和经0.05％SDS灭活的SARS病毒裂解液样品中进行检测。结果发现两种组合均可检测到10pg/ml重组N抗原和1000pfu/ml SARS病毒的敏感度。
本发明人还测试了用山羊抗SARS-N蛋白多克隆抗体(4mg/ml)作为俘获抗体、分别抗C端和N端的单克隆抗体(#1和#10)作为胶体金缀合抗体的配合。每种单克隆抗体的胶体金缀合物终浓度均为OD530nm＝50，喷射体积为2.5ul/cm。检测结果见图1。其中上部条带为山羊抗鼠IgG阳性对照，下部条带为俘获抗体-山羊抗SARS-N蛋白多克隆抗体。在此条件下可以达到肉眼观察检测到10pg/ml(及低于10pg/ml)重组N抗原的敏感度和对灭活SARS病毒检测达到1000PFU(及低于1000PFU)的稀释度。此敏感度是目前RT-PCR方法对SARS病毒检测的灵敏度水平。
结论本发明的方法检测时间在10分钟，检测敏感度可达到10pg/ml重组N蛋白，检测灭活SARS-CoV可达到1000PFU/ml或更高的稀释度。
本发明的方法具有简单、快速、使用方便、不需特殊技能或设备及易于保存(一般可于室温保存18-24个月)，在用于SARS诊断中，本方法还有适用于在非医疗单位(如机场、车站、家庭等)由非义务人员操作及减少检测本身产生的污染物(如ELISA方法中的洗液)的产生。能够用于早期诊断的具有高灵敏度和特异性性SARS胶体金试剂/方法具有其它任何方法都无法比拟的优点。由上述结果可看出，本发明方法的敏感性可以达到ELISA方法的水平，并且可以通过与标准曲线比较而进行定量检测，从而对SARS治疗的疗效即是否具有传染性进行观察和判断。
上面以例示的方式对本发明进行了举例说明，但本发明绝不限于此。本领域普通技术人员在阅读了整篇说明书之后，完全清楚可对本发明作各种改动，而仍不偏离本发明的精神和范围。
序列表<110>Ma，Jie<120>SARS冠状病毒或其相关抗原的检测<130>idc030083-ccpit<160>26<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1269<212>DNA<213>
<400>1atgtctgata atggacccca atcaaaccaa cgtagtgccc cccgcattac atttggtgga60cccacagatt caactgacaa taaccagaat ggaggacgca atggggcaag gccaaaacag120cgccgacccc aaggtttacc caataatatt gcgtcttggt tcacagctct cactcagcat180ggcaaggagg aacttagatt ccctcgaggc cagggcgttc caatcaacac caatagtggt240ccagatgacc aaattggcta ctaccgaaga gctacccgac gagttcgtgg tggtgacggc300aaaatgaaag agctcagccc cagatggtac ttctattacc taggaactgg cccagaagct360tcacttccct acggcgctaa caaagaaggc atcgtatggg ttgcaactga gggagccttg420aatacaccca aagaccacat tggcacccgc aatcctaata acaatgctgc caccgtgcta480caacttcctc aaggaacaac attgccaaaa ggcttctacg cagagggaag cagaggcggc540agtcaagcct cttctcgctc ctcatcacgt agtcgcggta attcaagaaa ttcaactcct600ggcagcagta ggggaaattc tcctgctcga atggctagcg gaggtggtga aactgccctc660gcgctattgc tgctagacag attgaaccag cttgagagca aagtttctgg taaaggccaa720caacaacaag gccaaactgt cactaagaaa tctgctgctg aggcatctaa aaagcctcgc780caaaaacgta ctgccacaaa acagtacaac gtcactcaag catttgggag acgtggtcca840gaacaaaccc aaggaaattt cggggaccaa gacctaatca gacaaggaac tgattacaaa900cattggccgc aaattgcaca atttgctcca agtgcctctg cattctttgg aatgtcacgc960attggcatgg aagtcacacc ttcgggaaca tggctgactt atcatggagc cattaaattg1020gatgacaaag atccacaatt caaagacaac gtcatactgc tgaacaagca cattgacgca1080tacaaaacat tcccaccaac agagcctaaa aaggacaaaa agaaaaagac tgatgaagct1140
cagcctttgc cgcagagaca aaagaagcag cccactgtga ctcttcttcc tgcggctgac1200atggatgatt tctccagaca acttcaaaat tccatgagtg gagcttctgc tgattcaact1260caggcataa1269<210>2<211>70<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>2atgtctgata atggacccca atcaaaccaa cgtagtgccc cccgcattac atttggtgga60cccacagatt 70<210>3<211>70<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>3ctgttttggc cttgccccat tgcgtcctcc attctggtta ttgtcagttg aatctgtggg60tccaccaaat 70<210>4<211>78<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>4ccgaccccaa ggtttaccca ataatattgc gtcttggttc acagctctca ctcagcatgg60caaggaggaa cttagatt 78<210>5<211>80<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>5tagccaattt ggtcatctgg accactattg gtgttgattg gaacgccctg gcctcgaggg60aatctaagtt cctccttgcc80<210>6<211>83
