专利名称：Fsh糖基化突变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有卵泡刺激激素活性的多肽、这些多肽的制备方法以及这些多肽在治疗中的应用，特别是用于治疗生殖障碍。
背景技术：
a.促性腺激素卵泡刺激激素(FSH)是对人生育具有关键作用的促性腺激素家族其中一个成员。促性腺激素还包括黄体生成素(LH)和绒毛膜促性腺激素(CG)，都是异二聚体，各包括一个共同的α-亚基(92个氨基酸)和一个独有的β-亚基(FSH的β-亚基有111个氨基酸)。α和β亚基的成熟形式的氨基酸序列分别示于SEQID NO1和SEQ ID NO2。
人FSH已经由脑下垂体和绝经后尿(EP 322，438)分离出来，并且已经在哺乳动物细胞中重组产生(US5,639,640，US5,156,957，US4,923,805，US4,840,896，US5,767,251，EP211，894和EP521,586)。后者文献也公开了人FSH β-亚基基因。美国专利US5,405,945公开了经修饰的仅包含一个内含子的人α-亚基基因。
Liu等(J Biol Chem 1993，15；268(2)21613-7)、Grossmann等(MolEndocrinol 1996 10(6)769-79)、Roth和Dias(Mol Cell Endocrinol 19951；109(2)143-9)、Valove等(Endocrinology 1994；135(6)2657-61)、Yoo等(J BiolChem 1993 25；268(18)13034-42)、US5,508,261以及Chappel等(HumanReproduction，1998，13(3)1835)揭示了各种关于结构-功能关系的研究并鉴定了参与受体结合和激活以及参与FSH二聚化的氨基酸残基。
b.促性腺激素在辅助生殖技术中的应用促性腺激素在生殖周期中发挥重要作用，在外源性疗法中使用促性腺激素是诸如体外受精(IVF)、体外受精与胞浆内精子注射结合(IVF/ICSI)和胚胎移植(ET)等辅助生殖技术(ART)以及通过天然方式或宫内受精(IUI)接受体内受精的不孕病人排卵诱导(OI)所必需的。
美国专利US4,589,402和US4,845,077公开了不含LH的纯化人FSH及其在体外受精中的用途。EP322438公开了一种基本上没有LH活性但具有至少6200U/mg FSH活性的蛋白质，其中FSHα-亚基和β-亚基可以分别是野生型或其特定的截短形式。
要获得治疗效果，需要较长治疗时间，一般要连续8至10日有时甚至长达21日刺激妇女的卵泡生成，要长达18个月诱导促性腺激素分泌不足的男性的精子生成。重组hFSH通常每日经肌内(i.m.)或皮下(s.c.)途径注射来给予，结果给病人带来不适，并且局部注射部位可能产生反应。减少给药频率有利于治疗，并使促性腺激素的给药更方便，更有耐药性，感觉更舒适。
c.FSH的糖基化促性腺激素是糖蛋白，每个亚基带有对体内活性和功能非常重要的天冬酰胺联的(N-联的)低聚糖侧链。多肽中加入碳水化合物(糖基化)是翻译后事件，结果是将糖链加入特定的天冬酰胺(N-联的)或丝氨酸/苏氨酸(O-联的)氨基酸中。与糖蛋白类蛋白质部分的不变氨基酸序列相反，碳水化合物结构是变化的，这个特征称为微不均一性。例如，同一蛋白质上N-糖基化位点可含有不同的碳水化合物结构。此外，对于一给定糖蛋白上相同糖基化位点，也可以有不同的碳水化合物结构。这种不均一性是非模板引导合成碳水化合物的结果。
蛋白质的N-糖基化具体发生在共有模式Asn-Xaa-Ser/Thr上，在较少情况下发生在共有模式Asn-Xaa-Cys上，其中Xaa可以是任何氨基酸残基。不过，一个共有三肽的存在不足以确保天冬酰胺残基发生糖基化。例如，Asn-Pro-Ser/Thr序列的N-糖基化速率比Asn-Xaa-Ser/Thr的其它共有模式低50倍。
人FSH含有4个N-联糖基化位点两个在共同的α-亚基的位置52和78上，另外两个在β-亚基的位置7和24上。与FSH的α-亚基相连的碳水化合物是二聚体组装、整合、信号转导的关键，而β-亚基碳水化合物对二聚体组装、分泌以及将异二聚体从循环中清除是十分重要的。
Galway等(Endocrinology 1990；127(1)93-100)论证了在N-乙酰氨基葡萄糖转移酶-I CHO细胞系或缺乏唾液酸转运的CHO细胞系中产生的FSH突变体具有与野生型细胞分泌的FSH或纯化垂体FSH相同的体外活性，但没有体内活性，这可能是由于糖基化不足够的突变体在血清中很快被清除所致。D′Antonio等(Human Reprod 1999；14(5)1160-7)描述了在血流中循环的各种FSH同种型。这些同种型具有相同氨基酸序列，但它们的翻译后修饰程度不同。已经发现，酸性较弱的同种型组别比酸性同种型组别在体内更快被清除，这可能是同种型之间唾液酸含量不同所致。另外，Bishop等(Endocrinology1995；136(6)2635-40)认为循环半衰期似乎是体内活性的主要决定因子。由这些观察结果可以推断，导入附加糖基化位点以增加多肽的唾液酸含量可以延長FSH的半衰期。
d.FSH突变体将hCG(CTP)的羧基末端肽与天然重组人FSH(rhFSH)融合，已经获得了半衰期延长的FSH激动剂。CTP部分由氨基酸112-118至145组成，有4个O-联的糖基化位点，分别位于位置121、127、132和138上。美国专利US5,338,835和US5,585,345公开了一种修饰FSH β-亚基，它在hCG的CTP部分C-末端Glu延伸。这种修饰类似物据说具有天然FSH的生物活性，但其循环半衰期较长。美国专利US5,405,945公开了hCG β-亚基的羧基末端部分或其突变体对CG、FSH和LH的清除产生重大的影响。
美国专利US5,883,073公开了一些单链蛋白质，它们由对CG、TSH、LH和FSH有激动活性或拮抗活性的两个α-亚基组成。美国专利US5,508,261公开了一些对LH和FSH受体有结合亲和力的异二聚体多肽，它们含有一个糖蛋白激素α-亚基和一个非天然存在的β-亚基多肽，其中所述β-亚基多肽是包含4个相连接次序列(subsequences)的氨基酸链，其中各个次序列选自一列特定的序列。Klein等(2003)公开了一个半衰期延长了的单链FSH类似物，其中α-和β-亚基由含有2个N-联糖基化位点的寡肽偶接。
