专利名称：一种防治对虾病毒病的卵黄免疫球蛋白及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及到水产动物养殖技术领域，特别涉及到一种防治对虾病毒病的卵黄免疫球蛋白(IgY)及其制备方法，此种IgY可以用作饲料添加剂或药物浸浴剂或泼洒剂的活性成分防治对虾白斑综合症。
背景技术：
我国的对虾养殖起步于20世纪70年代末，养殖生产技术的不断改进与完善，使之迅速成为海水养殖业的支柱产业之一，但是随着对虾人工养殖企业化的发展，人们盲目地进行高密度放养，加上养殖的生态环境不断恶化等原因，使得对虾疾病特别是对虾病毒性病害成了阻碍这一产业发展的重要因素。1993～1994年对虾病毒病肆虐我国大江南北、横扫各对虾养殖场，造成了70％以上的养殖对虾死亡。据不完全统计，由此造成的直接经济损失达数百亿元，严重影响了沿海地区渔业经济的发展。在造成养殖对虾大面积死亡的病因研究中，人们发现病毒病往往是罪魁祸首，已经报道的病毒病不下15种之多，且不断有新的病毒病被发现和报道。根据《自然》杂志发表地一份研究报告，应用新的定量方法取得地研究结果表明在自然水体中，病毒颗粒地数量比人们预期的要多得多，高达每升2.5×108个。
白斑综合症是对虾养殖的最重要疾病之一，其病原体为一类白斑综合症病毒(WSSV-type，White Spot Syndrome Virus group)。包括白斑杆状病毒(WSBV)，皮下及造血组织坏死杆状病毒(HHNBV)，日本对虾核型杆状病毒(RV-PJ)，系统性外胚层、中胚层杆状病毒(SEMBV)，无包涵体对虾病毒(NOSV)。该病毒感染力强，被感染的对虾在一周内死亡率高达90～100％。在白斑综合症的防治上，主要采取预防为主的措施一方面通过改造养虾池，改善养殖环境，提高养殖技术起到间接预防的作用；另一方面主要使用肽聚糖、微生物多糖、维生素C、中草药、益生素、蝇蛆，提高虾体自身免疫力，以期增强对虾抵抗病毒侵染的能力，但尚无特效的治疗药物制剂防治白斑综合症。
上述这些药物制剂主要通过提高对虾的非特异性免疫能力，增强对虾抵抗病毒侵染的能力，但针对病毒本身束手无策。肽聚糖和微生物多糖的活性易受菌种、发酵条件等因素的影响而限制了其应用；维生素C还原态极不稳定，药效发挥受到影响；中草药资源非常有限，药效缓慢，毒副作用有待进一步研究，且受原料品质、加工方法、配伍比例等因素的制约；益生素(活菌制剂)易受外界条件影响，在加工贮藏时易失活，进入消化道后亦会被消化液所灭活，难有足够数量的有益菌发挥作用，活菌的菌种种类也较少。
IgY是一种与哺乳动物IgG结构类似的禽源抗体，具有较高的免疫活性，50ng/ml含量仍能被检测出有特异性活性，其性能稳定，有较强的耐热性，65℃条件下，IgY的活性至少可保持24h以上，经巴氏杀菌后活性保持不变；耐酸耐碱范围宽，pH4.0～11.0时稳定，并可通过微囊化进一步提高其稳定性，且无毒、无残留、无副作用，绿色环保。根据需求采用不同抗原对禽类进行免疫，即可产生针对该抗原的特异性IgY，而且利用禽类生产特异性IgY具有可规模化生产、成本低、特异性抗体含量高(100～400mg/鸡蛋)及安全性好等优点，再经干燥处理加工制成粉剂便可添加于饲料或饵料中，使用方便，且宜于推广。
IgY可与相应抗原发生特异性结合，从而抑制或改变该抗原的状态或活性。口服IgY可使机体获得被动免疫，IgY可封闭病毒吸附易感细胞受体的表位，从而阻止病毒吸附和穿入细胞内增值，因此限制了病毒在细胞、组织之间扩散以及在血流中蔓延。而免疫禽蛋具有多种免疫增强因子，机体摄取后，可发挥协同作用，增强机体的非特异性免疫能力，提高抗病力。
