专利名称：：调节fgfr3活性的多肽及其筛选方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种多肽，特别涉及一种调节FGFR3(成纤维细胞生长因子受体3)活性的多肽，还涉及该多肽的筛选方法和应用。
背景技术：
：FGFR(成纤维细胞生长因子受体)是一类具有自身磷酸化活性的跨膜酪氨酸激酶受体，与其相应配体FGF(成纤维细胞生长因子)结合，在组织器官发育及损伤修复过程中发挥重要作用。目前已发现4种FGFR,即FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4。其中，FGFR3介导软骨内骨化的负性调节分子，在骨格发育中具有重要作用。既往研究显示，FGFR3功能获得型基因突变导致骨骺生长板中软骨细胞的增殖和分化受到抑制，引起多种骨骼发育缺陷性遗传疾病，如软骨发育不全、季肋发育不全和致死性骨发育不全等；而FGFR3功能缺失型基因突变导致骨骺生长板闭合延迟、肥大软骨区增宽和长骨过度生长等。近年来研究发现，FGFR3在骨性关节炎、骨质疏松、骨折等骨骼疾病的发生、发展中也具有重要作用，促进FGFR3活性可以防治骨性关节炎、骨质疏松和骨折等骨骼疾病。目前虽已发现23种FGF，但至今未见仅与FGFR3特异性结合的FGF。因多肽具有分子量小、空间结构简单、免疫原性低等优点，故开发能与FGFR3特异性结合并调节其活性的多肽有着良好的应用前景，有望开发成为防治FGFR3功能相关性疾病的药物。
发明内容有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种调节FGFR3活性的多肽；目的之二在于提供所述调节FGFR3活性的多肽的筛选方法；目的之三在于提供所述调节FGFR3活性的多肽的应用。为达到上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种调节FGFR3活性的多肽，由Val-Thr-Ser隱Pro-Thr-Thr-Leu-Pro-Gln-Leu國Met-Ser(SEQIDNo.2)所示的氨基酸序列组成。在本发明的第二方面，提供了所述调节FGFR3活性的多肽的筛选方法，包括以下步骤a、将噬菌体12肽库与包被有FGFR3的酶标板共孵育，用TBST洗去非特异性结合的噬菌体，再用甘氨酸-盐酸緩冲液洗脱特异性结合的噬菌体，用Tris-HCl緩冲液中和噬菌体洗脱液；在宿主菌ER2738中扩增特异性结合的噬菌体，作为下一轮淘选的投入噬菌体；重复进行三轮淘选，将第三轮淘选出的噬菌体进行DNA测序，并推导出噬菌体上展示的外源多肽的氨基酸序列；b、根据所得外源多肽的氨基酸序列，人工合成多肽；c、验证多肽与FGFR3的结合作用，检测多肽对FGFR3活性的调节作用。进一步，所述步骤a的具体方法为用浓度为20jig/mL的FGFR3溶液包被酶标板，温度4。C包被过夜，弃去包被液，加入浓度为5mg/mL的BSA溶液，温度37。C封闭1小时，弃去封闭液，用TBST充分洗涤，加入2xlO"pfo的噬菌体12肽库，室温下震荡孵育l小时，弃去非特异性结合的噬菌体，用TBST充分洗涤，再加入浓度为0.2mol/L、pH为2.2的甘氨酸-盐酸緩冲液，室温下震荡洗脱特异性结合的噬菌体，用浓度为lmol/L、pH为9.1的Tris-HCl緩冲液中和噬菌体洗脱液，测定滴度；将ER2738菌接种至LB培养基中，温度37。C震荡培养至对数中期，加入Tris-HCl緩冲液中和后的噬菌体洗脱液，温度37。C震荡培养4.5小时，温度4。C离心，取含有噬菌体的上清液，力口入PEG/NaCl，温度4。C静置过夜沉淀噬菌体，温度4。