WO 01/58493公开了尝试提高FSH体内半衰期而可以在FSH α-亚基实施的77种突变以及在FSH β-亚基实施的51种突变。WO 01/58493公开了突变的α-和β-亚基可独立使用(1个附加糖基化位点)或结合使用(2个附加糖基化位点)。利用FSH三维结构的50个模型鉴定了128种候选突变体，它们是只基于hCG结构以及FSH与hCG的序列对比而产生的，尽管hCG与FSH的β-亚基之间仅有32％同一性。WO 01/58493没有揭示FSH的任何α-或β-亚基的生产或测试，其中所述FSH的糖基化位点是通过定点诱变技术导入的。
因此，临床上需要一种产物，它提供部分或全部与FSH相关的治疗效果，与现有的FSH产品相比给药频率较少，其循环FSH活性的水平与目前治疗相比最好更稳定。
本发明针对这样的产品及制备这样的产品的方法。
发明内容
本发明涉及一种突变的FSH，其中FSH α-亚基包含SEQ ID NO3所示的序列，FSH β-亚基包含SEQ ID NO4所示的序列。该突变的FSH的N-糖基化可发生在所述突变的FSH的天冬酰胺残基0、1、2、3、4、5或6上。突变的α亚基的N83可以是糖基化的。突变的β亚基的N55可以是糖基化的。
本发明还涉及一种分离的DNA，其编码包含SEQ ID NO3所示序列的FSH α-亚基突变体。本发明还涉及一种分离的DNA，其编码包含SEQ IDNO4所示序列的FSH β-亚基突变体。
本发明还涉及一种含有DNA的载体，其中所述DNA编码包含SEQ IDNO3所示序列的FSH α-亚基突变体。所述载体可以是表达载体。
本发明还涉及一种含有DNA的载体，其中所述DNA编码包含SEQ IDNO4所示序列的FSH β-亚基突变体。所述载体可以是表达载体。
本发明还涉及一种含有第一DNA和第二DNA的载体，其中第一DNA编码包含SEQ ID NO3所示序列的FSH α-亚基突变体，第二DNA编码包含SEQ ID NO4所示序列的FSH β-亚基突变体。所述载体可以是表达载体。
本发明还涉及一种含有载体的细胞，其中所述载体含有编码包含SEQ IDNO3所示序列的FSH α-亚基突变体的DNA。所述载体可以是表达载体。所述细胞可以是哺乳动物细胞。
本发明还涉及一种含有载体的细胞，其中所述载体含有编码包含SEQ IDNO4所示序列的FSH β-亚基突变体的DNA。所述载体可以是表达载体。所述细胞可以是哺乳动物细胞。
本发明还涉及一种含有载体的细胞，所述载体含有第一DNA和第二DNA，其中所述第一DNA编码包含SEQ ID NO3所示序列的FSH α-亚基突变体，所述第二DNA编码包含SEQ ID NO4所示序列的FSH β-亚基突变体。所述载体可以是表达载体。所述细胞可以是哺乳动物细胞。
本发明还涉及一种含有第一和第二载体的细胞，其中第一载体含有编码包含SEQ ID NO3所示序列的FSH α-亚基突变体的DNA，第二载体含有编码包含SEQ ID NO4所示序列的FSH β-亚基突变体的DNA。所述载体可以是表达载体。所述细胞可以是哺乳动物细胞。
本发明还涉及一种FSH突变体的生产方法，包括培养能够使蛋白质糖基化的哺乳动物细胞，其中所述细胞含有第一表达载体和第二表达载体，所述第一表达载体含有编码包含SEQ ID NO1所示序列的FSH α-亚基的DNA，所述第二表达载体含有编码包含SEQ ID NO2所示序列的FSH β-亚基的DNA。
本发明还涉及一种含有FSH突变体和药用载体或赋形剂的组合物，其中FSH α-亚基包含SEQ ID NO3所示的序列，FSH β-亚基包含SEQ ID NO4所示的序列。
本发明还涉及一种治疗不孕哺乳动物的方法，包括把有效量的突变的FSH突变体给予有需要的哺乳动物，其中FSH α-亚基包含SEQ ID NO3所示的序列，FSH β-亚基包含SEQ ID NO4所示的序列。
本发明还涉及一种刺激哺乳动物卵泡生成的方法，包括把有效量的突变的FSH突变体给予有需要的哺乳动物，其中FSH α-亚基包含SEQ ID NO3所示的序列，FSH β-亚基包含SEQ ID NO4所示的序列。
本发明还涉及一种诱导哺乳动物卵巢超排卵(hyperstimulation)的方法，包括把有效量的突变的FSH突变体给予有需要的哺乳动物，其中FSH α-亚基包含SEQ ID NO3所示的序列，FSH β-亚基包含SEQ ID NO4所示的序列。
图1所示为表达αtH83N亚基所用的表达载体的质粒图谱。
图2所示为瞬时表达βE55/V57T亚基所用的表达载体的质粒图谱。
图3所示为表达βE55/V57T亚基所用的表达载体的质粒图谱。
图4所示为GM-1的形态学。A和C部分是对GM-1和Gonal-F进行的MALDI-TOF质谱；B部分是对GM-1和Gonal-F进行的LDS-PAGE分析。
图5所示为GM-1在未完全发育的大鼠两日排卵诱导模型中的性能。
具体实施例方式
虽然已经发现，增加FSH的碳水化合物含量可以延长体内半衰期，但改善FSH的半衰期远比简单地导入附加糖基化位点来得复杂。虽然导入碳水化合物需要一个糖基化共有序列，但不能充分保证将来用到碳水化合物附加位点。其它因子，例如生物合成过程中局部蛋白质折叠和构象等等，也决定一个寡糖是否附在一给定的共有序列位点上。另外，共有序列必须处于这样的位置该位点的糖基化不会干扰受体结合，或者影响到糖蛋白的折叠、构象或稳定性。
为此，目前具有较长半衰期的FSH类似物限于融合蛋白，其中多肽的融合部分包括附加糖基化位点。必须通过定点诱变技术将糖基化位点导入，由此产生半衰期较长的FSH类似物。
因为共有残基需要加在与碳水化合物的加入相配的位置上，所以利用定点诱变加入糖基化位点时认识FSH的结构至关重要。如果突变引入糖基化位点，则突变的残基不应该破坏该蛋白质的三维结构或者不应该明显损害该蛋白质所希望的功能，如受体结合或激活。此外，加入的共有残基不应该嵌入折叠蛋白质结构内部，否则不可能在特定位点上发生糖基化。
直至最近，促性腺激素的三维结构仅限于hCG晶体结构的两个独立的报导基因部分去糖基hCG的其中一个结构(Lapthor等，1994；Wu et al.，1994)以及全糖基化hCG和两个Fv片段的三元复合物低解离结构(Tegoni等，1999)。