由于IgY及免疫禽蛋具有上述优良特性，即克服目前免疫增强剂等药物对病毒实际杀灭作用不大，实际生产应用受限的缺点，可从根源上预防和治疗由白斑综合症病毒这种病原体引发的对虾病毒病。
目前，已公开的WO03070258、KR2003069506-A和WO2004004764-A1专利文献虽然提供了一种使用卵黄免疫球蛋白预防或治疗对虾白斑综合症的方法，但上述发明依然存在以下不足1.对虾白斑综合症的病原体为一类病毒，不同地域不同宿主感染的白斑病病毒存在差异，仅选择白斑综合症病毒的一种制备抗原，免疫产生的IgY种类单一，仅对该病毒抗原起作用，无法应用于其它病毒株引起的感染，实际应用范围缩小，抑杀病毒效果减弱。
2.未使用白斑综合症病毒基因或其抗原决定簇的基因制成核酸免疫原，由此带来诸如免疫禽类产生抗体效价不均一，产量不稳定，实际应用效果降低等缺点。
3.仅以IgY作为防治对虾白斑综合症的唯一活性成分，不仅添加剂量加大，而染毒对虾因免疫力的下降导致其它致病微生物的乘虚而入，但该IgY却不能有效抑制水体或虾体内部存在的这些致病微生物，无法达到最佳治疗效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种防治对虾白斑综合症的卵黄免疫球蛋白(IgY)，并且进一步完善该IgY的制备方法，将其作为饲料添加剂、药用浸浴剂或虾池泼洒剂的主要活性成分应用于对虾病害防治，达到抑杀病毒和增强虾体免疫功能的双重效果，显著降低对虾染毒几率，提高成活率，解决目前在防治对虾白斑综合症方面尚无特效治疗药物制剂的问题。
本发明的目的是通过如下技术方案来实现
1.抗原的制备以WSBV作为白斑综合症病毒类的代表株详述其抗原制备过程(1)WSBV灭活毒株的制备取健康无WSBV感染的螯虾，清洗体表，在0.01％的高锰酸钾溶液中浸泡5min，无菌水冲洗，酒精棉球消毒头胸甲与腹部交界处。制备螯虾原代细胞，用全培液轻轻均匀重悬，接种到培养瓶或培养板，27℃培养过夜，待用。另取感染WSBV的对虾组织，无菌过滤获得WSBV病毒液，于健康螯虾第三、四腹节进行肌肉注射(60～120μl/只)。感染4～6天后，剥取感染螯虾肌肉组织，以L-15培养基为匀浆缓冲液，提取病毒。选取铺展均匀、状态良好的细胞，按1/10比例加入新鲜制备的病毒感染液，孵育1h，用L-15洗涤细胞3次，加入全培液，于27℃继续培养后收获病毒液，15％NaCl灭活病毒液18～24h，于4℃或-20℃保存。
(2)WSBV基因亚单位免疫原的制备将病虾的头胸甲取下，去除眼、附肢，加入等体积TN(Tris-NaCl)缓冲液，经高速组织匀浆器12000r/min匀浆5min。匀浆液经5000g离心1h，取上清，经8400g离心20min，再取上清30000g离心1h，取沉淀，加入3～5倍的TN缓冲液重新悬浮，置于15～16％蔗糖密度梯度顶端，经75000g离心2h，收集病毒层1ml，用TN缓冲液稀释，再经8400g离心0.5h，取上清，用等量TN缓冲液重新悬浮，即得纯化病毒。以上离心均在4℃进行。设计并合成引物，提取WSBV中国株(GeneBank登录号AF332093)的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增分别克隆出VP24，VP26，VP28基因，亚克隆至载体pUC118的多克隆位点上，得到VP24，VP26，VP28基因的重组克隆质粒，然后分别与表达质粒pGEX-2T连接，转化感受态细胞BL21，筛选阳性菌落。挑取阳性单菌落，于LB培养基中37℃过夜培养，取1/50或1/100菌液转移至含有Amp的5L液体培养基，振摇至A(OD)550＝0.4～0.6，加入1.5mlIPTG(1M)诱导表达，1～4h后，离心收集菌体，SDS-PAGE及Western Blot检测表明诱导产生目的蛋白，用谷胱苷肽活化的Sepharose4B亲和层析柱纯化融合蛋白，测定纯化蛋白的浓度，于-20℃保存备用。