<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>6ccagatgacc aaattggcta ctaccgaaga gctacccgac gagttcgtgg tggtgacggc60aaaatgaaag agctcagccc cag83<210>7<211>79<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>7ttgttagcgc cgtagggaag tgaagcttct gggccagttc ctaggtaata gaagtaccat60ctggggctga gctctttca 79<210>8<211>82<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>8ttccctacgg cgctaacaaa gaaggcatcg tatgggttgc aactgaggga gccttgaata60cacccaaaga ccacattggc ac 82<210>9<211>82<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>9tttggcaatg ttgttccttg aggaagttgt agcacggtgg cagcattgtt attaggattg60cgggtgccaa tgtggtcttt gg 82<210>10<211>89<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>10tcaaggaaca acattgccaa aaggcttcta cgcagaggga agcagaggcg gcagtcaagc60ctcttctcgc tcctcatcac gtagtcgcg 89<210>11
<211>71<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>11tcgagcagga gaatttcccc tactgctgcc aggagttgaa tttcttgaat taccgcgact60acgtgatgag g 71<210>12<211>82<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>12ggaaattctc ctgctcgaat ggctagcgga ggtggtgaaa ctgccctcgc gctattgctg60ctagacagat tgaaccagct tg 82<210>13<211>92<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>13gatgcctcag cagcagattt cttagtgaca gtttggcctt gttgttgttg gcctttacca60gaaactttgc tctcaagctg gttcaatctg tc 92<210>14<211>87<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>14aatctgctgc tgaggcatct aaaaagcctc gccaaaaacg tactgccaca aaacagtaca60acgtcactca agcatttggg agacgtg87<210>15<211>78<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>15atcagttcct tgtctgatta ggtcttggtc cccgaaattt ccttgggttt gttctggacc60acgtctccca aatgcttg 78
<210>16<211>84<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>16ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat tggccgcaaa ttgcacaatt tgctccaagt60gcctctgcat tctttggaat gtca 84<210>17<211>79<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>17agacgtaaga aaccttacag tgcgtaaccg taccttcagt gtggaagccc ttgtaccgac60tgaatagtac ctcggtaat 79<210>18<211>79<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>18taatggctcc atgataagtc agccatgttc ccgaaggtgt gacttccatg ccaatgcgtg60acattccaaa gaatgcaga 79<210>19<211>52<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>19gctctgttgg tgggaatgtt ttgtatgcgt caatgtgctt gttcagcagt at52<210>20<211>112<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>20acattcccac caacagagcc taaaaaggac aaaaagaaaa agactgatga agctcagcct60ttgccgcaga gacaaaagaa gcagcccact gtgactcttc ttcctgcggc tg112
<210>21<211>89<212>DNA<213>合成的寡核苷酸<400>21ttatgcctga gttgaatcag cagaagctcc actcatggaa ttttgaagtt gtctggagaa60atcatccatg tcagccgcag gaagaagag 89<210>22<211>24<212>DNA<213>引物<400>22caccatgtct gataatggac ccca 24<210>23<211>20<212>DNA<213>引物<400>23tgcctgagtt gaatcagcag20<210>24<211>19<212>DNA<213>引物<400>24gccgtcacca ccacgaact 19<210>25<211>26<212>DNA<213>引物<400>25caccatggaa gtcacacctt cgggaa 26<210>26<211>422<212>PRT<213>
<400>26Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Ser Asn Gln Arg Ser Ala Pro Arg Ile