虽然hCG和FSH具有基本上相同的折叠模式，但这两种结构明显不同(Fox等，2001)，由预先确定的hCG结构无法适当地模拟FSH分子各氨基酸残基的详细结构(Wu等，1994；Lapthorn等，1994)。
本发明针对一种FSH突变体，它仅基于人FSH分子三维晶体结构而设计(Fox等，2001)。本发明的FSH突变体(“GM-1”)经修饰带有下列取代，从而产生了附加糖基化识别位点α-亚基的H83N和β-亚基的E55N/V57T。重组FSH的一或多个附加糖基化位点可发生糖基化。突变的FSH中一或多个附加糖基化位点的糖基化可于体内或体外发生。
本发明的FSH突变体可通过本领域已知的任何合适方法产生。这些方法包括构建核苷酸序列，所述核苷酸序列编码各自FSH突变体以及在合适转染宿主内表达氨基酸序列。本发明的FSH突变体也可通过化学合成或者化学合成与重组DNA技术结合来产生。
本发明的FSH突变体可包含FSH的α-和β-亚基，为两条分离的多肽链形式，其中所述两条链在体内二聚化从而形成二聚体多肽，或者它可包含单链构造体，所述构造体的两个亚基由肽键或肽接头共价连接。接头肽的氨基酸残基表现出对FSH突变体活性影响不大的性质。
本发明的FSH突变体具有比野生型FSH长的半衰期。本发明的FSH突变体也具有比野生型FSH高的稳定性。FSH突变体包含的寡糖可位于N-联糖基化位点0、1、2、3、4、5或6上。FSH突变体可含有一或多个FSH突变同种型，其中每个同种型所含的寡糖位于N-联糖基化位点0、1、2、3、4、5或6上。
通过分离或合成编码亲代FSH亚基(例如分别具有SEQ ID NO3和4所示氨基酸序列的hFSH-α或hFSH-β)的核苷酸序列，可以构建编码本发明FSH突变体的α-或β-亚基的核苷酸序列。再将该核苷酸序列改性以取代有关的氨基酸残基。由定点诱变可修饰核苷酸序列。另一个选择是，由化学合成来制备核苷酸序列，其中基于FSH突变体的具体氨基酸序列来设计寡核苷酸。
可将编码多肽的核苷酸序列插入重组载体中，并与在所希望的转染宿主细胞中表达多肽所需的调控序列操作性相连。本领域技术人员无需进行过多实验就可以在这些载体、表达调控序列和宿主中作出选择。重组载体可以是自动复制的载体，即以染色体外实体存在的载体，其复杂与染色体复制无关，例如质粒。或者，载体可以是这样的载体当被导入宿主细胞时与该宿主细胞基因组整合，并与染色体一起复制到它已经被整合的基因组中。
载体可以是一种表达载体，其中编码本发明多肽的核苷酸序列与该核苷酸序列转录所需的附加节段操作性相连。载体可以由质粒或病毒性DNA产生。通过商业途径可以获得大量的在本文所述宿主细胞中表达的合适表达载体，或者可参见文献描述。
重组载体还可以包含能够使该载体在有关宿主细胞中复制的DNA序列。例如，这样的序列(当宿主细胞是哺乳动物细胞时)是SV40复制起点。载体还可以包含选择性标记物，例如其产物与宿主细胞缺失互补的基因，譬如说编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因或者赋予药物抗性的物质，例如氨比西林、卡那霉素、四环素氯霉素、新霉素、潮霉素或甲氨蝶呤。
载体也可以包含扩增基因，例如DHFR，这样可为合适的培养基选择具有扩增基因和侧翼序列多重拷贝的细胞，包括突变的FSH DNA。此处的术语“调控序列”定义为包括需要或有利于表达本发明多肽的全部组件。例如，在哺乳动物细胞中引导转录的合适调控序列包括SV40和腺病毒的早期和后期启动子，譬如说腺病毒2主要后期启动子、MT-1(金属硫蛋白基因)启动子和人细胞巨化病毒即刻早期基因启动子(CMV)。
本发明还涉及编码FSH H83N α-亚基的分离DNA以及编码FSHE55N/V57T β-亚基的分离DNA。不论是通过定点诱变、合成、PCR还是其它方法制备的编码FSH突变体的本发明核苷酸序列，都可任选地包括一个编码信号肽的核苷酸序列。当多肽由它表达的细胞中分泌出来时就含有信号肽。这样的信号肽如果存在的话，应该能够被选取来表达多肽的细胞所识别。该信号肽可以与多肽同源(例如，正常情况下与hFSH亚基联合)或者异源(例如，来自除hFSH以外的其它来源)，或者可以与宿主细胞同源或异源，即正常情况下由宿主细胞表达或者正常情况下不是由宿主细胞表达。
可使用任何合适的宿主产生本发明的多肽亚基，包括细菌、真菌(包括酵母)、植物、昆虫、哺乳动物或其它合适的动物细胞或细胞系，以及转基因动物或植物。合适的哺乳动物宿主细胞的例子包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如CHO-KL；ATCC CCL-61)、绿猴细胞系(COS)(例如COS 1(ATCCCRL-1650)、COS 7(ATCC CRL-1651))、小鼠细胞(例如NSIO)、幼仓鼠肾(BI-EK)细胞系(例如ATCC CRL-1632或ATCC CCL-10)、和人细胞(例如BEK293(ATCC CRL-1573))、以及组织培养基中的植物细胞。其它合适的细胞系已为本领域所知，可通过公共保藏机构获得，如美国菌种保藏中心。将外源DNA引入哺乳动物宿主细胞的方法包括磷酸钙介导的转染法、电穿孔法、DEAE-右旋糖介导的转染法、脂质体介导的转染法和病毒性载体。
运用本领域公知的方法在适合产生多肽的营养培养基中培养细胞。例如，在允许表达和/或分离多肽的条件下，在实验室或工业发酵罐内的适当培养基中通过振荡培养瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连接式、分批式、流加式或者固态发酵法)培养细胞。根据本领域已知的程序，培养用的适当营养培养基包括碳源和氮源以及无机盐。适当的培养基可通过商业途径获得，或者可按照已公开的组成制备(例如，参见美国菌种保藏中心的目录)。如果多肽分泌进入营养培养基中，那么可从培养基中直接回收多肽。如果不分泌多肽，那么可从细胞溶解物中回收多肽。
运用本领域已知的方法可回收突变的FSH多肽。例如，可用常规方法从营养培养基中回收，包括但不限于，离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。突变的FSH多肽可通过本领域公知的各种方法纯化，包括但不限于，色谱法(例如离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法和尺寸排阻色谱法)、电泳方法(例如制备性等电聚焦)、差异溶解度法(例如硫酸铵沉淀法)、SDS-PAGE或者萃取。