(3)核酸免疫原的制备如(2)所述方法获得的VP24，VP26，VP28基因，分别与表达质粒pVAX1连接，转化感受态细胞DH5α，筛选阳性菌落。大量提取重组质粒，以Sepharose-CL4B柱层析纯化质粒，以鲎试剂法检测质粒DNA中所含的细菌内毒素，将内毒素含量控制在小于20EU/mg质粒的范围之内，于无菌PBS或无菌水中4℃或-20℃保存备用。
2.禽类免疫采用上述方法制备的单一抗原或复合抗原，与福氏完全佐剂或福氏不完全佐剂分别等量混合后，分别对待开产或新开产的健康无病鸡进行初免和加强免疫，共计三次，14天后每隔3天采血1次，测定抗体效价，当达到log211以上时，收集免疫蛋，置4℃保存。
以上免疫方法和注射频率可根据实际情况适当调整和变化；亦可用上述同样的免疫技术，采用上述抗原，分别对产蛋母鸭或母鹅或火鸡或鸵鸟等不同产蛋禽类进行免疫，获得相应的IgY。
3.具有免疫活性生物制剂的制备(1)特异性IgY的分离纯化当免疫禽蛋达一定数量后，用0.2～0.5％的新洁尔灭或高锰酸钾水溶液洗净蛋壳表面，再用5％碘酊消毒，最后用75％的酒精脱碘两次。打蛋机打碎免疫蛋，分离卵黄。用灭菌水或缓冲液将具有免疫活性的卵黄液稀释6～10倍，NaOH调pH至5～5.2，于4℃下静置12～18h，离心分离收获上清液，(NH4)2SO4溶液盐析，静置数小时后，乙醇沉淀或硫酸钠沉淀获得IgY粗体液，Sephadex G-200柱层析纯化浓缩粗提液。
(2)免疫活性全蛋粉/卵黄粉/抗体粉的制备将具有免疫活性的全蛋液或卵黄液或纯化IgY溶液搅拌乳化成乳液，采用喷雾干燥或冷冻干燥法制成粉末状。
本发明的效果和益处是，应用本技术方案制备出的抗对虾白斑综合症的特异性IgY直接作用于对虾白斑综合症的病原体，发挥特异性抑制作用，克服肽聚糖、益生素、中草药等制剂的使用对于病毒本身并无杀灭作用的缺点；本发明又以实际应用的剂型和施药方式设计为口服给料，浸泡虾体，泼洒虾池多种方式相结合的路线，因此对于未染毒的对虾、已染毒的对虾及养殖虾池均有预防感染，抑杀病毒，净化水质，改善环境的特点，进而使得该发明具有作用直接、治本断源、效果明显的优点。
特别需要指出的是应用白斑综合症病毒的不同病毒株制成的复合抗原获得的特异性IgY是一种多克隆抗体，它可以对多种不同的病原体同时产生抑杀作用，因此大大提高了对虾抗感染的能力，复合抗原实验组对虾成活率可达95～100％，单一抗原实验组对虾成活率90～93％，由于不同地域不同宿主感染的白斑综合症病毒存在差异，使用复合抗原制备的特异性IgY用量少、成本低、效果尤为显著。
而通过白斑综合症病毒基因或其抗原决定簇的基因制成的核酸免疫原，免疫获得的特异性IgY产量大且稳定，每只蛋含150～200mg的IgY，抗体效价均一，且最高可达1:1024，因此进一步提高了对虾的抗病能力，生产成本亦大大降低。
再有药物组合物中除了使用特异性卵黄抗体粉或含有该卵黄抗体的蛋黄粉或全蛋粉，还添加了益生素或肽聚糖或中草药等活性成分，多种免疫增强剂的协同作用，彻底阻断各种致病微生物的入侵，增强虾体体质，激活机体非特异性免疫防御机能，增强其抗病防病能力。
