专利名称：：高融合率无噬菌体新生牛血清的生产工艺的制作方法
技术领域：
：本发明涉及新生牛血清的生产工艺，尤其是涉及一种高融合率无噬菌体新生牛血清的生产工艺。
背景技术：
：目前，通常情况下大规模生产的新生牛新血清在通过连续三道100nm过滤后，经噬斑法检测噬菌体阳性率超过90%。为保证生物制品的安全性，这些感染了噬菌体的新生牛血清需要经过一定剂量的伽马射线辐照，辐照后可使噬菌体阳性血清转阴，但同时由于辐照对各种生长因子、激素类均有不同程度的影响，随之影响了其在细胞培养中的效果。
发明内容本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种合理简单、细胞培养效果良好的高融合率无噬菌体新生牛血清的生产工艺。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现高融合率无噬菌体新生牛血清的生产工艺，其特征在于，该生产工艺包括以下步骤将新生牛血清通过10000道尔顿超滤膜，再通过切向超滤法将血清分为超滤液部分和浓縮液部分，将浓缩液部分通过伽马射线辐照后和超滤液部分合并，合并后重新过滤，得到高融合率无噬菌体新生牛血清。所述的切向超滤法是溶液在压力推动下，流经膜表面，小于膜孔的溶剂及小分子量的生长因子、激素透过超滤膜，成为超滤液，比膜孔大的溶质及溶质集团白蛋白、球蛋白、各种牛病毒、噬菌体、大部分热源质等被截留，随水流排出，成为浓縮液。所述的切向超滤法为动态过滤，分离是在流动状态下完成的，溶质仅在膜表面有限沉积，超滤速率衰减到一定程度而趋于平衡，且通过清洗可以恢复。所述的超滤液部分包含各种小分子量的生长因子、激素等。所述的浓縮液部分包含大分子量的白蛋白、球蛋白、各种牛病毒、噬菌体、大部分热源质以及少量生长因子、激素。所述的伽马射线辐照的剂量为824KGy。与现有技术相比，本发明的高融合率无噬菌体新生牛血清的生产工艺合理简单，避免了小分子量的生长因子、激素类在杀灭噬菌体、病毒过程时的辐照环节，最大程度地保留了新生牛血清原有的品质，得到的新生牛血清在保证质量前提下大大提高细胞培养效果。图1为本发明高融合率无噬菌体新生牛血清的生产工艺流程图；图2为SP2/0细胞生长曲线图。具体实施例方式下面对照附图及具体实施例对本发明作进一步说明。实施例11.材料1.1SP2/0细胞由上海细胞库提供，牛肾原代细胞自采1.2新生牛血清上海依科赛批号0612211.3DMEM细胞培养基由GIBCO公司提供1.4伽玛射线辐照由中国科学院上海辐照中心提供1.5过滤及超滤系统由美国millipore公司提供2.方法2.1新生牛血清处理试验组如图1所示，将已知噬菌体阳性的新生牛血清(061221)25000万毫升通过10000分子量膜超滤分成21000ml滤过液和3500ml浓縮液，分别无菌分装至包装瓶内，将3500ml浓縮液进行伽马射线辐照，剂量为20KGy，将辐照后的浓縮液与滤过液合并后无菌过滤；对照组将已知噬菌体阳性的新生牛血清(061221)25000万毫升进行伽马射线辐照，剂量为8KGy。2.2新生牛血清理化指标检测试验组和对照组及原批号按照中国药典2005版的小牛血清质控标准的规定进行检测。2.2.1蛋白含量测定方法用Lowry法2.2.2无菌检査方法按2005版中国药典附录XIIA2.2.3细菌内毒素含量测定方法按2005版中国药典附录XHE凝胶限量试验2.2.4牛腹泻病毒检测方法培养法牛肾原代细胞以DMEM培养基制成细胞悬液，接种等量供试品，37t:培养57天观察细胞病变，同时设立阴性、阳性对照。2.2.5血红蛋白含量测定方法用氰化高铁法2.2.6大肠杆菌噬菌体检测方法采用噬斑法和增值法2.2.7支原体试验方法采用培养法和DNA染色法2.3新生牛血清促细胞生长检查2.3.1细胞生长曲线的测定方法取供试品，按10%浓度配制细胞培养液，按每ml含104的细胞浓度接种细胞，每天计数活细胞，连续观察一周，并绘制生长曲线。