本发明还涉及一种含有本发明FSH突变体的药物组合物。所述药物组合物用来刺激卵泡生成，例如可与排卵诱导或辅助生殖技术(ART)联用。因为本发明的FSH突变体用来诱导多卵泡发育和成熟特别有效，所以它特别适用于希望收获多个卵母细胞的ART。
另一个选择是，小心选取剂量，本发明的FSH突变体可用于OI的诱导单一卵泡生成，或者用于IUI、体内受精的诱导少量卵泡生成(最多3个卵泡左右)。减少FSH突变体剂量或者给药频率比常规FSH制剂少都可实现单一卵泡生成。例如，本发明的FSH制剂用于OI的剂量是每隔二日225-400 IU或以下，取决于病人的反应。通过超声波检查法可跟踪病人的反应。
本发明的FSH突变体可用于控制性超排卵(controlled ovarianhyperstimulation，COH)方案中。COH的标准方案包括一个向下调节的阶段，在这个阶段中，通过给予促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂来抑制内源性黄体生成激素(LH)，接着的是一个刺激阶段，在这一阶段中，每日给予卵泡刺激素(FSH)，通常约150-225 IU/天，诱导卵泡发育(卵泡生成)。另一种选择是在自然月经或诱导月经后开始用FSH刺激，然后给予GnRH拮抗剂(通常在刺激阶段的约第6开始)。当至少有3个卵泡＞16毫米(其中一个是18毫米)时，给予单丸剂(single bolus)hCG(5-10,000 IU)模拟天然LH峰并引发排卵。注射hCG后36-38小时定为回收卵母细胞的时间。
本发明的FSH突变体也可用于OI和IUI。例如，在自然月经或诱导月经后开始用本发明的制剂进行FSH刺激，每日剂量为75-150 IU。当有1或3个卵泡的直径到达至少16毫米时，给予单丸剂hCG诱导排卵。通过定期性交或IUI进行体内受精。
因为本发明的FSH突变体与野生型FSH制剂相比具有较长的半衰期，所以上述方案可采用较低IU剂量的FSH，和/或可缩短FSH刺激阶段，但能够获得相同或更好的反应(以卵泡数目和卵泡生存能力计)。例如，每日给予约50-150 IU FSH，较好约50-100 IU FSH，更好约50-75 IU FSH，本发明的FSH制剂可以获得足够的卵泡生成。FSH的给予通常以日或半日计。给药时间可少于约14天，较好少于约12天，更好少于约11或10天。对于OI，本发明的FSH突变体制剂的给予剂量是25-150 IU FSH/天，较好是50-125 IU FSH/天。治疗男性不孕症时，本发明的FSH突变体制剂的给予剂量是每周三次，每次150-300 IU，直至精子生成水平足够通过定期性交或ART技术进行受精。
因为本发明的突变FSH具有较长的半衰期，所以可作为长效型制剂给药。常规FSH可每隔一天给予约300 IU，获得相似效果要每天给予约150 IU。术语“长效的”指的是包括给药频率少于每隔一天的FSH制剂。本发明的突变FSH可每隔二天、每隔三天、每隔四天、每隔五天或每隔六天给予，而获得的效果与每日给予常规FSH相若或者更好。
在本发明一相关方面中，采用FSH突变体或含有FSH突变体的药物组合物制备治疗疾病、障碍或病症的药物。在另一方面，本发明的多肽或药物组合物用于哺乳动物特别是人的治疗方法中，所述方法包括把这些多肽或药物组合物给予有需要的哺乳动物。
对于本领域技术人员显而易见的是，有效量的本发明的多肽、制剂或组合物取决于疾病类型、剂量、给药进度、是单独给予所述多肽、制剂或组合物还是与其它治疗药物联用、组合物的血清半衰期以及病人的一般健康状况。一般地，有效量的本发明的制剂或组合物足够保证治疗效果。
本发明的FSH突变体可以药物组合物形式给予，所述药物组合物还包括一或多种个药用载体或赋形剂。“药用的”指的是不会对接受的病人产生任何不利影响的载体或赋形剂。这样的药用载体和赋形剂是本领域熟知的，运用已知方法可将本发明的多肽配制成药物组合物(例如见A.R.Gennaro的参考书Remington’s Pharmaceutical Sciences，第8部分，第20版，(1990)，MerckPublishin Companyg；S.Frokjaer和L.Hovgaard的Pharmaceutical FormulationDevelopment of Peptides and Proteins，Eds.，Taylor & Francis(2000)；以及A.Kibbe的Handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版，Pharmaceutical Press(2000))。可用于包含本发明多肽的组合物中的药用赋形剂包括例如缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子表面活性剂或去污剂(“润湿剂”)、抗氧化剂、膨胀剂或填充剂、螯合剂或助溶剂。
包含本发明FSH突变体的药物组合物可以配制成各种形式，包括液体(例如容易使用的溶液或悬液)、凝胶、冻干形式或任何其它合适的形式，譬如粉剂或适合制备溶液的晶体。组合物形式取决于要治疗的具体情况，这对本领域技术人员是显而易见的。
包含本发明FSH突变体的药物组合物可通过静脉内、肌内、腹膜内、皮内、皮下、舌下、口腔、鼻内、透皮等途径，或者通过吸入或其它任何可接受的方式(例如用Powder Ject或Pro Lease技术或者笔型注射系统)给予。给药模式取决于要治疗的具体情况，这对本领域技术人员是显而易见的。本发明的药物组合物可经皮下途径给予，因为这种方式允许病人自己给药。
本发明的药物组合物可与其它治疗药物联用。这些药物可作为同一药物组合物的一部分，或者可与本发明的多肽分开给予，其给药时间可以与本发明的多肽同时进行，又可以按照任何其它可接受的治疗进度。另外，本发明的多肽、制剂或药物组合物可作为其它疗法的辅助手段。
本发明还涉及多个方面，参见以下非限制性实施例的描述。
实施例1 FSH单突变体候选糖基化位点的鉴定采用人FSH的三维晶体结构来鉴定FSH的α-和β-亚基的候选糖基化位点。晶体结构中每个不对称单元含有两个FSH分子(4个亚基)。这两个FSH分子是叠加的，对它们进行比较，肉眼检查每个残基以鉴定潜在的N-糖基化位点。FSH的晶体结构与关于FSH/FSHR受体相互作用的认识结合，有助于选择潜在的N-糖基化位点。主要设计标准是对三维结构的破坏尽可能小，对预测的结合和激活位点的破坏尽可能小，以及预计的三维结构与糖基化相配。