C离心，弃去上清液，用TBS緩冲液重悬噬菌体沉淀，再离心，取上清液，加入PEG/NaCl，冰浴沉淀噬菌体90分钟，温度4。C离心，弃去上清液，用含有浓度为0.2g/L的叠氮钠的TBS缓冲液重悬噬菌体沉淀，再离心，收集含有噬菌体的上清液，测定滴度，作为下一轮淘选的投入噬菌体；重复进行三轮淘选，其中，第一轮淘选时TBST中Tween-20的浓度为lmL/L，第二轮和第三4仑淘选时TBST中Tween-20的浓度为5mL/L;将第三4仑淘选出的噬菌体进行DNA测序，并推导出噬菌体上展示的外源多肽的氨基酸序列。在本发明的第三方面，提供了所述调节FGFR3活性的多肽在制备防治FGFR3功能相关性疾病的药物中的应用。本发明的有益效果在于本发明多肽能与FGFR3特异性结合并调节其活性，且具有分子量小、制备筒单、质量可控、免疫原性低等优点，可以用于制备防治FGFR3功能相关性疾病的药物，预防或治疗FGFR3功能相关性疾病如侏儒、骨性关节炎、骨质疏松和骨折等，有着良好的潜在应用价值。为了使本发明的目的、忮术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中:图1显示Westernblot法检测多肽Pl处理ATDC5细胞0.5、1.5、2.5小时后ERK磷酸化水平的变化；图2显示Westernblot法检测多肽P2处理ATDC5细胞0.5、1.5、2.5小时后ERK磷酸化水平的变化；图3显示Westernblot法4全测多肽PI处理ATDC5细胞0.5、1.5、2.5小时后P38磷酸化水平的变化；图4显示Westernblot法检测多肽P2处理ATDC5细胞0.5、1.5、2.5小时后P38磷酸化水平的变化；图5显示多肽PI和P2处理ITS诱导分化的ATDC5细胞7天后细胞中COL2A1基因的转录表达水平；图6显示多肽PI和P2处理ITS诱导分化的ATDC5细胞7天后细胞中COL10A1基因的转录表达水平。具体实施例方式本发明采用噬菌体展示技术筛选调节FGFR3活性的多肽。噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的基因序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白或多肽随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。表达于噬菌体表面的某些外源蛋白或多肽能与靶分子特异性结合。将靶分子包被于固相载体后进行噬菌体展示肽库的篩选，就可将能与靶分子特异性结合的噬菌体从众多的噬菌体中分离出来，而外源蛋白或多肽的氨基酸序列可以通过对噬菌体的DNA测序而获得。噬菌体展示肽库的筛选是一个亲和纯化的生物淘选(biopanning)过程。其具体过程是将噬菌体肽库与靶分子相互作用一段时间后，洗涤除去非特异结合的噬菌体，再将特异性结合的噬菌体洗脱下来进行扩增，然后投入下一轮淘选，重复34轮淘选，即可获得与耙分子特异性结合的噬菌体。下面将参照附图，对优选实施例进行详细的描述。优选实施例中使用的FGFR3购自美国sigma公司，噬菌体12肽库筛选试剂盒(包括ER2738菌种)购自美国NewEnglandLab公司。一、从噬菌体12肽库中筛选能与FGFR3特异性结合的多肽1、噬菌体12狀库的生物淘选用浓度为20fig/mL的FGFR3溶液(以浓度为0.1mol/L、pH为8.6的碳酸氩钠溶液为溶剂)150^L包被％孔灭菌聚苯乙烯酶标板，温度4X:包被过夜，弃去包被液，满孔加入浓度为5mg/mL的BSA溶液(以浓度为0.1mol/L、pH为8.6的碳酸氢钠溶液为溶剂)，温度37。