1 5 10 15Thr Phe Gly Gly Pro Thr Asp Ser Thr Asp Asn Asn Gln Asn Gly Gly20 25 30Arg Asn Gly Ala Arg Pro Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn35 40 45Asn Ile Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Glu50 55 60Leu Arg Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Gly65 70 75 80Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Val Arg85 90 95Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Glu Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr100 105 110Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Ser Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys115 120 125Glu Gly Ile Val Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys130 135 140Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Asn Asn Asn Ala Ala Thr Val Leu145 150 155 160Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly165 170 175Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg180 185 190Gly Asn Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Asn Ser Pro195 200 205Ala Arg Met Ala Ser Gly Gly Gly Glu Thr Ala Leu Ala Leu Leu Leu210 215 220
Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Val Ser Gly Lys Gly Gln225 230 235 240Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser245 250 255Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Gln Tyr Asn Val Thr260 265 270Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly275 280 285Asp Gln Asp Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln290 295 300Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg305 310 315 320Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr His Gly325 330 335Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Gln Phe Lys Asp Asn Val Ile340 345 350Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu355 360 365Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Thr Asp Glu Ala Gln Pro Leu Pro370 375 380Gln Arg Gln Lys Lys Gln Pro Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp385 390 395 400Met Asp Asp Phe Ser Arg Gln Leu Gln Asn Ser Met Ser Gly Ala Ser405 410 415Ala Asp Ser Thr Gln Ala420
权利要求
1.一种针对SARS冠状病毒N蛋白抗原的抗体。
2.权利要求1的抗体，它是单克隆的。
3.权利要求1的抗体，它是多克隆的。
4.权利要求1的抗体，它是嵌合抗体。
5.一种检测样品中SARS冠状病毒或者其相应抗原的存在情况的方法，包括如下步骤(1)将样品与权利要求1-4中任一项的抗体在合适的条件下温育；(2)检测上述步骤中结合复合体的存在。
6.权利要求5的方法，其中所述样品是患者的血清、全血、痰液、口腔/鼻咽分泌物或洗液、尿液、粪便、胸腹腔积液、脑脊液和组织标本等。
7.权利要求5的方法，其中在温育前用0.01-0.2％SDS对所述样品进行处理。
8.权利要求5的方法，其中所述抗体固定在支持物，例如膜如硝酸纤维素、胶乳颗粒、磁性颗粒、胶体金、珠子或盘诸如玻璃、纤维玻璃或塑料材料如聚苯乙烯或聚氯乙烯、或纤维光学传感器等上。
9.患者中SARS病的诊断方法，包括将来自患者的样品与权利要求1-4中任一项的抗体温育和检测所述抗体的特异性结合的情况。
10.一种检测试剂盒，其中包含针对SARS冠状病毒N蛋白的第一抗体和第二抗体，所述第一抗体任选地进行了适当标记，例如辣根过氧化物酶或胶体金等标记。
11.权利要求10的试剂盒，其中所述第一抗体和第二抗体都是多克隆抗体。
12.权利要求10的试剂盒，其中所述第一抗体是多克隆抗体或者一或多种单克隆抗体或者它们的混合物，所述第二抗体是能够配合使用的多克隆抗体或者一或多种单克隆抗体或者它们的混合物。
13.一种试纸条产品，其中包含针对SARS冠状病毒N蛋白的第一抗体和第二抗体，所述第一抗体任选地进行了适当标记，例如辣根过氧化物酶或胶体金等标记，所述第二抗体作为俘获抗体。
14.权利要求13的试纸条产品，其中所述第一抗体和第二抗体都是多克隆抗体。
15.权利要求13的试纸条产品，其中所述第一抗体是多克隆抗体或者一或多种单克隆抗体或者它们的混合物，所述第二抗体是能够配合使用的多克隆抗体或者一或多种单克隆抗体或者它们的混合物。
16.权利要求13的试纸条产品，其中还含有抗第一抗体的阳性对照抗体。
全文摘要
本发明涉及针对SARS冠状病毒核衣壳蛋白－N蛋白(nucleocapsidprotein)的抗体，利用该抗体检测样品中SARS冠状病毒或者其抗原的存在情况的方法。本发明还涉及用于这些方法的试剂盒以及相应的产品。
文档编号C07K16/08GK1590409SQ0315636
公开日2005年3月9日 申请日期2003年9月5日 优先权日2003年9月5日
发明者马杰 申请人:马杰