基于以上标准，对FSH的氨基酸序列作了20个单突变体(8α和12β)，包括以下2个突变体α-亚基H83Nβ-亚基E55N/V57TFSH单突变体的瞬时表达参照实施例3所述的方法，进行定点诱变获得各个突变体。这些突变体与互补野生型亚基一起小规模地在CHO-Dukx细胞中瞬时表达，表达的方法与实施例4所述的方法类似。对得到的培养上清液进行ELISA分析，结果显示20个突变体中有19个能够瞬时表达。对照物和突变体的瞬时表达水平的范围是0-1.95μg/ml，平均值为0.59μg/ml，中值为0.5μg/ml，模拟转染重复确认为0μg/ml。
FSH单突变体的形态分析在允许完整FSH异二聚体与自由α-和β-亚基分离的非还原性LDS PAGE条件下，通过电泳分析来自FSH单突变体瞬时表达得到的浓缩培养上清液等分试样。将蛋白质电泳转移到PVDF并用针对FSH α-和β-亚基的初级抗体加以分析。预先筛选以测试购买的大量不同初级抗体，有时在测试后再作确认分析，但最有用的初级抗体证明是1.5μg/ml Chromaprobe BHS 104(生物素化的多克隆山羊抗FSHα-亚基)和1.5μg/ml Chromaprobe BHS 105(小鼠单克隆抗FSH β-亚基)。
两种附加型式的形态分析加上异二聚体-完整样品的蛋白质印迹。用蛋白质印迹分析异二聚体-解离样品以及用放射自显影法分析带有代谢标记35S-Cys的突变体和对照物的电泳分离异二聚体-解离免疫沉淀物。
在19个可表达的FSH突变体中，由亚基或异二聚体的表观分子量分布迁移证明，只有5个突变体表现出糖基化程度增大。该5个表现出糖基化程度增大的突变体包括一个α-亚基和四个β-亚基，包括βE55N/V57T在内。
有趣的是，α-亚基突变体αH83N的糖基化没有增大，但似乎可导致蛋白质群的异二聚体丰度相对于在相同瞬时条件下共表达的野生型FSH亚基的异二聚体丰度高。
瞬时表达的FSH单突变体的半衰期将由瞬时表达获得的包括βE55N/V57T在内的5个高度糖基化单突变体的药物动力学与Gonal-F进行比较。Gonal-F是FSH的一种重组形式，不易将它与天然hFSH区分开来。由ELISA定量测定每个PK实验的注射物质中以及注射后在预定时间收集到的大鼠血清样品中的FSH含量。包括β亚基突变体E55N/V57T在内的5个单突变体中没有一个的半衰期比对照Gonal-F的半衰期长。
单一位点糖基化突变体的纯化和分析使4个高度糖基化β亚基单突变体中3个突变体(包括E55N/V57T突变体)表达并通过免疫亲和色谱法纯化。将包括E55N/V57T突变体在内的该3个高度糖基化β亚基突变体的体外活性与重组FSH进行比较，观察在(i)上和125I放射标记的FSH竞争与含有人FSH受体(Ki)的膜制剂结合的能力以及刺激产生与FSHR偶合的cAMP的能力(EC50)KiEC50βE55N/V57T 8.6×10-10M3.9×10-11MrhFSH 4.8×10-10M1.2×10-11M上述结果显示，β-亚基突变体E55N/V57T具有与野生型FSH相当的体外活性。事实上，该3个β-亚基单突变体每一个的体外活性都比得上野生型FSH。此外，对纯化的β-亚基单突变体作质谱分析，显示这3个突变体中每一个的质量分布都发生迁移。不过，在静脉注射单剂给予未发育成熟的雌性大鼠之后测定纯化蛋白质的药物动力学时，没有一个糖基化突变体的半衰期是大大延长的。rhFSH的半衰期为3.8±0.6h，βE55N/V57T的半衰期是4.8±0.4h。
实施例2 双糖基化突变体的生产和分析由于单独α-和β-亚基的单突变体无法提高FSH的半衰期，所以在瞬时表达中将2个α-亚基单突变体与3个β-亚基单突变体结合，构建6个不同双突变体，包括GM-1，它包括α-亚基突变体H83N和β-亚基突变体E55N/V57T。
6个双突变体中有5个(包括GM-1)能够表达。对可表达的5个双突变体进行分析，分析它们刺激产生与FSHR偶合的cAMP的能力。该5个双突变体中每一个，包括GM-1在内，在体内刺激与FSHR偶合的cAMP产生的能力比得上rhFSH。
将该同样的5个FSH双突变体的药物动力学与重组hFSH和CTP-FSH进行比较。表1的结果显示，GM-1的半衰期远远大于rhFSH，接近CTP-FSH。
表1-药物动力学
考虑到β-亚基单突变体E55N/V57T本身对半衰期没有作用，故GM-1具有延长的半衰期就令人惊讶了。另外，α-亚基突变体H83N不会增大糖基化，所以GM-1的半衰期延长就更令人惊讶了。
实施例3 GM-1的产生将人FSH的α-和β-亚基的cDNA亚克隆到pDONR载体(Invitrogen)。采用QuikChangeTM定点诱变试剂盒(Stratagene)把N-联糖基化位点导入FSH的α-和β-亚基内。QuikChangeTM系统使用两个含有所希望的突变的合成寡核苷酸引物。采用以下成对的寡核苷酸导入N-联糖基化位点表2-寡核苷酸
运用ABI PRISM BigDyeTMTerminator v3.0 Ready Reaction CycleSequencing Kit测序试剂盒确认突变体的序列，然后用ABI PRISM 310 GeneticAnalyzer分析仪进行分析。
运用GatewayTM克隆技术(Invitrogen)，将αH83N和βE55/V57T突变体亚克隆到修饰的pCI表达载体中，得到质粒p13251和p13252，见图1和图2。pCI哺乳动物表达载体预先已经用GATEWAY载体转化系统(Invitrogen)转化为GATEWAY目的载体。pCI表达载体含有用于调节插入基因表达的人细胞巨化病毒即刻早期增强子/启动子、用于启动表达的基因内含子上游、以及用于终止转录的来自插入基因的猿病毒40后期聚腺苷酸化信号下游。
还将αH83N突变体亚克隆到Dα载体中，得到质粒p13538，见图3。Dα载体是pCLH3AXSV2DHFR的衍生物。把该载体修饰成包括异源内含子，该内含子带有用合成剪接供体改造的促性腺激素α亚基基因内含子A的2kbXbaI-PstI片段上游(含有剪接受体)。所述异源内含子位于启动子与XhoI克隆位点之间，把它放在RNA转录物5’未翻译区内。Dα载体的详细描述可参见Kelton等的文献(Mol Cell Endocrinol 89141-151(1992))。