C封闭1小时，弃去封闭液，用TBST(即含有Tween-20的TBS緩冲液，第一轮淘选时Tween-20的浓度为lmL/L,第二轮和第三轮淘选时Tween-20的浓度提高至5mL/L)洗涤6次，加入2x10"pfo的噬菌体(第一轮淘选时加入噬菌体12肽库原库10pL与TBSTlmL的混合液，第二轮和第三轮淘选时加入前一轮扩增的特异性结合的噬菌体)，室温下温和震荡孵育l小时，弃去非特异性结合的噬菌体，用TBST洗涤10次，加入浓度为0.2mol/L、pH为2.2的甘氨酸-盐酸緩冲液200^,室温下温和震荡8分钟洗脱特异性结合的噬菌体，吸取洗脱液，加入浓度为lmol/L、pH为9.1的Tris-HCl緩冲液150ijL中和，测定滴度；将ER2738菌接种至LB培养基20mL中，温度37。C剧烈震荡培养至对数中期(OD600值约0.5)，加入用Tris-HCl缓沖液中和后的噬菌体洗脱液100nL,温度37。C剧烈震荡培养4.5小时，温度4。C、转速10000rpm离心10分钟，取含有噬菌体的上清液，再离心5分钟，取约80°/。的上层清液(下层含沉淀的清液弃去)，加入相当于上清液1/6体积的PEG/NaCl(由浓度为200g/L的PEG8000和浓度为2.5mol/L的NaCl组成)，温度4'C静置过夜沉淀噬菌体，温度4。C、转速10000rpm离心15分钟，弃去上清液，用TBS緩冲液lmL重悬噬菌体沉淀，再离心5分钟，取含有噬菌体的上清液，加入相当于上清液1/6体积的PEG/NaCl，水浴沉淀噬菌体卯分钟，温度4"C、转速10000rpm离心10分钟，弃去上清液，用含有浓度为0.2g/L的叠氮钠的TBS缓冲液200^L重悬噬菌体沉淀，再离心l分钟，收集含有噬菌体的上清液，测定滴度，作为下一轮淘选的投入噬菌体；重复上述步骤共进行三轮淘选，富集能与FGFR3特异性结合的噬菌体，第三轮淘选出的噬菌体不再扩增。各轮淘选的噬菌体回收率见表1,由表1可知，经过三轮生物淘选后，特异性结合的噬菌体的得率逐渐增大，表明所淘选的噬菌体得到了选择性的富集。表l、各轮淘选过程中噬菌体的回收率轮次投入噬菌体(TU)回收噬菌体(TU)回收率12x10118.87x1042.24xl(T722.06x10"9.60x1064.8xl(T532.1x10119.30x1084.4x1CT32、噬菌体的DNA提取和测序将ER2738菌接种至LB培养基中，温度37。C剧烈震荡培养至对数中期，分取lmL置培养管中，加入从第三轮淘选出的噬菌体的滴度测定平板上随机挑取的噬菌体单克隆，温度37。C剧烈震荡培养4.5小时，离心，取含有噬菌体的上清液500nL，加入PEG/NaCl200jiL，室温沉淀噬菌体10分钟，离心10分钟，弃去上清液，短暂离心，小心吸出残余上清液，加入石典化物緩沖液100pL重悬噬菌体沉淀，再加入乙醇250pL，室温孵育10分钟^吏噬菌体DNA沉淀而大多数噬菌体蛋白保留在溶液中，离心10分钟，弃去上清液，DNA沉淀用浓度为700mL/L的乙醇洗涤，短暂真空干燥后重悬于TE緩沖液30jiL中，取该溶液5pL，委托上海生工生物工程技术有限公司进行测序。本实施例随机挑取45个噬菌体单克隆进行DNA序列测定，根据所测得的DNA序列推导出噬菌体上展示的外源多肽的氨基酸序列；结果发现，23个噬菌体单克隆所展示的多肽具有同样的氨基酸序列Pl:Val-Ser-Pro-Pro-Leu-Thr-Leu-Gly-Gln-Leu-Leu-Ser(SEQIDNo.l);其余22个噬菌体单克隆所展示的多肽序列与Pl之间也存在极高的同源性，其中包括P2:Val-Thr-Ser-Pro-Thr-Thr-Leu-Pro陽Gln-Leu-Met-Ser(SEQIDNo,2)。