本发明制备的抗对虾白斑综合症特异性IgY又是一种独特的纯天然生物制剂，使用安全、无毒副作用；绿色环保、无药残；同时，它完全不会诱发抗药菌株的产生，亦不会杀灭有益菌造成“菌群失调”。而对虾属低等无脊椎动物，特异性抗原/抗体免疫反应机制的缺乏，致使其仅能通过血细胞的吞噬等简单途径而非产生免疫球蛋白的方式抵御外来侵害，本发明制备的IgY即为一种IgG类的免疫球蛋白，通过发挥被动免疫机制来防治对虾病毒病，因此间接供给对虾免疫球蛋白，弥补对虾存在的免疫机能缺陷，达到抑杀病毒及增强虾体免疫力的双重效果，显著降低对虾感染病毒的几率，促进对虾生长繁殖，进而解决对虾养殖业的燃眉之急，填补对虾病害防治药物缺乏的空白。
具体实施例方式
实施例1制备螯虾原代细胞取健康无WSBV感染的螯虾，清洗体表，在0.01％的高锰酸钾溶液中浸泡5min，无菌水冲洗，酒精棉球消毒头胸甲与腹部交界处。用无菌注射器吸取2～3mL抗凝剂(0.14mol/L NaCl，0.1mol/L葡萄糖，30mmol/L柠檬酸，26mmol/L柠檬酸钠，10mmol/L EDTA，pH4.6)，心窦采血，抗凝剂与血淋巴液混匀离心，1500r/min离心10min，弃上清，沉淀用L-15培养基润洗2次，用全培液(15％犊牛血清、100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素的L-15培养液)，轻轻均匀重悬淋巴细胞，接种至培养瓶或培养板，27℃培养过夜，待用。
实施例2目的基因克隆PCR法扩增获得VP28基因，测序结果表明，该基因含有615个核苷酸，GeneBamk中已有不同来源的WSSV的序列片段同源性为100％。
实施例3蛋白诱导表达SDS-PAGE电泳检测结果显示结果表明，带重组质粒pGEX-2T的菌株在分子量为24KDa，26KDa，28KDa的位置上分别产生一条特异蛋白质条带，其表达量均占细菌总蛋白质量的40％以上，而对照菌株中均无此相应蛋白质条带产生。
实施例4重组蛋白分离纯化用PBS平衡Sepharose4B亲和层析柱的pH值，取菌体裂解物25ml，离心去除细胞碎片，用吸管取上清，加入亲和凝胶柱，让液体流出弃去；待样品液面刚好与柱顶平齐时，加入25ml PBS；而后加入谷胱苷肽洗脱液2.5ml(Glutathion Elution Buffer，谷胱苷肽10mmol/L，pH8.0 Tris-HCl50mmol/L)，室温下作用10min后收集流出的液体；重复洗脱4次，收集洗脱液。
实施例5免疫接种核酸疫苗如技术方案所述获得的重组质粒于260nm和280nm下测得其光密度比值为1.9。按1D＝50μg计算质粒含量，溶于无菌100μl的PBS中，3周龄罗曼鸡免疫一周前，于鸡胸、鸡后腿肌肉三点肌注射蝮蛇毒100μl/点(20μg/ml溶于生理盐水)，并标记，而后于鸡胸、鸡后腿肌肉、皮下、腹腔内及静脉内注射50μg/点，一周后以相同剂量相同位置进行二免，两周后免疫剂量增至60μg/点于相同位置进行三免。
实施例6抗体效价的测定将来自斑节对虾的WSBV如技术方案所述分别制备单一灭活病毒抗原、基因亚单位抗原、核酸抗原，再用该抗原按技术方案所述的免疫禽类的方法免疫蛋鸡，制备抗对虾白斑综合症的特异性IgY。然后，以从该对虾分离纯化的WSBV为检测抗原，ELISA法检测所制得的抗对虾病毒病特异性IgY的结合效价。