实施例4 突变的FSH的表达使p13251(αH83N)和p13251(βE55/V57T)共转染，在无血清培养基中瞬时表达促性腺激素，首先得到FSH的GM-1糖基化突变体(“GM-1 Lot 1”)。对于大规模lipofectamine转染试剂介导的转染(12-24 T175瓶)，转染之前需要在生长培养基(MEM a(+)，10％FBS，1％L-谷酰胺)中接种CHO-Dukx细胞18至24小时，为1.3×107细胞/瓶。转染细胞要大批制备lipofectamine2000/Optimem mix混合物(一份17.6)，并且还要用33mcg DNA为每个T175瓶每个亚基(共66mcg)制备一批在Optimem中的DNA。将Optimem/DNA与Optimem/Lipofectamine制剂混合20分钟之后，向最新加入的(43.8ml/瓶)细胞单层施加在Optimem中的DNA/Lipofectamine复合物(约10ml/瓶)。保持37°4至6小时，把该细胞单层加到50ml生长培养基中。转染后约24小时，将细胞转染到生产培养基(加入了L-谷酰胺的Sigma CHO PFM，或者转移到Serono专有配方Sigma CHO PFM C0234)中。48小时后收获条件生产培养基。
实施例5 突变的FSH的克隆原克隆(Protoclones)运用标准方法使CHO-DUKX细胞与在Dα中的αH83N(质粒#13538)以及在pCIattR中的βE55N/V57T(质粒#13252)(两种突变体比率为1∶3)进行磷酸钙共转染。在选择培养基(MEMα(-)，10％dFBS，4mM L-谷酰胺)中接种细胞，96孔板中每孔10,000个细胞(共1596个孔)，转染后48小时产生原克隆。大约2星期之后，细胞按1∶8分裂到含0.02μM MTX的选择培养基中。在6至8星期时间内，提高MTX的浓度(0.1μM(192孔)、0.5μM、1.0μM(116孔))，重复此分裂过程，在1.0μM MTX中有116个原克隆存活。
从96孔板(在1.0μM MTX中，10％FBS)取24h表达样品，以DSL ELISA评价该116个原克隆的表达。表达水平的范围是超刻度低值至3.72μg/ml。将最高表达水平的17个原克隆在24孔板、T25瓶中扩增，然后低温保存每个原克隆，每个一组，每组3个小瓶。解冻头2个原克隆，按T25规模扩增以便确认表达。GM1-21和GM1-22的容积产率分别是1.74和0.74μg/ml，比产率分别是5.06和1.28pcd。基于这些结果，选取GM1-21进行克隆，并且在滚瓶中生产第二批GM-1，参见实施例6所述。
克隆使96孔板分别接种，至0.25、0.5、1.0和2.0 GM-1-21细胞/孔，从而启动限制性稀释克隆。克隆培养基是无MTX的含10％cFBS和1％L-谷酰胺的DMEM/F12。用显微镜检查全部孔，消除含多个细胞的任何孔。
生长大约2星期之后，在24孔板以及最后在T25瓶中扩增细胞群。一旦细胞到80-100％的汇合，用DSL FSH ELISA测定容积产率(样品含10％FBS)。使最佳的8个克隆在T75瓶中扩增，测定24h容积表达和比表达。每个克隆一组，每组3个小瓶，低温保存在含10％cFBS、1％L-谷酰胺和10％DMSO的DMEM/F12中。CHO-B1-GM1-21-98的容积产率是7.21μg/ml，比产率是6.25pcd。相反，CHO-B1-GM1-21-107的比产率最高，为7.71pcd，容积产率为5.81μg/ml。
使CHO-B1-GM1-21-98和CHO-B1-GM1-21-107在4个T175瓶中扩增。当到达大约90％汇合时，将pre-MCB(每个克隆25个小瓶)低温保存在含10％FBS、1％L-谷酰胺和10％DMSO的DMEM/F12中。每小瓶的GM1-21-98(第7代)含有3.26百万个细胞，每小瓶的GM1-21-07(第6代)含有6.1百万个细胞。每库取一小瓶送至Charles River Laboratories实验室(Malvem，PA)作GMP测试。这些测试包括PTC支原体、不育、LCMV攻击的MAP测试、HAP测试、分析异嗜性鼠白血病毒的延伸体外聚焦诱导试验(Extended In Vitro FocusInduction Assay)、分析鼠白血病毒的延伸XC空斑测定(Extended XC PlaqueAssay)、以及同工酶分析，每个小瓶都接受全部测试。
实施例6 突变的FSH的附加表达参照实施例5所述生长原克隆GM1-21的方法，在2个850cm2滚瓶中生产GM-1(“GM-1 Lot 2”)。本实施例采用无血清生产培养基(DMEM-F12+IFCS)的体积是2600ml。含有大约0.2mg GM-1的小量(13ml)浓缩培养基上清液于-80℃保存在SRBI，这是因为在透析转移过程中损失了36ml浓缩培养上清液。利用DSL ActiveFSH ELISA进行定量分析，转化比是1IU＝138ngFSH。
实施例7 突变的FSH的纯化样品制备收获含有突变FSH的生产培养基，用0.22μm过滤装置过滤，冻存于-70℃。4℃下解冻培养基中的目标蛋白质，过夜，并采用Ultrasette ScreenChannel TFF装置、10K Omega膜、P/N OS010C70(Pall Life Science)进行超声波浓缩。回收保留物，相对于3×5升含有0.5M NaCl的pH7.4 0.1M Tris透析，过夜。回收透析后的蛋白质，经0.22μm滤膜过滤，立即纯化或者冻存于-70℃直至纯化。
免疫亲和纯化用抗FSH免疫亲和树脂B5(Serobio)纯化糖基化突变体GM-1，每毫升树脂含有2.2mg抗-FSH抗体。在1.5cm×10cm OmniFit柱中制备10.2ml床体积。预先用含有0.5M NaCl的pH7.4 0.1M Tris平衡树脂。以1ml/分钟的速率装载透析后的粗蛋白质。依次用5柱体积含0.5M NaCl的pH7.4 0.1MTris、5柱体积pH7.6 100mM碳酸氢铵洗涤柱，目标蛋白质用18-20柱体积1M NH4OH洗脱。合并含有洗脱蛋白质的馏分，用冰醋酸中和，用Amicon stirredcell装置和Amicon YM 10膜进行超声波浓缩。在Pierce Snakeskin透析管10KMWCO中相对于4×5升水透析保留物，透析时间为24小时。回收透析后的蛋白质，通过Centriprep YM 10浓缩至体积大约1ml。