二、人工合成多肽根据所得外源多肽的氨基酸序列，委托上海华大天源生物技术公司采用标准Fmoc方案固相合成多肽，所得多肽纯度均高于95%，置温度-70。C保存。三、ELISA法验证多肽与FGFR3的结合情况实验目的验证筛选出的多肽与FGFR3之间的结合作用以及结合强度。实验方法采用间接ELISA法，在96孔培养板中，每孔加入浓度为lmmoL^L的多肽Pl或P2溶液20inL和包被液(取碳酸钠0,3g、碳酸氢钠0.58g和叠氮钠0.04g,加水溶解，调节pH至9.6，加水稀释至200mL,即得)80^iL，温度4。C包被过夜，弃去溶液，满孔加入浓度为50g/L的小牛血清溶液(以pH为7.4的PBS为溶剂)，温度37。C封闭40分钟，弃去溶液，用PBST(含有浓度为0.5mL/L的吐温-20的PBS，70pL,温度37。C孵育1小时，用PBST洗涤3次，加入按l:500稀释的鼠抗FGFR3抗体(美国Sigma公司，以质量百分浓度为1。/。的BSA溶液为稀释溶剂)lOO^iL,温度37。C孵育1小时，弃去溶液，用PBST洗涤5次，加入辣才艮过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG(中杉金桥生物试剂公司)100|iL,温度37。C孵育30分钟，弃去溶液，用PBST洗涤5次，加入四曱基联苯二胺-过氧化氢尿素;容液100ixL，温度37。C避光显色10分钟，加入浓度为2mol/L的硫酸溶液终止反应，在波长450nm处测定OD450值，结果以3个复孔的均值表示；同时设置阴性对照组(加入多肽P1包被酶标板，但后续步骤中所有试剂均用pH为7.4的PBS代替)、P1空白对照组和P2空白对照组(不加入多肽P1或P2包被酶标板，其余操作不变)。实验结果见表2,多肽P1和P2都与FGFR3有较高的结合率。表2、ELISA验证多肽与FGFR3的结合(义±"^D)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>四、检测多肽对FGFR3活性的调节作用1、Westernblot法检测多肽对FGFR3主要下游信号通路MAPK的激活情况目前研究已经明确，促分裂原活化蛋白激酶信号通路MAPK是FGFR3下游最主要的信号通路之一，MAPK的激活情况直接或间接影响细胞的增殖、分化、转化及凋亡等。在哺乳类细胞，目前已发现存在着下述三条并行的MAPK信号通路，分别为ERK信号通路、p38MAPK通路和JNK/SAPK通路。同一刺激因素可同时激活多条MAPK通路，并行的MAPK通路之间通过复杂的机制既可相互区别，又能相互调节。实验目的检测筛选出的多肽对FGFR3主要下游信号通路MAPK通路中信号分子(ERK和P38)的激活情况，以明确多肽调节细胞功能的机制。实验方法在12孔培养板中，每孔接种1.2x105个前软骨细胞ATDC5，加入含有浓度为50g/L的胎牛血清的DMEM/F12培养基，在温度为37°C、C02气体浓度为50mL/L的条件下培养24小时，待细胞贴壁后，弃去培养基，用无血清DMEM/F12培养基沖洗细胞2次，再加入无血清DMEM/F12培养基lmL,培养24小时，弃去培养基，加入含有浓度为50g/L的胎牛血清的DMEM/F12培养基和多肽Pl或P2溶液，使多肽Pl或P2的终浓度为2nmol/L,同时设置空白对照组(不加入多肽P1或P2)，分别处理0.5、1.5、2.5小时，收集细胞，用细胞裂解液吹打裂解细胞，于冰上收集细胞裂解液，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度；已测浓度的蛋白样品加入等体积2x上样緩冲液，煮沸5分钟，室温冷却后进行SDS-PAGE(浓缩胶浓度为50g/L,分离胶浓度为90g/L,电泳参数为恒压80伏20分钟、恒压120伏80分钟)，电泳结束后，将蛋白电转印(恒流300毫安60分钟)至聚偏二氟乙烯膜上，用浓度为50g/L的脱脂奶粉溶液(以TBST为溶剂)室温封闭1小时，再分别加入ERK、P-ERK(磷酸化ERK)和p-actin(内参)的一抗或者P38、P-P38(磷酸化P38)和卩-actin(内参)的一抗，温度4。