结果如下表IgY 检测用抗原 效价I1:1024II 1:512III 1:256IV WSBV 1:256V1:1024VI 1:512VII 1:512I抗灭活病毒特异性IgYII抗VP28蛋白特异性IgY V抗pVAX1-VP28特异性IgYIII抗VP26蛋白特异性IgYVI抗pVAX1-VP26特异性IgYIV抗VP24蛋白特异性IgY VII抗pVAX1-VP24特异性IgY实施例7按技术方案所述灭活毒株的制备方法分别制备WSBV、HHNBV、HHNBV、SEMBV、NOSV灭活毒株，按1∶1∶1∶1∶1的比例混合制成复合抗原，并按技术方案所述的免疫禽类的方法免疫蛋鸡，制备抗对虾白斑综合症特异性IgY。然后分别以WSBV、HHNBV、RV-P、SEMBV、NOSV作为检测抗原，ELISA法检测所制得的抗对虾病毒病特异性IgY的结合效价。结果如下表IgY 检测用抗原 效价WSBV 1:1024HHNBV 1:1024抗对虾白斑综合症特RV-P 1:512异性IgYSEMBV 1:512NOSV 1:512实施例8将来自斑节对虾的WSBV如技术方法所述制备的基因亚单位疫苗VP28、VP26、VP24按1∶1∶1混合均匀，制备复合抗原，再用该抗原免疫蛋鸡，按技术方案所述制备抗对虾白斑综合症的特异性IgY。然后，以从该对虾分离纯化的WSBV为检测抗原，ELISA法检测所制得的抗对虾病毒病特异性IgY的结合效价为1:1024。
实施例9将100尾斑节对虾随机分成10组，其中为一组对照，其它为治疗组，每组20尾，WSBV粗提液于对虾第2和第3腹节间侧面向心浅层肌肉注射，每尾0.05ml，对照组2天后出现死亡现象，3天后死亡率达到100％；治疗组，每日两次饲喂含抗对虾病毒病的特异性IgY饵料，未出现死亡病例，且对治疗组随机抽取6-8尾进行PCR病毒检测，检测结果均为阴性。
实施例10
将来自斑节对虾的WSBV如技术方法所述制备单一灭活病毒抗原，免疫蛋鸡，收获若干鸡蛋，分离获得卵黄液200ml，生理盐水稀释5倍，在1升卵黄液中加入肽聚糖和中草药粉剂各100mg，均匀混合后，浸泡6hm2斑节对虾养殖池，110d后，浸泡卵黄液的虾池的发病率在0～10％之间，而对照虾池(未经卵黄液浸泡)的发病率在90～100％之间。
试验池 对照池虾 养殖池发虾养殖 池发养殖面养殖面虾场 池 天数病率池天数 病率积(hm2) 积(hm2)数 (d) (％)数(d) (％)瓦房店 5 1.5 110 ＜10％ 51.5 110 90庄河 3 1110 0 31110 100实施例11将来自斑节对虾的WSBV如技术方法所述制备的单一灭活病毒抗原，免疫蛋鸡，收获若干鸡蛋，分离获得卵黄液，喷雾干燥法制备卵黄粉，将卵黄粉与益生素、肽聚糖和中草药粉剂制成对虾饲料添加剂在1吨卵黄粉中加入益生素、肽聚糖和中草药粉剂各100g，搅拌均匀。
购买专用于饲养对虾的饲料，将卵黄粉、益生素、肽聚糖及中草药调制好的添加剂按10％的量添加于基础饲料中，搅拌机搅匀后，35℃鼓风箱烘干包装。
于50L水族箱体中，分别饲喂斑节对虾，中国对虾，日本对虾，南美白对虾各25尾，投喂基础饲料暂养3天，分别对各水族箱体人工感染WSBV，治疗组1天两次投喂含有上述饲料添加剂的人工合成饲料，投喂5天，对照组继续投喂基础饲料，对照组发病率均为95％以上，治疗组发病率均在5～8％之间。
实施例12
虾池面积20亩，水深1米，放苗(斑节对虾)22万尾，40天后，发生暴发性病毒白斑。第一天死虾90多尾，第二天增至近300尾。采用以下措施外用免疫卵黄液(2mg/L)全池泼洒，内服含15％卵黄粉的人工配合饲料，连用8天。用药后第3天死虾减少，至第5天仅发现10多尾死虾，第7天恢复正常。
权利要求