特性分析对于异二聚体纯度为73.8-80.6％，通过此单一步骤免疫亲和方法回收纯化蛋白质GM-1的表观回收率是31.4-52.9％，蛋白质的浓度由氨基酸组成分析确定，其中分子量根据亚基的MALDI-TOF糖型分布最初估计是35,000 Da。
通过N-末端肽测序来确认蛋白质的特性。在GM-1中鉴定到的全部N-末端序列反映FSH的α-亚基或β-亚基末端。虽然不能够确定可用银染色看到的单一低丰度蛋白质带的特性，但是数据仍然与亚基纯度≥80％相一致。
实施例8 突变的FSH的形态为了测定纯化蛋白质的糖型分布，对GM-1和Gonal-F进行MALDI-TOF质谱分析。质谱分析结果示于图4A，由此图可见，GM-1中含有高度糖化形式的质量等级(mass class)的相对丰度比Gonal-F高26％，其中，GM-1含有总共36.8％亚基糖型，而Gonal-F含有29.2％亚基糖型。Gonal F与GM-1的MALDI-TOF质谱之差异与通过银染色的PAGE以及蛋白质印迹(图4B)观察到的亚基和异二聚体的表观分子量分布迁移是一致的。
在MALDI-TOF质谱条件下，GM-1似乎偏向于保留αβ异二聚体构象，见图4C，与在Gonal F看到的αα、αβ和ββ二聚体的随机分布相反。这提示在MALDI-TOF樣品制备条件下GM-1的解离比Gonal-F少，与GM-1异二聚体可能有更高的热力学和动力学稳定性相符。设计了一个GM-1糖基化模型，通过双触角、岩藻糖基化、二唾液酸化糖型不分等级地随机占据完全无糖基化亚基的6个位点，随机占据呈二元分布，将该模型与观察到的质谱作比较。结果显示，端点级(α0)的占据率比预期高(0.021 vs 0.0)，(α1或β0)级的占据率比预期低(0.095 vs 0.214)，(α2或β1)级的占据率比预期高(0.516 vs 0.428)，(α3或β2)级的占据率比预期高(0.312 vs 0.285)，β3级的占据率比预期低(0.056 vs0.071)。
实施例9 突变的FSH的分析突变的FSH的体外结合用FSHR cAMP试验测定GM-1 Lot1和GM-1 Lot2的功效。使大批重组地表达人FSH受体或人LH受体的CHO细胞系在pH7.4 0.025M Tris(含有0.25M蔗糖、10mM MgCl2、1mM EDTA以及千分之一Sigma蛋白酶抑制剂鸡尾酒(p8350))中生长，并通过氮气空化作用(20分钟内平衡至900psi，然后快速释放压力)使其分裂。待初步澄清后(10min×1000xg，4℃)，超离心使膜馏分沉淀(60min×100,000xg，4℃)。将膜馏分重悬于结合缓冲液(pH7.40.01M Tris，含有5mM MgCl2)中，以Bradford(BioRad)蛋白质检测法估算蛋白质浓度，冻存于-80℃以备将来使用。一般地，每孔取15μg适当带有FSHR或LHR的膜蛋白进行竞争试验作分析。
评价96孔板(100μl/样品孔)的放射配体结合情况。分析缓冲液是pH7.40.01M Tris，含有5mM MgCl2和0.1％BSA以及0.3nM125I-hCG(分析LHR时)或者0.4nM125I-FSH(分析FSHR时)。用分析缓冲液稀释竞争GM-1，使其与带放射标记的配体混合，然后加入带受体的膜。在500nM无标记hCG或FSH存在下测定非特异性结合。在37℃下摇动平衡90分钟进行结合。用低蛋白质结合微孔滤膜(Millipore Multiscreen)过滤，终止结合试验，所述滤膜预先在分析缓冲液中培育。用冰冷结合缓冲液(无BSA的分析缓冲液)洗涤滤孔三次，干燥，再穿插。运用专门针对125I放射的预先编程检测窗口在HP CobraII gamma计数器上测量结合放射活性。以单一位点模型和Graph Pad Prizm软件分析数据。
突变的FSH的体外功能测定上述促性腺激素受体转染的CHO细胞中产生cAMP的剂量反应曲线，确定GM-1 Lot1和GM-1 Lot2的功能。下表3给出了兩批各自前导蛋白质的豁免鉴定(release qualification)数据
表3-GM-1的体外功能与受体结合特性
实施例10 突变的FSH的稳定性使GM-1无菌等分试样在4℃保持3个月，进行为期3个月的稳定性研究，测定GM-1生物活性稳定性。抽取该等分试样中的GM-1，在以下不同时间进行FSHR cAMP试验对其进行测试时间0点、7天、32天和91天。在本研究条件下，GM-1在4℃储存91天，其EC50变化少于2倍。这些数据表示，4℃储存GM-1，其生物活性可稳定地保存长达3个月。
实施例11 突变的FSH的活性图5所示为GM-1在未发育成熟大鼠2日排卵诱导模型中的性能。给予单剂重组hFSH无法引起排卵反应，但给予单剂GM-1就能够引起排卵反应。此外，在标准Steel-man Pohley卵巢增重试验中，GM-1的性能与Gonal-F相若(数据未示出)。
图5测试用的剂量是6、12和24 IU FSH。在此模型中以单剂、10 IU、三剂方案(4×25％、2×50％和1×100％)测试FSH-CTP(Organon 36286)，观察到每只动物的平均卵巢数目分别是16.3±3.8、19.1±3.6和21.5±3.9(数据未示出)。由以上数据可见，以1×100％给予12 IU GM-1可引发排卵反应，每只动物平均产生9.4±2.1卵子(给予6 IU产生6.8±1.6卵子/动物，给予24 IU产生14.6±3.6卵子/动物)。这些数据也证实了通过调节剂量方案，GM-1有可能趋向于产生“单一排卵”或更容易受控。