C孵育过夜，用TBST洗膜5次，再加入辣根过氧化物酶标记二抗，温度37。C孵育1小时，用TBST洗膜5次，显色，曝光，定影，检测ERK或P38^畴酸化水平的变化。实验结果见图1~4，多肽P1对MAPK信号通路中ERK分子的磷酸化水平有促进作用，而对P38分子的磷酸化水平有抑制作用；多肽P2对ERK分子的磷酸化水平也有促进作用，而对P38分子的磷酸化水平有先抑制后促进作用；提示多肽Pl和P2可能是通过调节ERK分子的活性来调节细胞的生理过程。2、MTT法检测多肽对FGFR3表达细胞增殖的影响情况实验目的检测FGFR3表达细胞经不同浓度多肽处理后的细胞增殖情况。实验方法在96孔培养板中，每孔接种8000个前软骨细胞ATDC5或间充质细胞C3H10T1/2，用含有浓度为50g/L的胎牛血清的DMEM/F12培养基在温度为37。C、C02气体浓度为50mL/L的条件下培养24小时，待细胞贴壁后，弃去培养基，用无血清DMEM/F12培养基沖洗细胞2次，加入无血清DMEM/F12培养基lmL，培养24小时，弃去培养基，加入含有浓度为50g/L的胎牛血清的DMEM/F12培养基和多肽Pl或P2溶液，使多肽Pl或P2的终浓度分别为1、5、10、50、100|imol/L,同时设置空白对照组(不加入多肽Pl或P2)，处理24小时，加入细胞增殖检测试剂20pL,避光孵育26小时，待孔中液体由紫色变为粉色，在570nrn波长处测定OD570值，结果以3个复孔的均值表示。实验结果见表3,多肽Pl在较低浓度下对ATDC3和C3H10Tl/2两种细胞的增殖均有促进作用，在较高浓度下无明显作用；多肽P2对两种细胞的增殖也有促进作用，但与多肽浓度无明显相关性。表3、MTT法检测多肽Pl和P2对细胞增殖的影响情况<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>3、荧光实时定量PCR法片企测多肽对FGFR3表达细胞分化的影响情况既往研究显示，FGFR3对软骨细胞的分化有着明确的调节作用。前软骨细胞向软骨细胞的分化经历增殖、成熟、肥大等系列过禾呈，COL2A1(II型胶原)基因是软骨细胞分化时的标志基因，而COL10A1(X型胶原)基因是肥大期软骨细胞特异性表达基因。实验目的检测筛选出的多肽对前软骨细胞诱导分化的影响情况。实验方法在6孔培养板中，每孔接种2.0x105个前软骨细胞ATDC5,用含有浓度为50g/L的胎牛血清的DMEM/F12培养基在温度为37°C、(302气体浓度为50mL/L的条件下培养24小时，待细胞贴壁后，弃去培养基，用无血清DMEM/F12培养基冲洗细胞2次，加入无血清DMEM/F12培养基lmL，培养24小时，弃去培养基，加入含有浓度为50g/L的胎牛血清的DMEM/F12培养基和多肽Pl或P2溶液，使多肽Pl或P2的终浓度为2|amol/L，再加入软骨诱导剂ITS(美国Sigma乂>司)^吏其稀释度为1:100,同时i殳置空白对照组(不加入多肽Pl或P2),处理7天；采用Trizol试剂(美国Invitragen公司)提取细胞总RNA，按照试剂说明书操作，测定RNA的浓度和纯度，电泳检测RNA降解情况；采用Takara反转录试剂盒(Takara公司)将提取的细胞总RNA反转录为cDNA,按照试剂盒说明书操作；以所得cDNA为模板进行荧光定量PCR，测定C0L2A1基因和COL10A1基因的含量，PCR引物见表4,PCR条件为首先95"预变性30秒，然后95。