2.3.2细胞培增时间的测定方法按生长曲线计算细胞的倍增时间，取细胞峰值前一天的细胞计数(Y)、接种细胞数(X)及生长时间(T)计算倍增时间^T/A(A=log2Y/X)2.3.3克隆率的测定方法按有限稀释法将细胞稀释，并按每孔1个细胞接种于96孔细胞培养板，于37'C、5%二氧化碳培养一周后计算克隆率克隆率A/B(A为细胞生长阳性孔数，B为接种细胞的总孔数)3.结果3.1新生牛血清理化指标检测结果5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注上表中g。/。为g/100ml。3.2促细胞生长试验结果3.2.1SP2/0细胞生长曲线如图2所示，SP2/0细胞的生长曲线，图中横轴单位为天，竖轴单位为(xlO'个/ml)。3.2.2促SP2/0细胞生长检査结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例2参见图1所示，一种高融合率无噬菌体新生牛血清的生产工艺，该生产工艺包括以下步骤将新生牛血清通过10000道尔顿超滤膜，再通过切向超滤法将血清分为超滤液部分和浓縮液部分，超滤液部分包含各种小分子量的生长因子、激素等，浓縮液部分包含大分子量的白蛋白、球蛋白、各种牛病毒、噬菌体、大部分热源质以及少量生长因子、激素，将浓縮液部分通过伽马射线辐照(剂量为824KGy)后和超滤液部分合并，合并后重新过滤，得到高融合率无噬菌体新生牛血清。超滤是以压力为推动力的膜分离技术之一，是以大分子与小分子分离为目的，膜孔径在20—1000A。之间。切向超滤法是溶液在压力推动下，流经膜表面，小于膜孔的溶剂及小分子量的生长因子、激素透过超滤膜，成为超滤液，比膜孔大的溶质及溶质集团白蛋白、球蛋白、各种牛病毒、噬菌体、大部分热源质等被截留，随水流排出，成为浓縮液，切向超滤法为动态过滤，分离是在流动状态下完成的，溶质仅在膜表面有限沉积，超滤速率衰减到一定程度而趋于平衡，且通过清洗可以恢复。权利要求1.高融合率无噬菌体新生牛血清的生产工艺，其特征在于，该生产工艺包括以下步骤将新生牛血清通过10000道尔顿超滤膜，再通过切向超滤法将血清分为超滤液部分和浓缩液部分，将浓缩液部分通过伽马射线辐照后和超滤液部分合并，合并后重新过滤，得到高融合率无噬菌体新生牛血清。2.根据权利要求1所述的高融合率无噬菌体新生牛血清的生产工艺，其特征在于，所述的切向超滤法是溶液在压力推动下，流经膜表面，小于膜孔的溶剂及小分子量的生长因子、激素透过超滤膜，成为超滤液，比膜孔大的溶质及溶质集团白蛋白、球蛋白、各种牛病毒、噬菌体、大部分热源质等被截留，随水流排出，成为浓缩液。3.根据权利要求1所述的高融合率无噬菌体新生牛血清的生产工艺，其特征在于，所述的切向超滤法为动态过滤，分离是在流动状态下完成的，溶质仅在膜表面有限沉积，超滤速率衰减到一定程度而趋于平衡，且通过清洗可以恢复。4.根据权利要求1所述的高融合率无噬菌体新生牛血清的生产工艺，其特征在于，所述的超滤液部分包含各种小分子量的生长因子、激素等。5.根据权利要求1所述的高融合率无噬菌体新生牛血清的生产工艺，其特征在于，所述的浓缩液部分包含大分子量的白蛋白、球蛋白、各种牛病毒、噬菌体、大部分热源质以及少量生长因子、激素。6.根据权利要求1所述的高融合率无噬菌体新生牛血清的生产工艺，其特征在于，所述的伽马射线辐照的剂量为824KGy。全文摘要本发明涉及一种高融合率无噬菌体新生牛血清的生产工艺，该生产工艺包括以下步骤将新生牛血清通过10000道尔顿超滤膜，再通过切向超滤法将血清分为超滤液部分和浓缩液部分，超滤液部分包含各种小分子量的生长因子、激素，浓缩液部分包含大分子量的各种牛病毒、噬菌体、大部分热源质等，将浓缩液部分通过伽马射线辐照后和超滤液部分合并，合并后重新过滤，得到高融合率无噬菌体新生牛血清。与现有技术相比，本发明的高融合率无噬菌体新生牛血清的生产工艺合理简单，避免了小分子量的生长因子、激素类在杀灭噬菌体、病毒过程时的辐照环节，最大程度地保留了新生牛血清原有的品质，得到的新生牛血清在保证质量前提下大大提高细胞培养效果。文档编号C07K1/00GK101497649SQ20081003335公开日2009年8月5日申请日期2008年1月31日优先权日2008年1月31日发明者褚震宇申请人:上海依科赛生物制品有限公司