1.一种防治对虾病毒病的卵黄免疫球蛋白及其制备方法和应用，制备抗对虾病毒病的特异性卵黄免疫球蛋白IgY或含该IgY的组合物，其特征在于该IgY是将引致对虾病毒病的一类病毒中的一种或多种作为人工抗原用于免疫产蛋禽类，收集该被免疫的禽类所产禽蛋，从其卵黄中提取的抗对虾病毒病特异性卵黄免疫球蛋白，并将其作为一种对虾病毒病防治的生物制品。
2.根据权利要求1所述的一种防治对虾病毒病的卵黄免疫球蛋白及其制备方法和应用，其特征在于制备该IgY所采用的产蛋禽类包括母鸡、母鸭、母鹅、火鸡、鸵鸟。
3.根据权利要求1或2所述的一种防治对虾病毒病的卵黄免疫球蛋白及其制备方法和应用，其特征在于引致对虾病毒病的病毒是一类白斑综合症病毒WSSV包括白斑杆状病毒WSBV，皮下及造血组织坏死杆状病毒HHNBV，日本对虾核型杆状病毒RV-PJ，系统性外胚层、中胚层杆状病毒SEMBV，无包涵体对虾病毒NOSV。
4.根据权利要求1或2所述的一种防治对虾病毒病的卵黄免疫球蛋白及其制备方法和应用，其特征在于制备该IgY的主要抗原是白斑综合症病毒类的灭活毒株或其减毒毒株或其基因亚单位免疫原或其核酸免疫原。
5.根据权利要求1或2所述的一种防治对虾病毒病的卵黄免疫球蛋白及其制备方法和应用，其特征在于该IgY制备方法中所述的对虾病毒病单一抗原或复合抗原方法如下首先培养优选根据权利要求3所述的一种或多种病毒，选择一种致病病毒时，直接加入免疫佐剂制作单一抗原；选择多种致病病毒时，则先将培养好的一种以上白斑综合症病毒按1-10∶1-10或1-10∶1-10∶1-10或1-10∶1-10∶1-10∶1-10或1-10∶1-10∶1-10∶1-10∶1-10以此类推的比例均匀混合，然后加入免疫佐剂制成复合抗原。
6.根据权利要求1或2所述的一种防治对虾病毒病的卵黄免疫球蛋白IgY及其制备方法和应用，其特征在于白斑综合症病毒感染的宿主是指甲壳动物的脊尾白虾、南美白对虾、斑节对虾、日本对虾、墨吉对虾、东方白虾、长毛对虾、中国对虾、印度对虾、桃红对虾、蓝对虾、褐对虾、周氏新对虾、日本樱虾、近缘新对虾、长臂虾、刀额新对虾、虾蛄、毛虾。
7.根据权利要求1或2所述的一种防治对虾病毒病的卵黄免疫球蛋白及其制备方法和应用，其特征在于含该IgY的组合物中还含有任意组合的益生素或肽聚糖或中草药。
8.根据权利要求1所述的一种防治对虾病毒病的卵黄免疫球蛋白及其制备方法和应用，其特征在于该IgY可作为饲料添加剂或药物浸浴剂或虾池泼洒剂的活性成分每吨饲料添加剂含有抗对虾白斑综合症特异性IgY或具有免疫活性的卵黄粉/全蛋粉1-100g；每升药物浸浴剂含有抗对虾白斑综合症特异性IgY或具有免疫活性的卵黄液/全蛋液10-200ml；每升虾池泼洒剂含有抗对虾白斑综合症特异性IgY或具有免疫活性的卵黄液/全蛋液2％-10％。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及到水产动物养殖技术领域，特别涉及到一种防治对虾病毒病的卵黄免疫球蛋白(IgY)及其制备方法。其特征是将对虾白斑综合症病毒类的一种或多种灭活毒株/减毒毒株/基因亚单位免疫原/核酸免疫原制成单一抗原或复合抗原，以产蛋禽类作为生物反应器，免疫获得抗对虾白斑综合症特异性IgY，该IgY可单独或与肽聚糖、益生素及中草药组合共同作为饲料添加剂、药用浸浴剂或虾池泼洒剂的活性成分应用于对虾病害防治。本发明的效果和益处是该IgY通过被动免疫机制发挥作用，直接抑杀病毒，增强虾体免疫力，在预防和治疗对虾白斑综合症具有效果显著、安全、环保、使用方便等优点。
文档编号C07K16/08GK1583792SQ20041002069
公开日2005年2月23日 申请日期2004年6月5日 优先权日2004年6月5日
发明者徐永平 申请人:大连理工大学