C变性5秒、57。C退火20秒、72°。延伸15秒，共40个循环，最后95。C变性30秒，57"C退火30秒，95。C变性30秒；采用c(t)值相对定量法，以Cyclophilin基因为内参，由MX3000P定量PCR仪软件自动给出c(t)值和目的基因相对含量。表4、PCR引物基因上游引物下游引物C0L2A15，-ctggtggagcagcaagagcaa-3，(SEQIDNo.3)5，-cagtggacagtagacggaggaaag-3,(SEQIDNo.4)COL10A15'-gcagcattacgacccaagat-3'(SEQIDNo.5)5，隱catgattgcactccctgaag-3'(SEQIDNo.6)Cyclophilin(内参)5,-cgagctctgagcactggaga-3,(SEQIDNo.7)55-tggcgtgtaaagtcaccacc-3，(SEQIDNo.8)实验结果见图5~6,ITS诱导分化的ATDC5细月包经多肽P1处理后，C0L2A1基因和COL10A1基因的含量均增加，表明多肽P1可以促进成熟软骨细胞向肥大软骨细胞的分化；而ITSi秀导分化的ATDC5细胞经多肽P2处理后，C0L2A1基因含量增加而COL10A1基因含量降低，表明多肽P2可使成熟软骨细胞向肥大软骨细胞的分化延迟。基于上述实验结果，可得出如下结论本发明的多肽P2可以与FGFR3特异性结合，并对其活性有明显的调节作用，可以作为活性成分，单独使用或与其它具有药理活性的化合物和/或提取物组成复方^f吏用，再与药学上可接受的载体按照药学领域的常规制剂方法制成各种剂型的防治FGFR3功能相关性疾病的药物，用于预防和治疗FGFR3功能相关性疾病如侏儒、骨性关节炎、骨质疏松、骨折等。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。序列表<110>中国人民解放军第三军医大学野战外科研究所<120>调节FGFR3活性的多肽及其筛选方法和应用<160〉8<210>1<211>12<212>PRT<213〉人工序列<220><223>多肽P1<400>1ValSerProProLeuThrLeuGlyGinLeuLeuSer1510<210>2<211>12<212>PRT<213>人工序列<220><223>多肽P2<400>2ValThrSerProThrThrLeuProGinLeuMetSer1510<210〉3<211>21<212>謹<213>人工序列<220><223>C0L2A1基因的PCR上游引物<锡>3ctggtggagcagcaagagcaa21<210〉4<211〉24<212〉DNA<213〉人工序列<220><223〉C0L2A1基因的PCR下游引物<400>4cagtggacagtagacggaggaaag<210〉5<211>20<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223>COL10A1基因的PCR上游引物<400〉5gcagcattacgacccaaggit<210>6<211〉20<212>腿<213>人工序列〈220〉<223>COL10A1基因的PCR下游引物<400>62420catgattgcactccctgaag20<210>7<211〉20<212>腿<213〉人工序列<220><223〉Cyclophilin基因(内参)的PCR上游引物<400〉7cgagctctgagcactggaga20<210>8<211>20<212〉DNA<213〉人工序列<220><223〉Cyclophilin基因(内参)的PCR下游引物<400>8tggcgtgtaaagtcaccacc201权利要求1、调节FGFR3活性的多肽，其特征在于由Val-Thr-Ser-Pro-Thr-Thr-Leu-Pro-Gln-Leu-Met-Ser所示的氨基酸序列组成。