序列表<110>L.加罗内(Garone，Louise)S.阿金斯托(Arkinstall，Steven)W.布龙迪克(Brondyk，William)R.坎贝尔(Campbell，Robert)江旭亮(Jiang，Xuliang)S.麦肯纳(McKenna，Sean)M.泰珀(Tepper，Mark)<120>FSH糖基化突变体<130>05558.00003.PZUS00<160>8<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>92<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro1 5 10 15Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys20 25 30Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu35 40 45Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser50 55 60Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr65 70 75 80
Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser85 90<210>2<211>111<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu1 5 10 15Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys20 25 30Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln35 40 45Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro50 55 60Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr65 70 75 80Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val85 90 95Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu100 105 110<210>3<211>92<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>alpha亚基突变体H83N<400>3Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro1 5 10 15Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys20 25 30Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu35 40 45Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser50 55 60Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr65 70 75 80Ala Cys Asn Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser85 90<210>4<211>111<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>beta亚基突变体E55N/V57T<400>4Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu1 5 10 15
Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys20 25 30Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln35 40 45Lys Thr Cys Thr Phe Lys Asn Leu Thr Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro50 55 60Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr65 70 75 80Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val85 90 95Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu100 105 110<210>5<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>alpha H83N突变生成oligo 1<400>5cacacggcgt gcaactgcag tacttg26<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>alpha H83N突变生成oligo 2
<400>6caagtactgc agttgcacgc cgtgtg 26<210>7<211>49<212>DNA<213>人工<220>
<223>beta E55N/V57T突变生成oligo 1<400>7gcactctcac tgtttcatat gtcaggttct tgaaggtaca tgttttctg 49<210>8<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>beta E55N/V57T突变生成oligo 2<400>8cagaaaacat gtaccttcaa gaacctgaca tatgaaacag tgagagtgc 49
权利要求
1.一种突变的FSH，其中α-亚基包含SEQ ID NO3所示的序列，β-亚基包含SEQ ID NO4所示的序列。
全文摘要
本发明描述了一种可用来诱导人病人卵泡生成的新颖FSH突变体，其糖基化程度增大，半衰期延长。所述FSH突变体允许使用较低累积剂量的FSH，就可获得相同或更好的临床效果。
文档编号C07H21/04GK1984926SQ200480032665
公开日2007年6月20日 申请日期2004年9月2日 优先权日2003年9月2日
发明者L·M·加罗内, S·J·阿金斯托, W·H·布龙迪克, R·K·坎贝尔, 江旭亮, S·D·麦肯纳, M·泰珀 申请人:应用研究系统Ars股份公司