2、权利要求1所述的调节FGFR3活性的多肽的筛选方法，其特征在于包括以下步^_:a、将噬菌体12肽库与包被有FGFR3的酶标板共孵育，用TBST洗去非特异性结合的噬菌体，再用甘氨酸-盐酸緩冲液洗脱特异性结合的噬菌体，用Tris-HCl緩冲液中和噬菌体洗脱液；在宿主菌ER2738中扩增特异性结合的噬菌体，作为下一轮淘选的投入噬菌体；重复进行三轮淘选，将第三轮淘选出的噬菌体进行DNA测序，并推导出噬菌体上展示的外源多肽的氨基酸序列；b、根据所得外源多肽的氨基^列，人工合成多肽；c、验证多肽与FGFR3的结合作用，检测多肽对FGFR3活性的调节作用。3、根据权利要求2所述的调节FGFR3活性的多肽的筛选方法，其特征在于所述步骤a的具体方法为用浓度为20|ig/mL的FGFR3溶液包被酶标板，温度4。C包被过夜，弃去包被液，加入浓度为5mg/mL的BSA溶液，温度37。C封闭1小时，弃去封闭液，用TBST充分洗涤，加入2xl()Upfb的噬菌体12肽库，室温下震荡孵育l小时，弃去非特异性结合的噬菌体，用TBST充分洗涤，再加入浓度为0.2mol/L、pH为2.2的甘氨酸-盐酸缓冲液，室温下震荡洗脱特异性结合的噬菌体，用浓度为lmol/L、pH为9.1的Tris-HC1緩冲液中和噬菌体洗脱液，测定滴度；将ER2738菌接种至LB培养基中，温度37。C震荡培养至对数中期，加入Tris-HCI緩冲液中和后的噬菌体洗脱液，温度37。C震荡培养4.5小时，温度4。C离心，取含有噬菌体的上清液，加入PEG/NaCl，温度4。C静置过夜沉淀噬菌体，温度4。C离心，弃去上清液，用TBS緩冲液重悬噬菌体沉淀，再离心，取上清液，加入PEG/NaCl，水浴沉淀噬菌体90分钟，温度4。C离心，弃去上清液，用含有浓度为0.2g/L的叠氮钠的TBS緩冲液重悬噬菌体沉淀，再离心，收集含有噬菌体的上清液，测定滴度，作为下一轮淘选的投入噬菌体；重复进行三轮淘选，其中，第一轮淘选时TBST中Tween-20的浓度为lmL/L，第二轮和第三轮淘选时TBST中Tween-20的浓度为5mL/L;将第三轮淘选出的噬菌体进行DNA测序，并推导出噬菌体上展示的外源多肽的氨基酸序列。4、权利要求1所述的调节FGFR3活性的多肽在制备防治FGFR3功能相关性疾病的药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种调节FGFR3活性的多肽及其筛选方法和应用，该多肽由Val-Thr-Ser-Pro-Thr-Thr-Leu-Pro-Gln-Leu-Met-Ser所示的氨基酸序列组成；其筛选方法是将噬菌体12肽库与包被有FGFR3的酶标板反复共孵育，淘选能与FGFR3特异性结合的噬菌体，体外扩增噬菌体进行DNA测序，并推导出噬菌体上展示的外源多肽的氨基酸序列；人工合成多肽；验证多肽与FGFR3的结合作用，检测多肽对FGFR3活性的调节作用；该多肽可以用于制备防治FGFR3功能相关性疾病的药物。文档编号C07K7/08GK101585866SQ20091010423公开日2009年11月25日申请日期2009年7月2日优先权日2009年7月2日发明者瑛余,戚华兵,杜晓兰,京杨,楠苏,玲赵,旻金,林陈,炜黄申请人:中国人民解放军第三军医大学野战外科研究所